于兆海，于悅

作者單位：1青島市黃島區(qū)人民醫(yī)院藥劑科，山東 青島 266400；2山東第一醫(yī)科大學(xué)公共管理學(xué)院公共事業(yè)管理專業(yè)，山東 泰安 271000

心肌損傷是導(dǎo)致多種心血管疾病的重要原因，也是膿毒癥［1］和糖尿?。?］常見的并發(fā)癥。因此，保護(hù)心肌細(xì)胞免受損傷對(duì)相關(guān)疾病的防治具有重要意義。革蘭陰性菌細(xì)胞壁外膜上的脂多糖（LPS）是引起細(xì)胞感染的主要成分，LPS可以增加心肌細(xì)胞NADH氧化酶（NADH oxidase，NOX）的表達(dá)及過氧化物的增殖，造成活性氧的增加，進(jìn)而造成心肌細(xì)胞損傷或者直接導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡［3］。粗糠柴毒素（Rottlerin）是從傳統(tǒng)藥物粗糠柴中提取的小分子物質(zhì)［4］，研究報(bào)道其有促凋亡和抑制凋亡的雙重作用［5］。Rottlerin可抑制活性氧產(chǎn)生，清除氧自由基［6］。研究表明，Rottlerin可通過抑制蛋白激酶Cδ（PKC-δ）的活性減少腎小管上皮細(xì)胞凋亡［7］。Rot?tlerin可抑制碘帕醇誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞凋亡［8］。miRNAs是一類長度約22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA，多種miRNAs在心肌缺血缺氧時(shí)顯著差異表達(dá)，對(duì)心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展起著重要作用，參與心肌損傷等病理生理過程［9］。選擇性上調(diào)或下調(diào)特定miRNA表達(dá)可作為未來治療心肌I/RI的新工具和診斷心血管疾病的敏感生物標(biāo)志物［10］。自2018年9月至2019年4月研究了粗糠柴毒素對(duì)LPS所致心肌損傷的影響及其可能的作用機(jī)制，為尿毒癥、心功能衰竭等疾病的臨床治療提供新的靶向藥物和研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料HCM、AC16心肌細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；粗糠柴毒素購于Abcam公司；Lipo?fectamineTM2S購于Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購于美國Gibico公司；熒光定量試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒、Trizol均購于Solarbio（北京）公司；RIPA蛋白裂解液、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin VFITC）和碘化丙啶（PI）試劑盒均購于碧云天（上海）生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 在37℃、5%二氧化碳、飽和濕度條件下，HCM、AC16細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至60%~70%左右時(shí)，使用胰蛋白酶消化并傳代。收集對(duì)數(shù)生長期的HCM、AC16細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 藥物處理與分組 參考李曉寧等［8］和劉丹等［11］所用的粗糠柴毒素和LPS濃度；用終濃度為10 mg/L的LPS刺激心肌細(xì)胞6 h，分別加入終濃度為0.5μmol/L、1.0μmol/L、1.5μmol/L、2.0μmol/L粗糠柴毒素再處理12 h后分別記為LPS+0.5μmol/L Rot?tlerin組、LPS+1.0μmol/L Rottlerin組、LPS+1.5μmol/L Rottlerin組、LPS+2.0μmol/L Rottlerin組，以單純10 mg/L LPS處理的為LPS組，以未經(jīng)粗糠柴毒素和LPS處理的為對(duì)照組。采用LipofectamineTM2 000轉(zhuǎn)染試劑盒在未經(jīng)處理的HCM細(xì)胞中依次轉(zhuǎn)染模擬物陰性對(duì)照（miR-NC），miR-204-5p模擬物（miR-204-5p）、抑制劑陰性對(duì)照（anti-miR-NC）、miR-204-5p抑制劑（anti-miR-204-5p），標(biāo)記為miR-NC組，miR-204-5p組、anti-miR-NC組、anti-miR-204-5p組。在10 mg/L LPS處理的HCM細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-NC，miR-204-5p，標(biāo)記為LPS+miR-NC組，LPS+miR-204-5p組。將anti-miR-NC、anti-miR-204-5p、過表達(dá)空載體（pcDNA3.1）、高遷移率族蛋白B1（HMGB1）過表達(dá)載體（pcDNA3.1-HMGB1）轉(zhuǎn)染至2.0μmol/L粗糠柴毒素和10 mg/L LPS處理HCM細(xì)胞中，記為LPS+Rottlerin+anti-miR-NC組、LPS+Rottlerin+antimiR-204-5p組、LPS+Rottlerin+pcDNA3.1組、LPS+Rottlerin+pcDNA3.1-HMGB1組。

1.2.3 MTT法檢測(cè)HCM、AC16細(xì)胞增殖 各組HCM、AC16細(xì)胞分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h時(shí)，加入5 g/L MTT溶液20μL，4 h后，棄去多余培養(yǎng)基，添加二甲基亞砜（DMSO）150μL，振蕩10 min，然后用酶標(biāo)儀在490 nm處檢測(cè)光密度（OD）值。抑制率（%）=（1-OD實(shí)驗(yàn)組/OD空白對(duì)照組）×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HCM、AC16細(xì)胞凋亡 離心收集各組經(jīng)胰酶（不含乙二胺四乙酸）消化的HCM、AC16細(xì)胞，PBS漂洗5 min×2，接著加入結(jié)合緩沖液重懸HCM、AC16細(xì)胞。依據(jù)Annexin V-FITC和PI試劑盒說明書對(duì)HCM、AC16細(xì)胞進(jìn)行避光孵育。最后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)488 nm（激發(fā)波長）和530 nm（發(fā)射波長）處的熒光強(qiáng)度。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）測(cè)定miR-204-5p和HMGB1 mRNA水平 用Trizol試劑提取HCM、AC16細(xì)胞總RNA，測(cè)得RNA純度和濃度后，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA（cDNA）。按照熒光定量試劑盒的制造商說明制備PCR反應(yīng)體系。在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。循環(huán)條件（40個(gè)）為95℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，60℃延長5 min。以β肌動(dòng)蛋白（β-actin）為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)HMGB1及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)RIPA裂解液裂解各組HCM、AC16細(xì)胞，在4℃離心機(jī)中離心15 min（12 000g），收集蛋白上清液，并用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜下用5%脫脂奶粉封閉1 h。分別加入HMGB1、B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）一抗（1∶1 000），4℃孵育過夜；加入相應(yīng)的1∶2 000稀釋的二抗，室溫下反應(yīng)2 h，后遮光顯影、定影后，用Quantity One凝膠分析軟件分析膠片，以目的條帶和β-actin條帶的光密度比值作為蛋白表達(dá)水平。

1.2.7 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-204-5p與HMGB1的靶向關(guān)系TargetScan數(shù)據(jù)庫顯示HMGB1 3′非翻譯區(qū)（3′UTR）和miR-204-5p有互補(bǔ)的核苷酸序列。構(gòu)建HMGB1 3′UTR野生型和突變型基因靶點(diǎn)的熒光素酶表達(dá)載體（WT-HMGB1和MUT-HMGB1），將HCM細(xì)胞以5×104個(gè)/孔的濃度接種至24孔板，用LipofectamineTM2 000將miR-NC和miR-204-5p分別轉(zhuǎn)染至WT-HMGB1和MUTHMGB1組細(xì)胞。使用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)儀進(jìn)行酶活測(cè)定。以熒光素酶和Renilla活性的比值作為最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.00軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以xˉ±s表示，兩組比較行成組t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Rottlerin對(duì)miR-204-5p、HMGB1的表達(dá)及對(duì)LPS作用的心肌細(xì)胞HCM、AC16增殖凋亡的影響 相較于對(duì)照組，LPS組心肌細(xì)胞HCM、AC16的抑制率顯著升高，miR-204-5p的表達(dá)水平顯著降低，Bcl-2表達(dá)顯著下降，Bax、HMGB1表達(dá)顯著增高，凋亡率顯著升高（P<0.05）；相較于LPS組，不同濃度Rottlerin處理心肌細(xì)胞HCM、AC16細(xì)胞后，抑制率顯著降低，miR-204-5p的表達(dá)水平顯著增高，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著升高，Bax、HMGB1蛋白的表達(dá)水平顯著降低，凋亡率顯著降低（P<0.05），呈濃度依賴型。見表1，2；圖1。選用對(duì)Rottlerin較為敏感的HCM細(xì)胞做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 粗糠柴毒素（Rottlerin）對(duì)各組心肌細(xì)胞HCM中HMGB1和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表1 Rottlerin對(duì)LPS作用的各組心肌細(xì)胞HCM、AC16增殖的影響/（%，xˉ±s）

2.2 過表達(dá)miR-204-5p對(duì)LPS處理的HCM心肌細(xì)胞增殖、凋亡的影響LPS+miR-NC組與對(duì)照組相比，HCM細(xì)胞中miR-204-5p和Bcl-2表達(dá)下降，Bax表達(dá)升高，24、48、72 h的抑制率和凋亡率升高（P<0.05）；LPS+miR-204-5p組與LPS+miR-NC組相比，HCM細(xì)胞中miR-204-5p表達(dá)升高，Bcl-2表達(dá)升高，Bax表達(dá)降低，24、48、72 h的抑制率和凋亡率降低（P<0.05）。見表3，圖2。

表3 過表達(dá)miR-204-5p對(duì)LPS作用的各組細(xì)胞HCM增殖、凋亡的影響/±s

表3 過表達(dá)miR-204-5p對(duì)LPS作用的各組細(xì)胞HCM增殖、凋亡的影響/±s

注：miR-204-5p為微小RNA-204-5p，LPS為脂多糖，Bcl-2為B淋巴細(xì)胞瘤-2，Bax為Bcl-2相關(guān)X蛋白。①與對(duì)照組比較，P<0.05。②與LPS+miR-NC組比較，P<0.05。

組別對(duì)照LPS+miR-NC LPS+miR-204-5p F值P值重復(fù)次數(shù)666 miR-204-5p 1.00±0.07 0.42±0.03①0.86±0.07②154.09<0.001 Bcl-2蛋白0.87±0.03 0.22±0.02①0.71±0.05②543.32<0.001 Bax蛋白0.31±0.01 0.96±0.06①0.43±0.02②525.22<0.001抑制率/%24 h 1.02±0.02 74.06±5.07①52.21±4.08②597.33<0.001 48 h 2.41±0.02 80.75±6.06①59.98±5.13②470.31<0.001 72 h 4.52±0.06 88.48±8.04①64.57±5.67②347.97<0.001凋亡率/%6.34±0.11 27.26±2.25①15.76±1.32②289.85<0.001

圖2 過表達(dá)微小RNA-204-5p對(duì)脂多糖（LPS）作用的各組心肌細(xì)胞HCM增殖、凋亡的影響

2.3 抑制miR-204-5p表達(dá)能逆轉(zhuǎn)Rottlerin對(duì)LPS作用的心肌細(xì)胞HCM增殖、凋亡的作用qRTPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與LPS組相比，LPS+Rottlerin組心肌細(xì)胞HCM中miR-204-5p和Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著升高，Bax蛋白的表達(dá)水平顯著降低，24、48、72 h的抑制率和凋亡率顯著降低（P<0.05）；與LPS+Rottlerin+anti-miR-NC組相比，LPS+Rottlerin+anti-miR-204-5p組 心 肌 細(xì) 胞HCM中miR-204-5p和Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著降低，Bax蛋白的表達(dá)水平顯著增高，24、48、72 h的抑制率和凋亡率顯著升高（P<0.05）。見表4，圖3。

表4 抑制miR-204-5p表達(dá)能逆轉(zhuǎn)Rottlerin對(duì)各組心肌細(xì)胞增殖、凋亡的作用/±s

表4 抑制miR-204-5p表達(dá)能逆轉(zhuǎn)Rottlerin對(duì)各組心肌細(xì)胞增殖、凋亡的作用/±s

注：miR-204-5p為微小RNA-204-5p，Rottlerin為粗糠柴毒素，LPS為脂多糖，Bcl-2為B淋巴細(xì)胞瘤-2，Bax為Bcl-2相關(guān)X蛋白。①與LPS組比較，P<0.05。②與LPS+Rottlerin+anti-miR-NC組比較，P<0.05。

組別LPS LPS+Rottlerin LPS+Rottlerin+anti-miR-NC LPS+Rottlerin+anti-miR-204-5p F值P值重復(fù)次數(shù)66 6 6 miR-204-5p 0.43±0.03 0.73±0.06①0.71±0.05 0.59±0.05②48.08<0.001 Bcl-2蛋白0.25±0.02 0.69±0.05①0.72±0.06 0.53±0.01②168.33<0.001 Bax蛋白0.99±0.06 0.24±0.02①0.26±0.02 0.77±0.06②421.30<0.001抑制率/%24 h 74.06±5.07 54.21±4.08①55.33±4.25 66.07±5.19②24.41<0.001 48 h 81.35±6.06 59.98±5.13①60.24±5.37 71.19±6.04②19.50<0.001 72 h 89.94±8.14 64.57±5.67①66.81±4.02 78.67±6.12②21.71<0.001凋亡率/%26.26±2.13 11.06±1.09①12.16±1.12 18.37±1.54②125.19<0.001

圖3 抑制微小RNA-204-5p表達(dá)能逆轉(zhuǎn)粗糠柴毒素（Rottlerin）對(duì)各組心肌細(xì)胞增殖、凋亡的作用

表2 Rottlerin對(duì)LPS作用的各組心肌細(xì)胞HCM凋亡及miR-204-5p、HMGB1表達(dá)的影響/±s

表2 Rottlerin對(duì)LPS作用的各組心肌細(xì)胞HCM凋亡及miR-204-5p、HMGB1表達(dá)的影響/±s

注：Rottlerin為粗糠柴毒素，LPS為脂多糖，miR-204-5p為微小RNA-204-5p，HMGB1為高遷移率族蛋白B1，Bcl-2為B淋巴細(xì)胞瘤-2，Bax為Bcl-2相關(guān)X蛋白。①與對(duì)照組比較，P<0.05。②與LPS組比較，P<0.05。③與LPS+Rottlerin 0.5μmol/L組比較，P<0.05。④與LPS+Rottlerin 1.0μmol/L組比較，P<0.05。⑤與LPS+Rottlerin 1.5μmol/L組比較，P<0.05。

組別對(duì)照LPS LPS+Rottlerin 0.5μmol/L LPS+Rottlerin 1.0μmol/L LPS+Rottlerin 1.5μmol/L LPS+Rottlerin 2.0μmol/L F值P值重復(fù)次數(shù)6 6 6 6 6 6 miR-204-5p 1.99±0.08 0.30±0.03①0.46±0.04①②0.54±0.05①②③0.76±0.04①②③④0.88±0.07①②③④⑤745.94<0.001 HMGB1蛋白0.26±0.02 1.04±0.10①0.93±0.09①②0.80±0.08①②③0.62±0.06①②③④0.53±0.05①②③④⑤94.61<0.001 Bcl-2蛋白0.94±0.08 0.16±0.03①0.31±0.03①②0.56±0.04①②③0.69±0.04①②③④0.86±0.04①②③④⑤260.05<0.001 Bax蛋白0.33±0.02 1.06±0.08①0.97±0.06①②0.89±0.07①②③0.66±0.04①②③④0.54±0.05①②③④⑤145.59<0.001凋亡率/%5.61±0.05 27.79±2.23①22.61±2.14①②20.06±1.94①②③11.71±1.01①②③④9.16±1.00①②③④⑤174.70<0.001

2.4 miR-204-5p靶向HMGB1TargetScan預(yù)測(cè)結(jié)果顯示HMGB1和miR-204-5p存在相互結(jié)合的核苷酸位點(diǎn)。轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-HMGB1后，miR-204-5p組熒光素酶活性（0.33±0.02）明顯低于miR-NC組（1.01±0.05）（t=30.93，P<0.001）；而轉(zhuǎn)染MUT-HMGB1后，miR-204-5p組熒光素酶活性（1.08±0.05）與miR-NC組（1.06±0.04）比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.77，P=0.462）。miR-204-5p組HMGB1 mRNA和蛋白表達(dá)明顯比miR-NC組低（P<0.05），anti-miR-204-5p組HMGB1 mRNA和蛋白表達(dá)明顯比anti-miR-NC組高（P<0.05），見表5。

表5 miR-204-5p對(duì)HMGB1表達(dá)的影響/±s

表5 miR-204-5p對(duì)HMGB1表達(dá)的影響/±s

注：miR-204-5p為微小RNA-204-5p，HMGB1為高遷移率族蛋白B1。①與miR-NC組比較，P<0.05。②與anti-miR-NC組比較，P<0.05。

組別miR-NC miR-204-5p anti-miR-NC anti-miR-204-5p F值P值重復(fù)次數(shù)6666 HMGB1 mRNA 0.38±0.02 0.10±0.01①0.43±0.05 1.22±0.11②367.40<0.001 HMGB1蛋白0.41±0.03 0.09±0.01①0.44±0.03 1.18±0.11②364.91<0.001

2.5 過表達(dá)HMGB1能逆轉(zhuǎn)Rottlerin對(duì)LPS作用的心肌細(xì)胞HCM增殖、凋亡的作用與LPS組相比，LPS+Rottlerin組心肌細(xì)胞HCM中Bcl-2表達(dá)升高，Bax、HMGB1表達(dá)降低，24、48、72 h的抑制率和凋亡率降低（P<0.05）；與LPS+Rottlerin+pcDNA3.1組相比，LPS+Rottlerin+pcDNA3.1-HMGB1組心肌細(xì)胞HCM中Bcl-2表達(dá)降低，Bax、HMGB1表達(dá)升高，24、48、72 h的抑制率和凋亡率升高（P<0.05）。見表6。

表6 過表達(dá)HMGB1能逆轉(zhuǎn)Rottlerin對(duì)心肌細(xì)胞HCM增殖、凋亡的作用/±s

表6 過表達(dá)HMGB1能逆轉(zhuǎn)Rottlerin對(duì)心肌細(xì)胞HCM增殖、凋亡的作用/±s

注：HMGB1為高遷移率族蛋白B1，Rottlerin為粗糠柴毒素，LPS為脂多糖，Bcl-2為B淋巴細(xì)胞瘤-2，Bax為Bcl-2相關(guān)X蛋白。①與LPS組比較，P<0.05。②LPS+Rottlerin+pcDNA3.1組比較，P<0.05。

組別LPS LPS+Rottlerin LPS+Rottlerin+pcDNA3.1 LPS+Rottlerin+pcDNA3.1-HMGB1 F值P值重復(fù)次數(shù)6666 HMGB1蛋白1.45±0.11 0.76±0.07①0.77±0.07 1.08±0.09②84.93<0.001 Bcl-2蛋白0.24±0.02 0.57±0.04①0.59±0.05 0.41±0.04②104.49<0.001 Bax蛋白0.89±0.06 0.24±0.02①0.22±0.02 0.64±0.04②423.57<0.001抑制率/%24 h 75.06±5.07 54.21±4.08①53.33±4.06 68.77±6.02②29.40<0.001 48 h 80.95±6.16 59.98±5.13①57.24±4.87 72.19±6.74②21.87<0.001 72 h 91.14±8.36 64.57±5.67①62.81±4.62 81.67±7.12②25.84<0.001凋亡率/%27.26±2.33 12.06±1.09①11.46±1.12 15.37±1.24②137.88<0.001

3 討論

LPS進(jìn)入血液中會(huì)引起急性全身免疫系統(tǒng)反應(yīng)，其中急性心肌炎癥會(huì)使心臟收縮力下降、心率加快、射血分?jǐn)?shù)減少，導(dǎo)致心功能不全；嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致心功能衰竭甚至死亡，對(duì)人類生命健康危害極大［12］。研究表明中藥具有減少炎性細(xì)胞浸潤、抑制心肌細(xì)胞凋亡、清除自由基、減輕鈣超載、抗脂質(zhì)過氧化等作用［13］。粗糠柴毒素是中藥粗糠柴的重要成分，Rottlerin可顯著提升缺血-再灌注心肌的AL?DH2磷酸化水平，減輕I/R引起的心肌細(xì)胞死亡，起到心臟保護(hù)的作用［14］。Rottlerin可通過抑制PKCδ-ERK1/2通路減輕6-羥基多巴胺所致多巴胺能細(xì)胞凋亡［15］。Rottlerin通過改善心肌細(xì)胞收縮和冠狀動(dòng)脈灌注，顯著改善心臟停搏后的心臟功能［16］。Rot?tlerin可顯著減輕細(xì)胞缺氧損傷形態(tài)改變，增強(qiáng)缺氧損傷后的細(xì)胞活力［17］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Rottlerin可保護(hù)LPS所致的心肌細(xì)胞損傷，且呈濃度依賴性。

研究表明，miRNA可通過控制心肌的細(xì)胞凋亡，降低心血管疾病的發(fā)生［18］，其還可調(diào)節(jié)血管損傷、血管重塑過程［19］。研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-204-5p的表達(dá)能通過調(diào)控Sirt1促進(jìn)糖尿病角膜上皮的損傷修復(fù)［20］。miR-204-5p過表達(dá)能抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程，并降低細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力［21］。miR-204-5p通過調(diào)節(jié)SIX1表達(dá)抑制肝細(xì)胞癌增殖［22］。miR-204-5p可以通過靶基因CCND1抑制肺癌細(xì)胞的增殖能力［23］。miR-204-5p通過抑制IGFBP5抑制乳頭狀甲狀腺癌中細(xì)胞增殖［24］。miR-204-5p通過抑制CXCR4的表達(dá)來調(diào)節(jié)口腔鱗狀細(xì)胞癌中細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移［25］。miR-204-5p通過下調(diào)USP47和RAB22A抑制胃癌細(xì)胞增殖［26］。衰老心肌細(xì)胞缺氧處理后miR-204下調(diào)表達(dá)，且缺氧后處理對(duì)缺氧復(fù)氧所致的衰老心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用減弱與miR-204有很大關(guān)系［27］。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-204-5p可保護(hù)LPS所致的心肌細(xì)胞損傷。且Rottlerin可上調(diào)miR-204-5p的表達(dá)，抑制miR-204-5p表達(dá)能逆轉(zhuǎn)Rottlerin對(duì)LPS作用的心肌細(xì)胞HCM的保護(hù)作用，提示Rottlerin可能通過調(diào)控miR-204-5p保護(hù)心肌細(xì)胞免受損傷。

HMGB1是HMG蛋白家族成員之一，一種重要的損傷相關(guān)的分子識(shí)別模式［28］；在眾多的心血管疾病如急性冠脈綜合征、缺血再灌注損傷、糖尿病心肌病中有重要的促炎作用［29］。研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1在損傷心肌細(xì)胞中高表達(dá)，CORM-2通過下調(diào)HMGB1的表達(dá)可減輕心肌細(xì)胞缺氧損傷［30］。缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞合成HMGB1，敲低HMGB1可以減弱缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，減輕氧化損傷［31］。GLP-1受體激動(dòng)劑通過抑制HMGB1的表達(dá)保護(hù)高糖誘導(dǎo)的心肌損傷［32］。抑制HMGB1可降低機(jī)體各種炎癥因子水平，調(diào)控膿毒癥的失控性炎癥效應(yīng)，減輕膿毒癥心肌損害［33］。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路的激活介導(dǎo)HMGB1減輕心肌缺血再灌注損傷，對(duì)心肌產(chǎn)生保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制或是抑制炎癥反應(yīng)、減輕氧化應(yīng)激、抑制心肌細(xì)胞凋亡［34］。上調(diào)miR-451通過抑制HMGB1 mRNA表達(dá)保護(hù)心肌細(xì)胞缺氧再復(fù)氧損傷［35］。本研究結(jié)果顯示，HMGB1受miR-204-5p的調(diào)控，過表達(dá)HMGB1能逆轉(zhuǎn)Rottlerin對(duì)LPS作用的心肌細(xì)胞HCM的保護(hù)作用。

綜上所述，粗糠柴毒素對(duì)LPS所致的心肌細(xì)胞損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過上調(diào)miR-204-5p的表達(dá)，進(jìn)而抑制HMGB1的表達(dá)而發(fā)揮作用。粗糠柴毒素在治療心肌損傷方面具有一定的治療潛力，miR-204-5p和HMGB1可能是心肌損傷治療的潛在靶點(diǎn)。