胡青，黃莉，唐林，陳麗，戴冰，肖望重

作者單位：1湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，湖南 長沙 410007；2湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410001

溫陽生肌凝膠為湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院燒傷瘡瘍整形科的臨床經(jīng)驗方，由肉桂、丁香、乳香、沒藥組成，具有溫陽行氣，去腐生肌功效，臨床上常用于治療各種慢性皮膚潰瘍［1-2］。現(xiàn)代藥理研究表明該四味藥中的揮發(fā)油具有抗菌消炎、抗?jié)兣c促進創(chuàng)面修復(fù)等作用［3-6］，故揮發(fā)油為該制劑的主要有效成分之一。然而，揮發(fā)油物理性質(zhì)不穩(wěn)定，容易揮發(fā)，給生產(chǎn)與儲存帶來諸多不便，因此，為提高揮發(fā)油在凝膠中的穩(wěn)定性，確保溫陽生肌凝膠臨床療效，2021年3—6月，本研究以君藥肉桂中揮發(fā)性成分桂皮醛為指標成分，建立了桂皮醛的含量測定方法，并采用正交試驗法對該制劑的揮發(fā)油提取與β-環(huán)糊精包合工藝進行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥1260 InfinityⅡ型HPLC儀，包括二極管陣列檢測器、LC1260色譜工作站（美國Agi?lent公司）；DZF-6020型真空干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；AUW220D型萬分之一電子分析天平（上海海鴻儀器有限公司）；SK5200H型超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）。

桂皮醛對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110710~201821）；β-環(huán)糊精（上海源葉生物科技有限公司，批號Z30M10Y89545），乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純凈水。肉桂（批號20061331D）由江蘇龍鳳堂中藥有限公司提供；丁香與乳香由湖南新匯制藥股份有限公司提供；沒藥由湖南衡岳中藥飲片有限公司提供，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院張志國教授鑒定，肉桂為樟科植物肉桂的干燥樹皮、丁香為桃金娘科植物丁香的干燥花蕾、乳香為橄欖科植物乳香樹及同屬植物樹皮滲出的樹脂、沒藥為橄欖科植物地丁樹.或哈地丁樹的干燥樹脂。

1.2 方法

1.2.1 桂皮醛含量測定

1.2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相∶乙腈-水（40∶60，V/V）；流速：1 mL/min；檢測波長：290 nm；柱溫：30℃；進樣量：10μL。

1.2.1.2 對照品溶液制備 采用減量稱重法，精密稱取桂皮醛對照品28.4 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇制成質(zhì)量濃度為1.136 0 g/L的對照品溶液

1.2.1.3 供試品溶液制備 根據(jù)處方要求，稱取肉桂、丁香、乳香、沒藥適量，按《中國藥典》2020版四部揮發(fā)油測定法（甲法）提取5 h，收集揮發(fā)油。量取揮發(fā)油3 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋定容至刻度，濾過，取續(xù)濾液，既得。

1.2.1.4 陰性樣品溶液制備 根據(jù)處方要求，稱取缺肉桂的其他樣品各適量，按“1.2.1.3”項方法制備陰性樣品溶液。

1.2.1.5 空白對照溶液 以甲醇為空白對照溶液。

1.2.2 系統(tǒng)適用性試驗 取上述空白對照溶液、對照品溶液、供試品溶液以及陰性樣品溶液各適量，按“1.2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，可見桂皮醛色譜峰分離度為3.64，理論塔板數(shù)為7 296，且與其他成分峰基線分離，空白對照溶液與陰性樣品溶液對測定無干擾，色譜圖結(jié)果見圖1。

圖1 桂皮醛含量測定系統(tǒng)適用性試驗高效液相色譜圖：A為空白溶劑；B為對照品；C為樣品；D為陰性樣品

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)分析使用SPSS 25.0進行處理，實驗數(shù)據(jù)用±s表示，采用多因素方差分析和獨立樣本t檢驗進行差異比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 線性關(guān)系考察取“1.2.1.2”項下對照品溶液1μL、2μL、4μL、8μL、10μL，按照“1.2.1.1”項下的色譜條件進行測定，記錄峰面積。以對照品進樣質(zhì)量（X，μg）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標，進行線性回歸，結(jié)果回歸方程為Y=392.57X-376.67（r=0.999 5），桂皮醛檢測進樣量線性范圍為1.136~11.36μg。

2.2 試驗及含量測定

2.2.1 精密度試驗 取“1.2.1.2”項下對照品溶液適量［7-8］，按“1.2.1.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果桂皮醛峰面積RSD為1.36%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.2 重復(fù)性試驗 取上述四味藥材適量，共6份，分別按“1.2.1.1”項與“1.2.1.3”項下方法試驗，結(jié)果桂皮醛平均含量為6.67 mg/g，RSD為1.17%。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗 取“1.2.1.3”項下的同一份供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h，按“1.2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果桂皮醛峰面積RSD為1.46%（n=6），表明供試品溶液置于室溫中24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4 加樣回收試驗 精密稱取上述四味藥材，分別精密加入桂皮醛對照品6.816 0 mg，按“1.2.1.3”項制備供試品溶液，按“1.2.1.1”項下色譜條件進樣測定，平均回收率為99.58%，RSD值為1.31%，表明該法準確性良好，結(jié)果見表1。

表1 桂皮醛加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）

2.2.5 含量測定 取上述四味藥材各適量，共9份，分別按“1.2.1.1”項與“1.2.1.3”項下方法試驗，結(jié)果，桂皮醛含量范圍為3.251 7~7.175 6 mg/g。

2.3 揮發(fā)油提取工藝研究

2.3.1 正交實驗設(shè)計 結(jié)合相關(guān)文獻報道與預(yù)試驗結(jié)果［9-11］，選擇藥材浸泡時間、加水量、提取時間為考察因素，每個因素設(shè)置3個水平，以桂皮醛含量與揮發(fā)油得率為考察指標（綜合評分中桂皮醛含量與揮發(fā)油得率的權(quán)重系數(shù)分別為0.7、0.3，即綜合評分=桂皮醛含量/最大桂皮醛含量×70%×100+揮發(fā)油得率/最大揮發(fā)油得率×30%×100），選用L9（34）正交表進行試驗。其中因素水平見表2，試驗設(shè)計與結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表2 肉桂揮發(fā)油提取工藝研究因素水平

表3 肉桂揮發(fā)油提取工藝試驗設(shè)計與結(jié)果

表4 肉桂揮發(fā)油提取工藝方差分析

2.3.2 結(jié)果分析 由正交試驗與方差分析結(jié)果可知，所選因素中對揮發(fā)油提取的影響程度大小分別是C>B>A，即提取時間>加水量>浸泡時間，其中因素C對提取工藝有顯著性影響（P<0.05），因素A、B無顯著性影響，結(jié)合實際生產(chǎn)情況與成本控制，認定最優(yōu)揮發(fā)油提取工藝為A1B1C3，即加8倍量水，浸泡30 min，提取8 h。

2.4 揮發(fā)油包合工藝研究

2.4.1 包合物制備方法選擇 目前揮發(fā)油包合常用方法為飽和水溶液法與研磨法［12-14］，因此以揮發(fā)油包合率與收得率為考察指標，分別對飽和水溶液法與研磨法進行考察，其中空白包合率（%）=回收揮發(fā)油量（mL）/加入揮發(fā)油量（mL）×100%，包合率（%）=包合物含油量（mL）/［包合物加油量（mL）×空白回收率（%）］×100%；收得率（%）=包合物重量（g）/［β-環(huán)糊精重量（g）+揮發(fā)油重量（g）］×100%。結(jié)果研磨法與飽和水溶液法包合率分別為（67.61±0.95）%、（51.63±1.35）%，t=13.68，P<0.001；研磨法與飽和水溶液法收得率分別為（79.40±0.73）%、（63.25±2.61）%，t=8.42，P=0.001，表明研磨法的包合率與收得率均高于飽和水溶液法，且均P<0.05，故選擇研磨法包合揮發(fā)油。

2.4.2 正交實驗設(shè)計 結(jié)合相關(guān)文獻報道與預(yù)試驗結(jié)果［15-16］，選擇β-環(huán)糊精投料比、加水量、研磨時間為考察因素，每個因素設(shè)置3個水平，以包合率與收得率為考察指標（綜合評分中包合率與收得率的權(quán)重系數(shù)均為0.5，即綜合評分=包合率/最大包合率×50%×100+收得率/最大收得率×50%×100），選用L9（34）正交表進行試驗。其中因素水平見表5，試驗設(shè)計與結(jié)果見表6，方差分析見表7。

表5 肉桂揮發(fā)油包合工藝因素水平

表6 肉桂揮發(fā)油包合工藝試驗設(shè)計與結(jié)果

表7 肉桂揮發(fā)油包合工藝方差分析

2.4.3 結(jié)果分析 由正交試驗與方差分析結(jié)果可知，所選因素中揮發(fā)油投料比（A）、加水量（B）、研磨時間（C）對包合效果均有顯著性影響，且影響程度大小分別是C>B>A，因此確定最優(yōu)揮發(fā)油包合工藝為A3B2C3，即揮發(fā)油與β-環(huán)糊精比例為1∶10（mL∶g），加水量為5倍，研磨3 h。

2.4.4 驗證試驗 依照揮發(fā)油最優(yōu)提取條件（A1B1C3）與最優(yōu)包合條件（A3B2C3）進行平行試驗3次，結(jié)果見表8。

表8 肉桂揮發(fā)油提取與包合驗證試驗

2.5 揮發(fā)油包合物TLC鑒別取混合揮發(fā)油0.2 mL，加乙醇定容至1 mL量瓶中，為供試品溶液1；取包合物粉末1 g，共2份，一份加乙醇10 mL超聲提取30 min，靜置，濾過，取續(xù)濾液為供試品溶液2，另一份加乙醇10 mL振搖30 min，濾過，取續(xù)濾液為供試品溶液3；取β-環(huán)糊精粉末1 g，加乙醇10 mL振搖10 min，靜置，濾過，取續(xù)濾液為供試品溶液4；吸取上述供試品溶液各2μL，分別點樣于硅膠G薄層板上，以石油醚（60~90℃）∶乙酸乙酯（9∶1）飽和15 min后展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，置105℃烘烤箱中加熱至斑點清晰，結(jié)果樣品1、2在相同位置顯示相同顏色的斑點，而樣品3、4未見任何斑點，表明包合物表面未殘留揮發(fā)油，且混合揮發(fā)油經(jīng)β-環(huán)糊精包前后化學(xué)性質(zhì)未發(fā)生明顯變化。

3 討論

溫陽生肌凝膠是在該院燒傷瘡瘍整形科主任周忠志教授所創(chuàng)的溫陽生肌方基礎(chǔ)上進行劑型改進而成，處方中各類藥物揮發(fā)油為該方的主要藥效部位之一，在藥物制備中應(yīng)予以保留。目前部分揮發(fā)油的提取工藝優(yōu)化考察指標為揮發(fā)油得率或揮發(fā)油含量［17-18］，該法存在考察指標單一，揮發(fā)性主要成分含量不可控等缺點，而本實驗采用雙指標綜合加權(quán)評價開展正交試驗研究，以君藥肉桂中揮發(fā)性成分桂皮醛為指標成分，建立了桂皮醛的含量測定方法，并結(jié)合揮發(fā)油得率對揮發(fā)油提取工藝進行優(yōu)化，這樣既保障了揮發(fā)油得率，又對揮發(fā)性成分含量指標進行有效控制，比單一考察揮發(fā)油得率更加科學(xué)合理。

經(jīng)文獻查詢，制劑過程中部分揮發(fā)油直接噴灑在藥材顆粒或粉末上，這樣既容易導(dǎo)致?lián)]發(fā)油揮發(fā)，降低療效，也容易增加制劑的油性異味，且質(zhì)量不可控［19-20］，因此本研究采用具有環(huán)狀中空圓筒結(jié)構(gòu)且可被人體吸收的β-環(huán)糊精對揮發(fā)油進行包合，即可增加揮發(fā)油的穩(wěn)定性和溶解度，又能提高藥物生物利用度，且該工藝操作簡便，穩(wěn)定可行，適用于工業(yè)生產(chǎn)。β-環(huán)糊精包合揮發(fā)油的鑒別方法較多，本試驗采用常用的薄層色譜法進行驗證，結(jié)果提示揮發(fā)油包合后性質(zhì)較穩(wěn)定。

綜上所述，本研究優(yōu)化所得的揮發(fā)油提取與包合工藝操作簡便，穩(wěn)定可行，且重現(xiàn)性良好，該結(jié)果可為溫陽生肌凝膠后續(xù)研究開發(fā)與實際生產(chǎn)提供技術(shù)參考與理論依據(jù)。