秦玉春，鄺向東，蔡林再，謝景臣

作者單位：海南西部中心醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，海南 儋州 571700

慢性阻塞性肺疾病（COPD）屬于常見的肺部疾病，其發(fā)病機制主要是氣道炎癥、氣流受限，而有害氣體、吸煙、揚塵以及病原微生物等成為造成COPD的主要原因［1］。該疾病的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增長的趨勢，已成為全球第三大死亡的主要原因，給病人及家庭造成嚴重的經(jīng)濟負擔［2］。研究報道，西藥對于COPD的治療雖然具有一定的作用，但其副作用嚴重限制了該類藥物的廣泛使用，因此副作用小，藥效穩(wěn)定的中草藥逐漸成為治療COPD的研究熱點［3］。水蛭素是螞蟥的主要活性成分，是目前發(fā)現(xiàn)的最高效的天然凝血酶抑制劑，臨床上被廣泛應用于治療冠心病、肝硬化以及腦血栓等疾病，研究表明水蛭素還具有凝血、抗炎、抗纖維化等作用，但對于COPD的治療目前鮮有報道［4］。RhoA/Rho激酶（Rho kinase，ROCK）信號通路是重要的信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)，在細胞遷移、發(fā)育、生長、分化等過程中發(fā)揮重要作用，也是神經(jīng)突生長、骨形成、背側(cè)閉合和肌生成所必需的，該途徑的失調(diào)與不同類型的疾病有關(guān)，包括與肺部相關(guān)的疾?。?］。于2020年1—6月，本研究通過氣管內(nèi)滴注脂多糖（LPS）溶液建立COPD模型，經(jīng)水蛭素干預后，探索水蛭素對COPD大鼠炎癥反應和纖維化以及RhoA/ROCK信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供52只8周齡、雄性、清潔級SD大鼠，體質(zhì)量范圍220~250 g，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（京）2016-0011，動物質(zhì)量合格證號為1100111911008834。所有大鼠分籠飼養(yǎng)于溫度范圍22~25℃、濕度范圍50%~60%、12 h光照/黑暗循環(huán)的飼養(yǎng)房中，常規(guī)喂養(yǎng)一周后開始實驗。本研究符合一般動物實驗倫理學原則。

1.1.2 實驗試劑與儀器 水蛭素（BTN130542，20 000 ATU/mL）購自北京百奧萊博科技有限公司；HE染色試劑盒（MM1013）購自上海懋康生物科技有限公司；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）測試盒（EKR38696）購自北京博沃爾斯生物科技有限公司；Masson三色膠原試劑盒（CSX10001）購自上海莼試生物科技有限公司；白細胞介素-1β（IL-1β）（H002）購自南京建成生物工程研究所；RhoA一抗（ab187027）、Rho激酶1（ROCK1）一抗（ab134181）購自abcam公司；ROCK激活劑［溶血磷脂酸（LPA）］（L7260，1 mg）購自Sigma公司。

MK3酶標儀購自芬蘭雷勃公司；IX71熒光顯微鏡購自日本Olympus公司；動物肺功能分析儀購自北京拜安吉科技有限公司；Optima MAX-TL臺式超速離心機購自貝克曼庫爾特國際貿(mào)易（上海）有限公司；600D型通用型電泳儀電源購自北京鴻濤基業(yè)科技發(fā)展有限公司。

1.2 COPD大鼠模型的制備、分組及給藥參照文獻［6］復制COPD大鼠模型：將適應性喂養(yǎng)一周的52只大鼠，按照隨機數(shù)字表法選取10只作為對照組，剩余42只大鼠作為造模組，在實驗第1、15天時，對造模組大鼠采用50 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，于大鼠頸部中央消毒并切開切口，分離氣管，采用頭皮針穿刺氣管，然后向氣管內(nèi)注入濃度為1 g/L LPS溶液（2 mg/kg）；注入結(jié)束后，為使藥物充分流入肺內(nèi)，可將大鼠立起旋轉(zhuǎn)2 min，之后縫合傷口，上述操作均在無菌條件下完成。當大鼠0.3秒用力呼氣容積（FEV0.3）與用力肺活量（FVC）比值（FEV0.3/FVC）<70%時，表明大鼠模型建立成功［7］。造模過程中大鼠死亡2只，將造模組剩余40只大鼠按照隨機數(shù)字表法分為模型組、水蛭素組、LPA組、水蛭素+LPA組，10只/組。水蛭素組分別給予50 U/kg水蛭素灌胃 干預［8］，LPA組給 予 腹腔 注射40μg/kg LPA干預［9］；水蛭素+LPA組分別給予50 U/kg水蛭素、40 μg/kg LPA干預；其余各組給予生理鹽水干預，干預1次/天，連續(xù)干預4周。

1.3 觀察指標

1.3.1 肺功能檢測 次日，戊巴比妥鈉麻醉大鼠，固定大鼠并對其頸部消毒，分離氣管，將氣管插管與肺功能分析儀連接，分別記錄FEV0.3、呼氣峰值流速（PEF）、FVC。

1.3.2 炎性因子指標的檢測 肺功能指標檢測完成后，麻醉大鼠，經(jīng)頸部總動脈取血0.6 mL，4 000 r/min離心10 min，取上清，按照Elisa試劑盒說明書檢測TNF-α、IL-1β水平。

1.3.3 觀察肺組織形態(tài)學及肺纖維化變化 取適量肺組織，脫水、透明并用石蠟包埋，制作切片，行HE、Masson染色，脫水、封片，觀察各組大鼠病理狀況及肺纖維化。

1.3.4 檢測大鼠肺組織中RhoA/ROCK通路蛋白表達 取適量肺組織，加入裂解液提取蛋白質(zhì)，離心取上清，BCA試劑盒測定總蛋白濃度，取適量蛋白上樣，電泳分離，轉(zhuǎn)膜，封閉；分別加入稀釋后（1∶1 000）的RhoA一抗、ROCK1一抗，4℃過夜孵育；洗膜后，加入二抗（1∶2 000）37℃孵育，ECL顯色曝光，以β-actin為內(nèi)參，利用Image J圖像分析軟件分析條帶圖，得出目的蛋白的相對表達水平。

1.4 統(tǒng)計學方法本研究所得數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，均符合正態(tài)分布，多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 水蛭素對各組大鼠肺功能指標的影響與對照組相比，模型組大鼠FEV0.3、FVC、PEF均顯著降低（P<0.05）；與模型組相比，水蛭素組大鼠FEV0.3、FVC、PEF均 顯著增加（P<0.05），LPA組 大 鼠FEV0.3、FVC、PEF均顯著降低（P<0.05）；與LPA組相比，水蛭素+LPA組大鼠PEF、FEV0.3、FVC均顯著增加（P<0.05）；與水蛭素組相比，水蛭素+LPA組大鼠PEF、FEV0.3、FVC均顯著降低（P<0.05）。見表1。

表1 各組大鼠肺功能指標的比較/±s

表1 各組大鼠肺功能指標的比較/±s

注：FVC為用力肺活量，PEF為呼氣峰值流速，F(xiàn)EV0.3為0.3秒用力呼氣容積。①與對照組相比，P<0.05。②與模型組相比，P<0.05。③與水蛭素組相比，P<0.05。④與LPA組相比，P<0.05。

組別對照組模型組水蛭素組LPA組水蛭素+LPA組F值P值鼠數(shù)10 10 10 10 10 FVC/（V/mL）11.21±1.12 7.41±0.71①10.98±0.99②5.34±0.53②8.83±0.85③④81.69<0.001 PEF/（mL/s）31.68±3.24 22.42±2.21①30.54±3.05②16.15±1.62②26.43±2.63③④58.93<0.001 FEV0.3/（V/mL）8.56±0.85 4.61±0.46①8.21±0.82②3.41±0.35②6.25±0.62③④117.84<0.001 FEV0.3/FVC/%76.12±0.76 62.11±0.59①74.77±0.75②63.85±0.61②70.78±0.71③④844.65<0.001

2.2 水蛭素對各組大鼠肺組織病理學變化的影響 對照組大鼠肺細胞形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)正常；模型組與對照組相比，大鼠細胞出現(xiàn)炎性浸潤，上皮細胞出現(xiàn)脫落，管壁增厚；與模型組相比，水蛭素組大鼠病理組織得到改善，炎性浸潤減少，細胞脫落、管壁增厚程度逐漸改善，LPA組大鼠炎性浸潤、細胞脫落以及管壁增厚程度均明顯增加；與LPA組相比，水蛭素+LPA組大鼠病理程度均得到緩解；與水蛭素組相比，水蛭素+LPA組大鼠炎性浸潤、細胞脫落等均增加。見圖1。

圖1 水蛭素對各組大鼠肺組織病理學的影響（蘇木精-伊紅染色×200）

2.3 水蛭素對各組大鼠肺纖維化的影響模型組大量細胞被染成藍色，極少量細胞質(zhì)呈現(xiàn)紅色；與模型組相比，水蛭素組大量細胞質(zhì)被染成紅色，著藍色細胞明顯減少，LPA組肺纖維化程度明顯加深；與LPA組相比，水蛭素+LPA組細胞著藍色明顯減少，紅色細胞質(zhì)逐漸加深；與水蛭素組相比，水蛭素+LPA組細胞著藍色逐漸增加，紅色細胞質(zhì)逐漸變淺。見圖2。

圖2 水蛭素對各組大鼠肺纖維化的影響（Masson染色×200）

2.4 水蛭素對各組大鼠炎性因子水平的影響模型組大鼠TNF-α、IL-1β水平較對照組均顯著增加（P<0.05）；與模型組相比，水蛭素組大鼠TNF-α、IL-1β水平均顯著降低（P<0.05），LPA組大鼠TNF-α、IL-1β水平均顯著增加（P<0.05）；與LPA組相比，水蛭素+LPA組大鼠TNF-α、IL-1β水平均顯著降低（P<0.05）；與水蛭素組相比，水蛭素+LPA組大鼠TNFα、IL-1β水平均顯著增加（P<0.05）。見表2。

表2 各組大鼠炎性因子指標的比較/（ng/L±s）

表2 各組大鼠炎性因子指標的比較/（ng/L±s）

注：TNF-α為腫瘤壞死因子-α，IL-1β為白細胞介素-1β。①與對照組相比，P<0.05。②與模型組相比，P<0.05。③與水蛭素組相比，P<0.05。④與LPA組相比，P<0.05。

組別對照組模型組水蛭素組LPA組水蛭素+LPA組F值P值鼠數(shù)10 10 10 10 10 TNF-α 100.32±10.02 545.37±54.56①115.35±11.55②768.39±76.93②265.73±27.11③④427.46<0.001 IL-1β 65.78±6.66 158.63±15.89①68.72±6.88②278.63±27.91②100.48±10.05③④322.29<0.001

2.5 水蛭素對各組大鼠RhoA/ROCK通路蛋白表達的影響模型組大鼠RhoA、ROCK1蛋白表達較對照組均顯著增加（P<0.05）；與模型組相比，水蛭素組大鼠RhoA、ROCK1蛋白表達均顯著降低（P<0.05），LPA組大鼠RhoA、ROCK1蛋白表達均顯著增加（P<0.05）；與LPA組相比，水蛭素+LPA組大鼠RhoA、ROCK1蛋白表達均顯著降低（P<0.05）；與水蛭素組相比，水蛭素+LPA組大鼠RhoA、ROCK1蛋白表達均顯著增加（P<0.05）。見圖3，表3。

圖3 各組大鼠肺組織RhoA、ROCK1蛋白質(zhì)印跡法圖

表3 各組大鼠RhoA、ROCK1蛋白表達的比較/±s

表3 各組大鼠RhoA、ROCK1蛋白表達的比較/±s

注：RhoA為蛋白RhoA，ROCK1為Rho激酶1，β-actin為β-肌動蛋白。①與對照組相比，P<0.05。②與模型組相比，P<0.05。③與水蛭素組相比，P<0.05。④與LPA組相比，P<0.05。

組別對照組模型組水蛭素組LPA組水蛭素+LPA組F值P值鼠數(shù)10 10 10 10 10 RhoA/β-actin 0.22±0.02 0.78±0.07①0.27±0.03②1.02±0.11②0.58±0.06③④262.05<0.001 ROCK1/β-actin 0.25±0.02 0.74±0.07①0.29±0.03②0.98±0.09②0.57±0.06③④263.77<0.001

3 討論

COPD疾病已經(jīng)影響全球十分之一的人口，被世界衛(wèi)生組織確定為全球未被滿足的主要健康需求，且數(shù)據(jù)顯示，到2030年COPD將成為全球第三大致命疾病，預計將影響越來越多的全球人口［10-11］。COPD是一種使人衰弱但可預防的多因素疾病，其特征是無法治愈的進行性氣流受限，臨床表現(xiàn)多種多樣，包括肺氣腫、慢性支氣管炎以及病人的呼吸道癥狀急性惡化，給醫(yī)療系統(tǒng)和社會均帶來巨大的經(jīng)濟負擔［12］。本研究通過氣管內(nèi)滴注LPS溶液建立COPD模型，當FEV0.3/FVC<70%時，表明大鼠模型建立，可進一步研究。

COPD的發(fā)病機理較為復雜，而異常的炎癥反應被認為參與了COPD病情發(fā)展，因此炎性因子如TNF-α、IL-1β在COPD氣道炎癥反應中發(fā)揮關(guān)鍵作用［13］。水蛭素是一種從中藥水蛭中提取的分泌多肽，被認為是最有效的天然凝血酶抑制劑，含有抗癌、抗凝血、抑菌和降血脂等多種藥理活性，與許多疾病的病理過程有關(guān)［14］。Shen等［15］研究發(fā)現(xiàn)人錳超氧化物歧化酶與水蛭素的融合蛋白可以降低肺部炎癥，阻止肺纖維化的發(fā)展。水蛭素可抑制博萊霉素致特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化大鼠的肺組織炎癥和纖維化，且呈現(xiàn)劑量依賴性［16］。本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠肺組織損傷及纖維化較嚴重，PEF、FEV0.3、FVC較對照組顯著降低，而IL-1β、TNF-α水平均顯著增加；經(jīng)水蛭素干預后，大鼠肺組織損傷及纖維化程度得到改善，PEF、FEV0.3、FVC較模型組顯著增加，而IL-1β、TNF-α水平均顯著降低，表明水蛭素可以抑制COPD大鼠的炎癥反應和肺纖維化，改善肺損傷。

RhoA/ROCK信號通路參與多種器官纖維化、心腦血管以及腫瘤浸潤等疾病的發(fā)生。研究表明通過LPS構(gòu)建的肺損傷模型中可導致大量炎癥細胞的產(chǎn)生，而LPS可激活RhoA/ROCK信號通路參與肺損傷的發(fā)展過程［17］。賈海燕等［18］研究發(fā)現(xiàn)烏司他丁可以通過抑制RhoA/ROCK信號通路，降低膿毒癥小鼠的肺水腫，改善血管通透性和肺損傷。陳勇等［19］研究發(fā)現(xiàn)抑制RhoA/ROCK信號通路可以降低炎癥反應，減輕病人機械通氣時的肺損傷。本實驗研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠RhoA、ROCK1蛋白表達均顯著增加；經(jīng)水蛭素干預后，大鼠肺組織中RhoA、ROCK1蛋白表達均顯著降低。表明水蛭素可以抑制RhoA、ROCK1蛋白表達，改善COPD大鼠肺損傷狀況。為進一步驗證該猜想，實驗引入ROCK的激活劑-LPA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPA組大鼠較模型組大鼠肺組織損傷及纖維化程度進一步加重，PEF、FEV0.3、FVC較模型組顯著降低，而IL-1β、TNF-α、RhoA、ROCK1蛋白表達均顯著增加；與水蛭素+LPA組相比，水蛭素組大鼠肺組織損傷及纖維化程度得到改善，PEF、FEV0.3、FVC較模型組顯著增加，而IL-1β、TNF-α、RhoA、ROCK1蛋白表達均顯著降低。揭示了水蛭素可以抑制COPD大鼠的炎癥反應和肺纖維化，改善肺損傷，可能與抑制RhoA/ROCK信號通路有關(guān)。

綜上所述，水蛭素可以通過抑制RhoA/ROCK信號通路，抑制COPD大鼠的炎癥反應和肺纖維化，阻止COPD疾病的進一步發(fā)展，為臨床治療COPD疾病提供新的研究方向。