劉曉珍，盧培泉，李福香，祝兆亮，蘇梓爍，黃丹菲，謝明勇*

（1 東莞理工學(xué)院化學(xué)工程與能源技術(shù)學(xué)院 食品營養(yǎng)健康與智能化加工研究中心 廣東東莞 523808 2 南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室 南昌 330047）

壬基酚（Nonylphenol，NP）是壬基酚聚氧乙烯醚 （Nonylphenol polyoxyethylene ethers，NPEs）的生物降解產(chǎn)物，是帶有1 個苯環(huán)和9 碳側(cè)鏈化合物的總稱，存在多種同分異構(gòu)體。由于其結(jié)構(gòu)和β-雌二醇具有一定的相似性，能夠模擬β-雌二醇的功能與活性，從而表現(xiàn)出雌激素效應(yīng)，因此NP被認為是一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾素（Environmental endocrine disruptors，EEDs）。研究證實，NP 能夠?qū)X類[1]、魚類[2]、蛙類[3]、水生甲殼類動物[4]等生物產(chǎn)生內(nèi)分泌干擾效應(yīng)，嚴重干擾生殖系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)。

大量研究指出壬基酚在各種食品，例如瓜果蔬菜、雞鴨魚肉當(dāng)中有較高濃度的暴露，且人類可能因食用被壬基酚污染的食物，使得壬基酚進入人體并在體內(nèi)蓄積，影響生殖、神經(jīng)、免疫等系統(tǒng)，對人類健康產(chǎn)生潛在影響[5-6]。目前，已經(jīng)認可高劑量的特定環(huán)境內(nèi)分泌干擾物會導(dǎo)致內(nèi)分泌、生殖或者神經(jīng)學(xué)的問題，然而關(guān)于低劑量NPs 暴露的健康問題鮮有報道，對壬基酚進行低劑量暴露下生物毒性研究、風(fēng)險評估，以及對其建立限制標準顯得尤為重要。

研究表明NP 的生物效應(yīng)高度依賴于其側(cè)鏈結(jié)構(gòu)，不同的NP 異構(gòu)體由于側(cè)鏈結(jié)構(gòu)不同，導(dǎo)致其對生物體的毒害效應(yīng)存在顯著差異[7]。然而目前的研究多以工業(yè)壬基酚為研究對象，而工業(yè)壬基酚是由多種NP 異構(gòu)體組成的混合物，由于不同工業(yè)壬基酚各異構(gòu)體的組成及比例不同，因此導(dǎo)致研究結(jié)果不一致[8]。選用純度較高的NP 單體來進行活性研究十分必要。9 碳側(cè)鏈位于羥基對位的壬基酚，被稱為對壬基酚或4-壬基酚（4-NP），是最常見的壬基酚形式，也是研究報道最多的壬基酚形式。

近年來，關(guān)于壬基酚生物毒性的研究報道越來越多，然而，對于壬基酚可產(chǎn)生免疫毒性促進腫瘤發(fā)生的相關(guān)分子機制尚不清楚，現(xiàn)階段還未發(fā)現(xiàn)利用壬基酚異構(gòu)體單體進行免疫系統(tǒng)損傷效應(yīng)的研究。巨噬細胞在宿主免疫應(yīng)答過程中扮演重要角色，當(dāng)它們被激活時，能夠抑制各種腫瘤細胞的生長[9]。本研究評估低劑量的NP42暴露對小鼠RAW264.7 巨噬細胞的毒性效應(yīng)。利用高純度的壬基酚異構(gòu)體NP42作用于RAW264.7 巨噬細胞，通過檢測細胞TNF-α mRNA 和iNOS mRNA 的表達、cAMP/cGMP-PKC-p38MAPK 信號通路等免疫相關(guān)參數(shù)，探討NP42對小鼠巨噬細胞的免疫毒性作用及相關(guān)分子機制，從而深入認識壬基酚異構(gòu)體NP42的免疫損傷效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小鼠巨噬細胞RAW264.7 細胞系，上海細胞生物研究所。

NP42單體（結(jié)構(gòu)見圖1），德國Guenther 教授實驗室 （Institute for Chemistry and Dynamics of the Geosphere，Research Centre Juelich，Germany）惠贈；胎牛血清、RPMI 1640 培養(yǎng)基，美國Hyclone公司；噻唑藍（3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-Htetrazolium bromide，MTT），美國Sigma 公司；cAMP Elisa 試劑盒、cGMP Elisa 試劑盒，南京建成生物工程研究所；Western 及IP 細胞裂解液、BCA 蛋白質(zhì)量濃度測定試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所；PKC 蛋白抗體，博士德生物技術(shù)有限公司；p38、p-p38 蛋白抗體，美國Cell Signaling Technology 公司。

圖1 壬基酚異構(gòu)體NP42 的結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structure of NP42

1.2 儀器與設(shè)備

Milli-Q50 超純水凈化系統(tǒng)，美國Millipore 公司；倒置相差顯微鏡，日本Olympus 公司；超凈工作臺，上海一恒科技有限公司；高速冷凍離心機，美國Sigma 公司；Varioskan Flash E33 全波長多功能酶標儀、細胞培養(yǎng)箱3110 Series II，美國Thermo Electron 公司；電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；超低溫冰箱，青島海爾電冰箱股份有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；垂直電泳-轉(zhuǎn)膜裝置、ChemDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，美國BIO-RAD 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠RAW264.7 巨噬細胞的培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)小鼠RAW264.7 巨噬細胞，選用對數(shù)生長期良好的細胞用于后續(xù)實驗。

1.3.2 細胞存活率測定 采用MTT 法檢測細胞存活率。將RAW264.7 細胞以1×104個/孔接種至96 孔板，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。加入不同濃度NP42（0，0.1，1.0，10，100 μmol/L）處理24 h 后，每孔加入20 μL MTT 溶液（5 mg/mL），37℃繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL 二甲基亞砜（Diphenylamine，DMSO），振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，選擇570 nm 波長，在多功能酶標儀上測定各孔光吸收值，根據(jù)OD樣品/ODControl×100%計算細胞存活率[10]。

1.3.3 ELISA 檢測cAMP 和cGMP 含量 將細胞以2×105個/孔接種于6 孔板，經(jīng)不同濃度NP42（0，0.1，1.0，10 μmol/L） 處理24 h 后，收集，PBS 洗2次，利用液氮/37 ℃反復(fù)凍融3 次，4 ℃，12 000 r/min 離心10 min，收集上清液。用Elisa 法檢測cAMP 和cGMP 的活力，操作方法按Elisa 試劑盒說明進行。

1.3.4 Western blot 檢測蛋白表達 將細胞以2×105個/孔接種至6 孔培養(yǎng)板中，經(jīng)不同濃度NP42（0，0.1，1.0，10 μmol/L）處理24 h 后，預(yù)冷PBS 洗滌3 次，收集細胞，按照Western 及IP 細胞裂解液說明書要求提取細胞蛋白，再根據(jù)BCA 蛋白質(zhì)量濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。蛋白變性后等量蛋白上樣，進行SDS-PAGE 凝膠電泳（50 V 電壓，30 min；100 V 電壓，55 min），濕法轉(zhuǎn)印至NC 膜。轉(zhuǎn)印完畢后，NC 膜經(jīng)0.1%牛血清白蛋白封閉2 h，TBST 洗3 遍后，用稀釋后的PKC、p38、p-p38一抗4 ℃孵育過夜。孵育過夜后，小心把NC 膜轉(zhuǎn)移至裝有TBST 溶液的平皿中，振蕩洗膜3 遍，每遍10～15 min。再用辣根過氧化物酶（Horse radish peroxidase，HRP）標記二抗（1∶5 000）孵育2 h，TBST 溶液振蕩洗膜3 遍，每遍10～15 min。采用ECL 化學(xué)發(fā)光顯色反應(yīng)，應(yīng)用全能型凝膠成像分析系統(tǒng)成像、Quantity One 軟件分析[10]。

1.3.5 反轉(zhuǎn)錄PCR 將RAW264.7 細胞以2×105個/孔接種至6 孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。NP42處理24 h 后，用預(yù)冷PBS 洗滌3 次，收集細胞，按照Trizol 試劑法提取細胞的總RNA。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒在20 μL RNA 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以此為模板進行PCR 擴增，引物系列見表1。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃3 min，94 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃2 min，72 ℃10 min，循環(huán)次數(shù)均為30 次，取擴增產(chǎn)物6 μL 進行電泳[10]。

表1 反轉(zhuǎn)錄PCR 引物序列Table 1 Oligonucleotide primer sequences for quantitative RT-PCR

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 NP42 對小鼠RAW264.7 巨噬細胞存活率的影響

巨噬細胞是機體重要的免疫細胞，有多種功能，是研究細胞吞噬、細胞免疫和分子免疫學(xué)的重要對象。有研究報道NP 通過減弱小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬功能，從而抑制小鼠的免疫功能，然而其分子機制還不明確[11-12]。本研究中探討了NP42對小鼠RAW264.7 巨噬細胞的毒性效應(yīng)及其相關(guān)的分子機制。

不同濃度NP42對RAW264.7 細胞存活率的影響如圖1所示，與對照組相比，低濃度NP42（0.1，1.0，10 μmol/L） 處理24 h 能夠降低RAW264.7 細胞的存活率，然而無顯著性影響。當(dāng)NP42濃度上升到100 μmol/L 時，能顯著引起細胞的死亡（P ＜0.01），并且在顯微鏡下可以明顯觀察到細胞損傷狀態(tài)。該結(jié)果與本實驗室前期報道的NP42對小鼠Sertoli TM4 細胞的細胞毒性結(jié)果相一致[13]。因此，在后續(xù)相關(guān)分子機制研究中選用NP42濃度為0.1，1.0，10 μmol/L。

2.2 NP42 對RAW264.7 細胞內(nèi)TNF-α mRNA及iNOS mRNA 表達的影響

TNF-α 主要由活化的巨噬細胞產(chǎn)生，通過細胞膜上的特異性受體向細胞核傳遞信息，從而促進細胞增殖分化，產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)、炎癥介導(dǎo)、抗腫瘤等復(fù)雜的生物學(xué)活性[14]。NO 被證實參與了宿主的非特異性免疫、巨噬細胞介導(dǎo)的殺傷、抑制腫瘤細胞的增殖等過程[15-16]。在哺乳動物中，已鑒定有3 類一氧化氮合酶 （Nitric oxide synthase，NOS），分別為內(nèi)皮型一氧化氮合酶eNOS，神經(jīng)元型一氧化氮合酶nNOS，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS），其中iNOS 是NO 合成的主要酶，iNOS 的表達決定了NO 的合成。

圖2 不同濃度NP42 對RAW264.7 巨噬細胞存活率的影響Fig.2 Effect of different concentrations of NP42 on cell survival rate in RAW264.7 cells

本實驗中，采用RT-PCR 檢測了NP42對RAW264.7 細胞內(nèi)TNF-α mRNA 及iNOS mRNA表達的影響，結(jié)果如圖3和圖4所示。結(jié)果顯示，10 μmol/L NP42顯著降低TNF-α mRNA 的表達（P ＜0.01，圖3）。由圖4可知，與空白對照組相比，NP42處理能夠顯著抑制細胞內(nèi)iNOS mRNA 的表達（P ＜0.05），其中濃度為10 μmol/L 時，表現(xiàn)為極顯著（P ＜0.01）。這表明NP42可對RAW264.7 細胞造成損傷，導(dǎo)致TNF-α mRNA 和iNOS mRNA 表達降低，可能進一步導(dǎo)致TNF-α 和NO 合成下降。You 等[17]研究發(fā)現(xiàn)4-NP 能夠在小鼠原代腹膜巨噬細胞和RAW264.7 細胞內(nèi)抑制脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的TNF-α 和NO 的生成，并且能夠抑制TNF-α mRNA 及iNOS mRNA 的表達，與本實驗研究結(jié)果一致。Lee 等[18]同樣發(fā)現(xiàn)，NP 能夠抑制B 淋巴細胞和巨噬細胞內(nèi)NO的分泌和TNF-α mRNA 及iNOS mRNA 的表達，影響細胞的免疫應(yīng)答，從而抑制了機體抵抗腫瘤發(fā)生的能力。綜上，研究推測NP42可能通過抑制TNF-α 和NO 的生成以及抑制TNF-α mRNA 和iNOS mRNA 的表達從而影響機體的免疫功能。

圖3 不同濃度NP42 對巨噬細胞TNF-α mRNA 的表達的影響Fig.3 Effect of different concentrations of NP42 on the mRNA expression of TNF-α

圖4 不同濃度NP42 對巨噬細胞iNOS mRNA 表達的影響Fig.4 Effect of different concentrations of NP42 on the mRNA expression of iNOS

2.3 NP42 對RAW264.7 細胞內(nèi)cAMP、cGMP含量的影響

環(huán)境內(nèi)分泌干擾物能夠影響非甾醇類激素信號通路發(fā)揮作用，例如腺苷酸環(huán)化酶（Cyclic adenosine mono-phos-phase，cAMP）[19]、磷酸肌醇[20]以及Ca2+信號通路[21]。其中，cAMP 和cGMP 在許多器官調(diào)節(jié)細胞功能中起著非常重要的作用 （如增殖、分化、細胞凋亡、基因轉(zhuǎn)錄）[22-23]。正常情況下，cAMP 與cGMP 含量相對穩(wěn)定并維持一定的比例，若二者比例發(fā)生改變就會引起機體功能失調(diào)而導(dǎo)致疾病[24]。本研究檢測了NP42對RAW264.7細胞內(nèi)cAMP、cGMP 含量的影響。結(jié)果如圖5所示，與對照組相比，在0.1，1.0，10 μmol/L NP42處理24 h 后，RAW264.7 細胞內(nèi)cAMP 的含量顯著降低 （P ＜0.01）（圖5a）。巨噬細胞內(nèi)存在1 個cAMP-PKA 途徑調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，cAMP 活性的降低，可引起PKA 等下游信號的激活，這可能是NP42造成細胞損傷的原因之一。另一方面，NP42處理能夠顯著上調(diào)RAW264.7 細胞內(nèi)cGMP 的含量（濃度為0.1 μmol/L 時，P ＜0.05；濃度為1.0，10 μmol/L 時，P ＜0.01，圖5b）。這與曹鳳華[25]報道小鼠經(jīng)不同濃度氣態(tài)甲酵染毒后，各器官組織中cGMP 含量隨染毒濃度升高而上升相一致，表明NP42可能通過調(diào)控cGMP 的表達來發(fā)揮損傷效應(yīng)。

圖5 NP42 對細胞內(nèi)cAMP 活性和cGMP 含量的影響Fig.5 Effects of NP42 on the content of cAMP and cGMP

2.4 NP42 對RAW264.7 細胞內(nèi)PKC 蛋白表達的影響

蛋白激酶（Protein kinases，PK）能夠催化蛋白質(zhì)的磷酸化過程，主要包括以cAMP 依賴的蛋白激酶PKA，cGMP 依賴的蛋白激酶PKG 及鈣和磷脂依賴的蛋白激酶PKC，通過檢測效應(yīng)物（如PKC蛋白）和第二信使（如cAMP、cGMP），可以很好地說明被檢測物發(fā)揮作用時經(jīng)由的信號通路[26]。如圖6所示，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細胞經(jīng)不同濃度NP42處理后，NP42在0.1，1.0 μmol/L 時，顯著下調(diào)了PKC 蛋白的表達（P ＜0.05），在濃度為10 μmol/L時，極其顯著地下調(diào)了PKC 蛋白的表達（P ＜0.01），說明NP42會通過干擾鈣和PKC 信號通路來對巨噬細胞產(chǎn)生免疫毒害作用。

圖6 NP42 對細胞PKC 蛋白表達的影響Fig.6 Effect of NP42 on the protein expression of PKC

2.5 NP42 對p38-MAPK 信號通路的影響

目前認為，環(huán)境內(nèi)分泌干擾物等外源性雌激素主要通過兩種方式發(fā)揮毒性或者內(nèi)分泌干擾作用[27]，其中之一依賴于雌激素受體的激活，另一種是觸發(fā)細胞內(nèi)各種信號級聯(lián)，主要包括cAMP 途徑、PKC、鈣離子通路（Ca2+）、磷脂酰肌醇3 激酶（Phosphoinositide 3 kinase，PI3K） 信號通路、MAPK 信號通路等。其中MAPK 信號通路在細胞的增殖、分化、凋亡以及對環(huán)境刺激的反應(yīng)等方面起重要作用。在哺乳動物細胞中鑒定了3 個MAPKs 家族成員：ERK、JNK、p38 激酶。JNK 和p38 通路被認為起誘導(dǎo)細胞死亡作用，而ERK1/2通路則被認為促進細胞生長繁殖。JNK、p38 和ERK 的動態(tài)平衡決定了細胞的存活或凋亡。

采用Western blot 法檢測不同濃度NP42對細胞內(nèi)p38-MAPK 信號通路的影響。結(jié)果如圖7所示，與對照組相比，在NP42濃度為0.1 μmol/L 時，p38 蛋白的磷酸化水平無顯著變化，當(dāng)NP42濃度增加至1.0 μmol/L 和10 μmol/L 時，p38 蛋白的磷酸化水平顯著降低，此結(jié)果說明NP42抑制RAW264.7 巨噬細胞的p38 蛋白磷酸化且表現(xiàn)出劑量依賴性。MAPKs 主要由PKC 和PKA 等激酶刺激活化，本研究結(jié)果說明NP42可能通過抑制PKC 的表達，進而抑制p38-MAPK 信號的表達，從而誘導(dǎo)細胞損傷。本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)，正壬基酚可通過激活p38、ERK1/2、JNK 信號通路對Sertoli TM4 細胞誘導(dǎo)損傷[28]。Han 等[29]研究發(fā)現(xiàn)NP 可能通過激活PI3-Akt/MAPK/CRE 信號通路誘導(dǎo)COX-2 表達參與對RAW264.7 巨噬細胞的免疫炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)。壬基酚異構(gòu)體的生物效應(yīng)高度依賴于其側(cè)鏈結(jié)構(gòu)，這可能是導(dǎo)致不同的壬基酚異構(gòu)體，在不同甚至相同的細胞中，表現(xiàn)出對MAPK 信號通路不一致的結(jié)果，在未來的研究中將進一步探討壬基酚異構(gòu)體的構(gòu)效關(guān)系。

圖7 NP42 對p38-MAPK 信號通路的影響Fig.7 NP42 inhibited p38-MAPK signaling pathway in RAW264.7 cells

3 結(jié)論

利用不同濃度的壬基酚單體NP42處理小鼠RAW264.7 巨噬細胞，探究NP42對RAW264.7 巨噬細胞的損傷作用和對細胞免疫功能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)NP42能夠抑制cAMP 的活性，下調(diào)TNF-α mRNA 和iNOS mRNA 的表達，同時抑制PKC 蛋白的表達和p38-MAPK 蛋白的磷酸化。這表明NP42可能通過PKC-cAMP 信號通路和p38-MAPK 信號通路對小鼠RAW264.7 巨噬細胞產(chǎn)生損傷效應(yīng)，從而影響RAW264.7 巨噬細胞的功能，這可能是壬基酚異構(gòu)體NP42誘導(dǎo)生物體免疫損傷的一個重要分子機制。