申 悅，勞敏軍，王當(dāng)豐，崔方超*，林 洪，李婷婷，勵(lì)建榮

（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧錦州 121013 2 浙江興業(yè)集團(tuán)有限公司 浙江舟山 316120 3 中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山東青島 266100 4 大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 遼寧大連 116600）

微生物的生長(zhǎng)代謝是導(dǎo)致水產(chǎn)品腐敗的主要原因之一。在水產(chǎn)品腐敗過(guò)程中，通常只有1 種或幾種微生物起主要作用，這些細(xì)菌就是優(yōu)勢(shì)腐敗菌（Specific spoilage organisms，SSOs）[1]。隨著微生物的繁殖，細(xì)菌密度逐漸增大，細(xì)菌通過(guò)自身合成并釋放自誘導(dǎo)物——信號(hào)分子，來(lái)調(diào)控其生物行為（如生物發(fā)光、生物被膜形成、毒力因子表達(dá)及浮游等），這一過(guò)程稱(chēng)為群體感應(yīng)（Quorum sensing，QS）[2]。López-Martín 等[3]發(fā)現(xiàn)鮑曼不動(dòng)桿菌的QS 系統(tǒng)在調(diào)節(jié)表面運(yùn)動(dòng)、生物膜形成和毒力方面起著重要作用。熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）是水產(chǎn)品貯藏過(guò)程中常見(jiàn)的嗜冷菌，屬于好氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性細(xì)菌。因其適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)周期短、胞外酶活性高，故被公認(rèn)為動(dòng)物和水產(chǎn)品中的SSOs[4]。熒光假單胞菌能分泌N-?；呓z氨酸內(nèi)酯 （N-acyl-homoserine lactones，AHLs）作為信號(hào)分子，來(lái)調(diào)控水產(chǎn)品的腐敗[5]。對(duì)QS 系統(tǒng)的干擾或破壞有助于控制許多致腐菌腐敗表型的表達(dá)，從而延長(zhǎng)水產(chǎn)品貨架期。

通常將能夠以QS 為靶標(biāo)，干擾信號(hào)通路的物質(zhì)稱(chēng)為群體感應(yīng)抑制劑 （Quorum sensing inhibitors，QSIs）[6]。它們能在不殺死或不干擾細(xì)菌正常生命活動(dòng)的前提下有效調(diào)控菌群的結(jié)構(gòu)和功能[7]。目前QSIs 主要從3 個(gè)方面抑制QS：①通過(guò)阻斷LuxI 型合酶中斷AHL 信號(hào)合成；②通過(guò)群體感應(yīng)淬滅酶（Quorum quenching enzymes）降解AHLs 信號(hào)傳播，減少AHLs 的積累；③干擾信號(hào)受體或阻斷AHL/LuxR 復(fù)合物[8]。這些方法旨在減少群體感應(yīng)介導(dǎo)的表型表達(dá)，而不會(huì)對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生其它破壞性的影響。群體感應(yīng)淬滅酶中，研究最廣泛的是AHL 乳糖酶和AHL ?；?，這兩類(lèi)的酶均以AHLs 為底物。AHL 乳糖酶通過(guò)水解內(nèi)酯環(huán)上的酯鍵產(chǎn)生?；呓z氨酸，使短鏈和長(zhǎng)鏈AHLs失活。相比之下，AHL ?；竿ǔ?duì)側(cè)鏈長(zhǎng)度超過(guò)10 個(gè)碳的AHLs 最有效[9]。AHL 酰化酶可以分解AHLs 的酰胺鍵，產(chǎn)生相應(yīng)的脂肪酸和高絲氨酸內(nèi)酯（HSL），其作用方式與青霉素?；傅淖饔梅绞椒浅Ｏ嗨啤Ｍㄟ^(guò)詳細(xì)的結(jié)構(gòu)研究，已證實(shí)AHL?；概c其它青霉素酰化酶屬于同一Ntn 水解酶超家族。由此可推測(cè)：青霉素?；负推渌麼tn 水解酶超家族酶可能具有切割A(yù)HLs 的能力[10]。2014年，Mukherji 等[11]首次報(bào)道了產(chǎn)自檸檬克魯維酵母（Kluyvera citrophila）的青霉素G ?；福↘cPGA）活性，通過(guò)生化分析和分子對(duì)接驗(yàn)證了無(wú)論是否經(jīng)過(guò)3-氧基修飾，KcPGA 對(duì)含6～8 個(gè)碳原子的AHLs 都具有活性。

產(chǎn)自巨大芽孢桿菌的青霉素?；钢饕脕?lái)合成青霉素或頭孢霉素類(lèi)抗生素，為了方便工業(yè)應(yīng)用[12]，越來(lái)越多的研究集中于酶的性質(zhì)方面。由于固定化酶靈敏度高、穩(wěn)定性好、操作簡(jiǎn)單、成本低，因此被廣泛應(yīng)用于在食品工業(yè)中，降低了食品生產(chǎn)成本，也減少了生產(chǎn)過(guò)程中造成的污染[13]。迄今為止，尚未有文獻(xiàn)報(bào)道固定化青霉素?；笇?duì)QS 的淬滅作用。本文以市售青霉素?；笧閷?duì)象，研究其對(duì)水產(chǎn)腐敗菌的QS 淬滅作用，以期為其在抑制水產(chǎn)品腐敗方面的研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

紫色桿菌 （Chromobacterium violaceum 026，CV026） 為紫色桿菌ATCC 31532 的mini-Tn5 突變體，卡那霉素抗性，僅當(dāng)存在外源短鏈AHLs（C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL）時(shí)，菌株CV026 產(chǎn)生特征性紫色色素。供試菌株熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）從腐敗大菱鲆中分離、鑒定。兩種菌株均保藏于渤海大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院水產(chǎn)品貯藏與加工研究所。

固定化青霉素?；?，產(chǎn)自巨大芽孢桿菌（酶活力：≥240 U/g），上海笛柏生物科技有限公司；卡那霉素、冰醋酸，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙酸乙酯，天津風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司；結(jié)晶紫，天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；載玻片，江蘇飛舟玻塑有限公司；LB 肉湯培養(yǎng)基、LB 營(yíng)養(yǎng)瓊脂，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；Skim Milk 脫脂奶粉，北京索萊寶科技有限公司；瓊脂糖，美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD 超凈工作臺(tái)，蘇景集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Biofuge Stratos 臺(tái)式高速離心機(jī)，美國(guó)Thermo Fisher 公司；LDZX-50KB 立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；MS105UD電子分析天平，瑞士梅特勒-托利儀器有限公司；imark 酶標(biāo)儀，美國(guó)BIO-RAD；Nikon80i 顯微鏡，日本尼康公司；Agilent 7890N/5975 氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）儀，美國(guó)Agilent 公司；LRH 系列生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 固定化青霉素?；敢志钚源_定及QSIs活性檢測(cè) 參考梅永超等[14]的方法略加修改，將CV026 和熒光假單胞菌過(guò)夜培養(yǎng)對(duì)數(shù)期（106CFU/mL），按1 ∶100 的體積比接種于LB 肉湯中（培養(yǎng)CV026 的LB 肉湯中需含有20 μg/mL 卡那霉素；培養(yǎng)熒光假單胞菌的肉湯中分別含有0，2.5，5，10，15，20，25 mg/mL 的固定化青霉素?；福?，28 ℃，160 r/min 振蕩培養(yǎng)16～18 h。吸取200 μL 加入不同質(zhì)量濃度固定化青霉素酰化酶培養(yǎng)的熒光假單胞菌菌液添加到96 孔板中，用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)595 nm 測(cè)定OD 值，觀察酶對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。將用牛津杯提前放入平板中的10 mL CV026 與100 mL LB 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基混合，倒平板，孔中加入不同質(zhì)量濃度固定化青霉素?；概囵B(yǎng)過(guò)的熒光假單胞菌上清液，以沒(méi)有加固定化青霉素酰化酶培養(yǎng)的熒光假單胞菌上清液為空白對(duì)照，28 ℃靜置培養(yǎng)24～48 h 后，觀察紫色菌素的產(chǎn)生情況。

1.3.2 固定化青霉素?；笇?duì)紫色菌素產(chǎn)生的影響 根據(jù)參考文獻(xiàn)[15]，菌株CV026 過(guò)夜活化后，按1∶100 的體積比接種于含有不同質(zhì)量濃度固定化青霉素?；?（0，2.5，5，10，15，20，25 mg/mL）的LB 肉湯中，并加入200 μL 的AHLs 粗提液，160 r/min，28 ℃振蕩培養(yǎng)48 h。而后依次吸取300 μL 培養(yǎng)液于1.5 mL 離心管中，加入150 μL 10%十二烷基硫酸鈉，振蕩10 s，加入600 μL 正丁醇，振蕩5 s，10 000 r/min 離心5 min，吸取200 μL 紫色上清液添加到96 孔板中，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD595nm，以不加信號(hào)分子的試驗(yàn)組作為對(duì)照。

1.3.3 固定化青霉素酰化酶對(duì)熒光假單胞菌生物被膜的影響

1） 酶標(biāo)板法測(cè)定生物被膜 將過(guò)夜培養(yǎng)的熒光假單胞菌，按1∶100 的體積比接種于LB 肉湯中，分裝至無(wú)菌離心管，每管4 mL，加入終質(zhì)量濃度為0，2.5，5，10，15，20，25 mg/mL 的固定化青霉素?；?，培養(yǎng)36 h，以沒(méi)有加酶為對(duì)照，每組3次重復(fù)，具體參照孫曉佳等[16]的方法。取菌液測(cè)定波長(zhǎng)595 nm 處的菌液密度后，棄去菌液，用無(wú)菌水清洗3 次，無(wú)菌風(fēng)干燥30 min，使生物被膜固定在離心管內(nèi)壁后，取1 mL 0.2%的結(jié)晶紫染色15 min。棄去染色液，無(wú)菌水清洗3～5 次至干凈透明。用33%（φ）冰乙酸溶解固定著的染色液。用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)595 nm 下的吸光度，每處理組取3 個(gè)平行。生物被膜的相對(duì)生成率按公式（1）計(jì)算：

2） 光學(xué)顯微鏡觀察固定化青霉素?；笇?duì)生物被膜形態(tài)的影響 載玻片（普通載玻片，25.4 mm×76.2 mm，厚度1～2 mm）預(yù)處理：置于體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液中浸泡24 h 后，用蒸餾水洗凈、烘干，滅菌備用。

在無(wú)菌培養(yǎng)皿中加入10 mL 含有1%熒光假單胞菌的LB 肉湯，并分別加入終質(zhì)量濃度為0，2.5，5，10，15，20，25 mg/mL 的固定化青霉素?；福旌暇鶆蚝蠓湃胩幚砗蟮妮d玻片，28 ℃靜置培養(yǎng)36 h。同時(shí)，設(shè)立沒(méi)有添加酶的陰性對(duì)照組。36 h 后取出載玻片，無(wú)菌水沖洗，除去浮游菌及黏液，置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，加入適量甲醇固定15 min，再加入適量2%結(jié)晶紫溶液染色5 min 后，用無(wú)菌水沖洗干凈，室溫下干燥，干燥后在光學(xué)顯微鏡下觀察，拍照記錄。

3） 掃描電鏡觀察固定化青霉素?；笇?duì)生物被膜形態(tài)的影響 將載玻片換成鋅片，前期操作同1.3.3（2），培養(yǎng)36～48 h。結(jié)束后用無(wú)菌水反復(fù)沖洗，洗去表面的浮菌。將鋅片放入4 ℃預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液中浸泡4 h，取出用50%，70%，80%，90%，100%的乙醇梯度脫水，自然干燥后噴金處理，用掃描電子顯微鏡觀察。

1.3.4 固定化青霉素?；笇?duì)熒光假單胞菌胞外蛋白酶活力的影響 參照趙陽(yáng)潔[17]的方法稍作改動(dòng)，制作牛奶平板，用牛津杯打孔，加入用不同質(zhì)量濃度（2.5，5，10，15，20，25 mg/mL）的固定化青霉素酰化酶過(guò)夜培養(yǎng)的熒光假單胞菌上清液，28℃靜置培養(yǎng)18～24 h。蛋白酶水解酪蛋白后，在孔周?chē)霈F(xiàn)明顯的水解圈，水解圈越大，說(shuō)明胞外蛋白酶活力越高。以不加固定化青霉素?；傅纳锨逡簽殛幮詫?duì)照。

1.3.5 GC-MS 測(cè)定固定化青霉素?；笇?duì)熒光假單胞菌產(chǎn)AHLs 的影響 參照張清霞等[18]的方法稍作修改，熒光假單胞菌用400 mL LB 肉湯培養(yǎng)。在28 ℃，160 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h，5 000 r/min離心30 min 去沉淀，等體積乙酸乙酯（含體積分?jǐn)?shù)0.1%冰乙酸溶液） 萃取，35 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)有機(jī)相后，用2 mL 甲醇溶解，粗提液保存于-20 ℃?zhèn)溆?。向上述粗提液中加入固定化青霉素?；甘蛊浣K質(zhì)量濃度為25 mg/mL，以不添加固定化青霉素?；笧閷?duì)照。28 ℃作用40 min 后，將樣品用有機(jī)濾膜過(guò)濾于GC-MS 檢測(cè)確定加酶前、后AHLs 的變化情況。參照孫曉佳[19]的方法設(shè)置GC-MS條件。

1.3.6 分子對(duì)接分析青霉素酰化酶與AHLs 的相互作用 將PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的青霉素?；福óa(chǎn)自巨大芽孢桿菌）6nvy 的3D 結(jié)構(gòu)，使用Discovery Studio（DS）軟件進(jìn)行3D 蛋白結(jié)構(gòu)的優(yōu)化。從ZINC 數(shù)據(jù)庫(kù) （http：//zinc.docking.org/） 中得到C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL、C14-HSL 的3D 結(jié)構(gòu)，在DS 軟件中優(yōu)化結(jié)構(gòu)后，采用半柔性對(duì)接分析酶和配體之間的作用方式，以及酶對(duì)不同碳鏈的AHLs 的作用差異[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化青霉素?；窺S 抑制活性的確定

經(jīng)過(guò)測(cè)定培養(yǎng)結(jié)束后的菌液密度，發(fā)現(xiàn)添加不同質(zhì)量濃度的固定化青霉素酰化酶對(duì)熒光假單胞菌的生長(zhǎng)沒(méi)有影響。因此直接選取培養(yǎng)后的上清液加入孔中與培養(yǎng)基中的CV026 作用，結(jié)果如圖1所示。當(dāng)熒光假單胞菌同25 mg/mL 的固定化青霉素酰化酶培養(yǎng)后，使得CV026 產(chǎn)生紫色菌素不明顯，說(shuō)明固定化青霉素酰化酶可能減少了熒光假單胞菌中的信號(hào)分子的產(chǎn)量。

圖1 固定化青霉素?；笇?duì)CV026 紫色菌素的抑制作用Fig.1 Inhibition of immobilized penicillin acylase on CV026

2.2 固定化青霉素酰化酶對(duì)CV026 紫色菌素產(chǎn)生的影響及最小抑紫濃度的確定

通過(guò)觀察CV026 產(chǎn)紫色菌素的差異性能夠看出不同酶濃度對(duì)QS 的干擾程度不同，從圖2a中能夠直觀看出酶添加量越多紫色越淺，說(shuō)明固定化?；傅腝SI 活性呈劑量依賴(lài)性。從顏色變化來(lái)看，與不加酶的對(duì)照組相比，5 mg/mL 固定化青霉素?；柑幚砜梢悦黠@降低紫色菌素的產(chǎn)量。從圖2b 可知，隨著酶質(zhì)量濃度的增大，紫色菌素逐漸減少，當(dāng)酶質(zhì)量濃度為25 mg/mL 時(shí)，對(duì)紫色菌素的抑制率達(dá)到38.63%，由此推斷固定化青霉素?；缚赏ㄟ^(guò)干擾QS 現(xiàn)象，使得在外源AHLs 存在的情況下，抑制CV026 紫色菌素的產(chǎn)生?？梢酝茰y(cè)固定化青霉素?；缚赏ㄟ^(guò)降解AHLs 達(dá)到抑制腐敗菌間信息交流的目的，從而減少致腐因子的產(chǎn)生以達(dá)到水產(chǎn)品保鮮的效果。

圖2 固定化青霉素酰化酶對(duì)CV026 的QSI 效應(yīng)Fig.2 QSI effect of immobilized penicillin acylase on CV026

2.3 固定化青霉素?；笇?duì)熒光假單胞菌生物被膜的影響

2.3.1 固定化青霉素酰化酶對(duì)熒光假單胞菌生物被膜形成量的影響 生物被膜的形成是水產(chǎn)品污染的常見(jiàn)來(lái)源。研究發(fā)現(xiàn)有氧冷凍條件下貯藏時(shí)，QS 會(huì)參與新鮮肉制品的腐敗以及其表面生物被膜的形成[21]。從腐敗食品中分離到的熒光假單胞菌具有快速產(chǎn)生生物膜的特性[22]。從圖3中可看出，固定化青霉素?；傅奶砑硬](méi)有對(duì)熒光假單胞菌的生長(zhǎng)造成影響，隨著酶質(zhì)量濃度的升高，生物膜的生成率逐漸減小，當(dāng)酶質(zhì)量濃度為25 mg/mL 時(shí)，對(duì)生物被膜形成的抑制率達(dá)到57.41%。由此可知固定化?；改軌蛴行б种茻晒饧賳伟锬さ男纬?，減少其在水產(chǎn)品表面定殖。

圖3 不同質(zhì)量濃度固定化青霉素?；笇?duì)熒光假單胞菌生物被膜形成率的影響Fig.3 Effects of different mass concentrations of immobilized penicillin acylase on biofilm formation rate of P.fluorescens

2.3.2 固定化青霉素酰化酶對(duì)熒光假單胞菌生物被膜形態(tài)的影響 通過(guò)光學(xué)顯微鏡可以觀察到不同質(zhì)量濃度的固定化青霉素?；概囵B(yǎng)后的熒光假單胞菌生物被膜形態(tài)的微觀結(jié)構(gòu)。從圖4a 可看出隨著固定化青霉素?；纲|(zhì)量濃度的升高，生物膜的形成量逐漸減少。未加固定化青霉素酰化酶的熒光假單胞菌的生物被膜中密布的菌體連接成緊密的膜狀物。隨著酶濃度的升高，菌體越來(lái)越稀疏，生物被膜的產(chǎn)量難以在載體上牢固附著，因此菌體無(wú)法聚集形成膜狀物。由此推斷固定化青霉素?；改軌蚪档蜔晒饧賳伟锉荒さ男纬闪?，從而減少其在水產(chǎn)品表面的附著，從而達(dá)到延緩腐敗的效果。

圖4 固定化青霉素酰化酶對(duì)熒光假單胞菌生物被膜的影響Fig.4 Light microscope observation of the effect of immobilized penicillin acylase on P.fluorescens biofilm

通過(guò)掃描電鏡能夠更加直觀的觀察到生物膜表面的結(jié)構(gòu)情況。從圖4b 中可看出沒(méi)有加酶的對(duì)照組菌體形態(tài)最為致密，結(jié)構(gòu)均勻，具有一定的層次感，無(wú)法看到單一菌體。添加不同質(zhì)量濃度固定化青霉素?；概囵B(yǎng)后，隨著酶質(zhì)量濃度增大，生物被膜出現(xiàn)了破裂，失去原有的立體網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，單一菌體周?chē)哪ぐ鼑鸂钗镏饾u消失，當(dāng)酶質(zhì)量濃度為25 mg/mL 時(shí)，出現(xiàn)了明顯單菌，表明固定化青霉素?；改軌蛴行p弱熒光假單胞菌的成膜能力。與生物被膜形成量的測(cè)定結(jié)果一致，證實(shí)了固定化青霉素?；笇?duì)熒光假單胞菌生物被膜的影響，推測(cè)其可能通過(guò)調(diào)控了QS 相關(guān)基因的表達(dá)，有效減少了胞外聚合物的生成。

2.4 固定化青霉素?；笇?duì)熒光假單胞菌胞外蛋白酶活性的影響

假單胞菌具有較強(qiáng)的水解蛋白質(zhì)和脂肪的能力，可以產(chǎn)生吲哚、苯酚、腐胺、尸胺、硫化氫等有毒物質(zhì)，并導(dǎo)致水產(chǎn)品產(chǎn)生感官不可接受性的黏液、異味[23]。通過(guò)測(cè)定胞外蛋白酶的變化，能夠了解固定化青霉素?；笇?duì)熒光假單胞菌胞外酶蛋白酶表達(dá)量的影響。試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，隨著酶質(zhì)量濃度的增加，透明圈逐漸減小，且當(dāng)添加15 mg/mL 酶后，可以完全抑制胞外蛋白酶的活性。由于QS 是一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)，可能通過(guò)調(diào)控編碼胞外蛋白酶的基因轉(zhuǎn)錄來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)胞外蛋白酶表達(dá)的干預(yù)[24]。Li 等[25]發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌中的QS 系統(tǒng)會(huì)干預(yù)其3 種胞外蛋白酶的表達(dá)，通過(guò)構(gòu)建QS 突變體研究，表明QS 系統(tǒng)不只是通過(guò)轉(zhuǎn)錄來(lái)調(diào)節(jié)這些蛋白酶的活性，即使這些蛋白酶從細(xì)胞中分泌出來(lái)，QS 系統(tǒng)仍然控制著它們的活性。基于固定化青霉素?；傅墓δ?，可以推測(cè)通過(guò)淬滅AHLs可抑制胞外蛋白酶的表達(dá)，而不影響其活性。

圖5 固定化青霉素酰化酶對(duì)熒光假單胞菌胞外蛋白酶活性的影響Fig.5 The effect of immobilized penicillin acylase on the extracellular protease activity of P.fluorescens

2.5 GC-MS 測(cè)定固定化?；笇?duì)熒光假單胞菌分泌AHLs 的影響

通過(guò)GC-MS 可以直觀看出樣品中AHLs 的變化。從圖6a 中可以看出供試菌株熒光假單胞菌主要產(chǎn)3 種信號(hào)分子，根據(jù)課題組前期的研究結(jié)果表明，出峰時(shí)間在6，8，11 min 左右所對(duì)應(yīng)的AHL 分別為C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL。由圖6b 中可看出3 種AHLs 都有下降趨勢(shì)，其中C8-HSL 下降最多，說(shuō)明固定化青霉素?；笇?duì)C8-HSL 的降解活性最強(qiáng)。張爭(zhēng)等[26]從植物病原菌青枯菌中鑒定出了的1 種AHL ?；窤ac 淬滅細(xì)菌的群體感應(yīng)信號(hào)，控制細(xì)菌性病害，對(duì)C8-HSL 有較強(qiáng)的淬滅活性。

圖6 GC-MS 檢測(cè)固定化青霉素?；笇?duì)熒光假單胞菌產(chǎn)AHLs 的影響Fig.6 Effect of immobilized penicillin acylase on AHLs production by P.fluorescens detected by GC-MS

2.6 分子對(duì)接分析青霉素酰化酶與AHLs 的相互作用

分子對(duì)接是借助計(jì)算機(jī)模擬酶與底物之間的相互作用，預(yù)測(cè)其結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合強(qiáng)度。通過(guò)將酶與不同的底物對(duì)接可預(yù)測(cè)出與酶有相互作用的底物，為下一步試驗(yàn)驗(yàn)證提供理論依據(jù)。從表1可看出不同碳鏈的AHLs 與酶對(duì)接的打分情況，其中C14-HSL 的打分最高。有研究表明已知的大多數(shù)細(xì)菌AHL ?；甘荖 端親核酶（Ntn）-水解酶的成員，這類(lèi)酶由多種酶組成，它們識(shí)別不同種類(lèi)的底物，然而具有共同的性質(zhì)，如自動(dòng)催化活化、N 端催化親核（蘇氨酸、絲氨酸或半胱氨酸）的存在和酰胺鍵的斷裂，青霉素酰化酶也是其中的一員[28]。具有AHL ?；腹δ艿那嗝顾仵；笇?duì)長(zhǎng)鏈的AHLs 作用效果較好，一般都是含有α 和β 2 個(gè)亞基的二聚體，在α 亞基上都含有1 個(gè)保守的絲氨酸活性位點(diǎn)，該位點(diǎn)與周?chē)陌被釟埢P(pán)曲折疊成一個(gè)疏水結(jié)合囊，更適合與長(zhǎng)鏈AHLs 結(jié)合，因此與短鏈的AHLs 作用力較弱[28]。從表1可知隨著碳鏈長(zhǎng)度的增加，分值越來(lái)越大，說(shuō)明該酶的最佳底物更偏向于長(zhǎng)鏈AHLs。

圖7 固定化青霉素?；笇?duì)熒光假單胞菌AHLs 的影響Fig.7 Effect of immobilized penicillin acylase on AHLs of P.fluorescens

表1 青霉素?；福óa(chǎn)自巨大芽孢桿菌）與AHLs 分子對(duì)接打分Table 1 Molecular docking score of penicillin acylase （from Bacillus megaterium） and AHLs

從上述打分結(jié)果中選擇短鏈、中長(zhǎng)鏈、長(zhǎng)鏈3種AHLs 進(jìn)行作用力分析，結(jié)果見(jiàn)圖8。圖中呈現(xiàn)了青霉素酰化酶6nvy 與C4-HSL、C8-HSL、C14-HSL 對(duì)接的活性位點(diǎn)2D 圖?？梢钥闯鯝HLs 與酶之間的相互作用力，C4-HSL 與活性位點(diǎn)中A 鏈的天冬酰胺形成2 個(gè)氫鍵；C8-HSL 與活性位點(diǎn)中A鏈上的絲氨酸和天冬酰胺形成3 個(gè)氫鍵，與纈氨酸形成1 個(gè)碳?xì)滏I；C14-HSL 與活性位點(diǎn)中A 鏈上的蘇氨酸、酪氨酸和絲氨酸形成3 個(gè)碳?xì)滏I。僅依靠2D 圖無(wú)法確定酶與底物間的空間構(gòu)象，也無(wú)法確定酶對(duì)長(zhǎng)鏈AHLs 偏好的原因，故又對(duì)C4-HSL 和C14-HSL 與酶結(jié)合的3D 圖進(jìn)行分析。

圖8b 分別顯示了短鏈和長(zhǎng)鏈AHL 與青霉素?；阜肿訉?duì)接的3D 圖，從中可看出C4-HSL 與酶的結(jié)合沒(méi)有C14-HSL 緊密。C14-HSL 被結(jié)合囊周?chē)陌被釟埢堪嗷ヒ詺滏I連接，與C4-HSL 相比，氫鍵的數(shù)量較多。可能是由于C14-HSL 具有更長(zhǎng)的碳鏈，能夠形成更多氫鍵。

圖8 青霉素?；?nvy 與AHLs 結(jié)合活性位點(diǎn)示意圖Fig.8 Schematic diagram of binding active sites of penicillin acylase 6nvy with AHLs

3 結(jié)論

本文研究了固定化青霉素?；福óa(chǎn)自巨大芽孢桿菌）對(duì)熒光假單胞菌的QS 抑制作用。通過(guò)紫色桿菌CV026 驗(yàn)證了不同質(zhì)量濃度固定化青霉素?；笇?duì)熒光假單胞菌AHLs 的抑制作用，表明酶的加入能夠使紫色菌素的產(chǎn)量減少，當(dāng)質(zhì)量濃度為25 mg/mL 時(shí)，抑制率達(dá)到38.63%。在酶的作用下，熒光假單胞菌的生物被膜和胞外蛋白酶活力均受到影響，且呈濃度依賴(lài)性，當(dāng)酶質(zhì)量濃度為25 mg/mL 時(shí)，對(duì)生物被膜形成的抑制率達(dá)到57.41%；當(dāng)酶質(zhì)量濃度為15 mg/mL 時(shí)，完全抑制了胞外蛋白酶的活性，推測(cè)是由于酶的加入干擾了熒光假單胞菌的QS 系統(tǒng)，使得蛋白酶的表達(dá)受到影響。GC-MS 結(jié)果表明，酶能夠降低熒光假單胞菌的AHLs，從而進(jìn)一步證明酶是通過(guò)與AHLs作用來(lái)干擾QS。分子對(duì)接結(jié)果表明酶對(duì)長(zhǎng)鏈和短鏈AHLs 都有作用，然而更偏好長(zhǎng)鏈AHLs。3D 對(duì)接圖顯示酶的活性中心會(huì)與C14-HSL 形成更多的氫鍵，從而增大兩者間的相互作用。前人已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)多種青霉素?；付加写銣鏏HLs 的作用，并且已經(jīng)利用蛋白質(zhì)工程的方法來(lái)生產(chǎn)更加穩(wěn)定、特異性和活性更強(qiáng)的AHLs 淬滅酶[29]，本文中酶與熒光假單胞菌的AHLs 作用后的產(chǎn)物還未清晰，需要進(jìn)一步驗(yàn)證其作用機(jī)理。