徐曉飛，趙明月，鐘興偉，何瑞琪

（1 廣東海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 廣東陽江 529599 2 華南協(xié)同創(chuàng)新研究院 廣東東莞 523808 3 幾何細(xì)胞生物研究中心 廣東東莞 523808）

皮膚中膠原蛋白分布于真皮層，含量約為70%，主要為I 型膠原蛋白（85%），其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)為真皮提供了支撐和保護(hù)[1]。膠原蛋白可被基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metallo-proteinase，MMPs）降解，紫外線和自由基會使膠原蛋白變性，美拉德反應(yīng)使糖類和膠原蛋白發(fā)生反應(yīng)形成糖基化產(chǎn)物，在皮膚中表現(xiàn)為紋路紊亂、發(fā)黃和失去彈性等衰老表現(xiàn)[2]。膠原蛋白降解成膠原蛋白肽，分子質(zhì)量范圍從數(shù)百到上萬道爾頓不等。在體外試驗中，膠原蛋白肽對多種自由基具有清除作用[3-4]。在動物實驗中，補充的膠原蛋白水解物通過抑制MMP2 酶活性來提高皮膚膠原蛋白含量[5]，以及提高機體抗氧化酶系統(tǒng)活性，如超谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）、氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT），以降低皮膚光老化損傷[6]。在2 項隨機雙盲、安慰劑對照設(shè)計考察補充膠原蛋白肽作用的研究中，年齡介于35～65 歲的女性人群日常補充膠原蛋白肽，能改善皮膚健康狀態(tài)，如增加彈性和水分，提高I 型膠原蛋白原和彈性蛋白含量，減少皺紋[7-8]。這些生理功能特性，使膠原蛋白肽成為廣泛使用的美容功能原料，以及日常保健抵抗皮膚老化的手段。在美容功能食品中，膠原蛋白肽常與其它成分，如果汁、中藥、透明質(zhì)酸等，配伍使用[9-11]，其目的包括增強美容效果，使功效面更廣或產(chǎn)品差異化。

銀耳（Tremella fuciformis Berk.）又稱白木耳、雪耳，是一種高等大型食用真菌。中醫(yī)認(rèn)為銀耳具有滋陰潤肺、益氣和血的作用，是公認(rèn)具有美容養(yǎng)顏作用、有悠久食用歷史的食材。銀耳多糖（T.fuciformis polysaccharides）是銀耳中含量豐富的活性成分，研究表明銀耳多糖具有免疫調(diào)節(jié)與抗腫瘤，抗氧化和抗衰老，神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)等多種活性[12]。因其來源天然、活性突出，故銀耳多糖在功能性食品領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[13]。

膠原蛋白肽和銀耳多糖為大眾熟知、功效突出的美容抗衰老食品原料。然而，兩者配伍的功效研究卻少見?；诖?，本文將2 種成分按一定比例復(fù)合，研究其對D-半乳糖致衰老小鼠模型皮膚中羥脯氨酸和透明質(zhì)酸含量，組織中氧化應(yīng)激壓力和炎癥因子水平的影響，并分析腸道SCFAs 變化，探索可能作用機理，為銀耳多糖和膠原蛋白肽配伍用于美容抗衰老功能性食品提供實驗證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 體質(zhì)量（18±2）g、4 周齡的SPF級昆明雄性小鼠，采購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心[合格證號SCXK（粵）2018-0002]。

1.1.2 試劑 膠原蛋白肽 （型號PEPTIPLUS XB），嘉莉達(dá)明膠有限公司；銀耳多糖（平均分子質(zhì)量500 ku），博士生物科技（廣州）有限公司；D-半乳糖（99%）、乙酸（99.8%）、丙酸（99.5%）、異丁酸（99.5%）、丁酸（99.5%）、異戊酸（99%）、戊酸（99%），上海麥克林公司；SOD、GSH-Px、MDA（Malondialdehyde）測定試劑盒，南京建成生物科技有限公司；小鼠透明質(zhì)酸、羥脯氨酸、IL-1β、TNF-α 試劑盒（ELISA 法），江蘇酶免實業(yè)有限公司，磷酸鹽（PBS）緩沖液，Gibco 公司；二辛可寧酸（BCA）蛋白定量試劑盒、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、RIPA 裂解液，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；其它試劑為國產(chǎn)分析純級。

1.2 儀器和設(shè)備

高速冷凍離心機（型號SIGMA3-18K），德國SIGMA 公司；酶標(biāo)儀（型號ELx800），美國BioTek公司；中低通量組織研磨器 （型號TissueLyser LT），德國QIAGEN；氣相色譜儀 （型號GC-2010PLUS），島津儀器公司；毛細(xì)管色譜柱（型號DB-FATWAX），安捷倫儀器公司；pH 計 （型號Five Easy Plus），瑞士梅特勒；恒溫水浴箱，富華儀器有限公司；電子天平（型號BS224S），賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物實驗方法 動物在SPF 實驗室（GB 14925-2010）：室溫（22±2）℃、60～80%RH、12 h 光/暗循環(huán)（許可證編號為SYXK（粵）2018-0085）。實驗程序符合中國有關(guān)實驗動物使用和護(hù)理的法規(guī)，實驗倫理經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。小鼠攝入標(biāo)準(zhǔn)飼料、自由飲水，適應(yīng)SPF 環(huán)境2 周后，32 只小鼠隨機分4 組：正常組（Normal，n=8）灌胃生理鹽水，模型組（Model，n=8）灌胃生理鹽水，膠原蛋白肽組（CP，n=8）灌胃膠原蛋白肽劑量830 mg/（kg·d），膠原蛋白組復(fù)合銀耳多糖組（Collagen peptide combined with TFPs，CPTP）灌胃劑量：膠原蛋白肽830 mg/（kg·d）+銀耳多糖100 mg/（kg·d），n=8。Model 組、CP 組和CPTP 組每天上午腹腔注射D-半乳糖120 mg/kg[14-15]，Normal 組腹腔注射生理鹽水；實驗組每天下午灌胃實驗樣品，Model組及Normal 組灌胃生理鹽水。實驗持續(xù)8 周。最后一次灌胃樣品后，小鼠禁食12 h、自由飲水。第2 天麻醉后眼眶取血，在4 ℃下5 000×g 離心15 min 獲得血清。最后安樂死處死小鼠，小鼠背側(cè)部脫毛后，取皮膚組織約1 cm2（避免帶入白色脂肪組織），放入液氮中速凍；快速剖取心、肝組織用預(yù)冷的PBS 漂洗去除血液，然后放入液氮中速凍；在冰上收集小腸和結(jié)腸內(nèi)容物，放入液氮中速凍。所有樣品-80 ℃保存，在2 個月內(nèi)完成檢測。

取血清樣本按SOD、GSH-Px、MDA 試劑盒和小鼠IL-1β、TNF-α ELISA 試劑盒操作說明分別測定相應(yīng)指標(biāo)。

取小鼠肝、心臟組織用組織勻漿器加4 ℃PBS 制備成10%勻漿液，4 ℃下以5 000×g 離心15 min 取上清，用蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量，再分別按照試劑盒操作說明測定上清液中SOD、GSH-Px活力和MDA 濃度[15]。

取小塊小鼠皮膚組織用丙酮-乙醚（1∶1）脫除脂肪、切碎、晾干，然后精密稱取20 mg，按小鼠透明質(zhì)酸、羥脯氨酸試劑盒操作說明測定樣本中羥脯氨酸和透明質(zhì)酸水平[15]。

1.3.2 小腸、結(jié)腸內(nèi)容物pH 檢測 用超純水分別將解凍后的小腸、結(jié)腸內(nèi)容物以質(zhì)量比1∶1 稀釋，然后用pH 計測定[15-16]。

1.3.3 小腸、結(jié)腸內(nèi)容物中SCFAs 測定 參考文獻(xiàn)[15]和[17]報道方法，用1.5 mL 磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）將100 mg 腸道內(nèi)容物均質(zhì)，并于5 000×g離心10 min，取1 mL 上清液添加0.5 mL 體積分?jǐn)?shù)50%的硫酸酸化，隨后加入2 mL 乙醚進(jìn)行有機萃取，在5 000×g 下離心5 min，取上清液過0.22 μm 濾膜后注入氣相色譜儀。色譜柱為DB-FATWAX 毛細(xì)管柱（30 m）。氣相色譜設(shè)置：初始溫度120 ℃，保持2 min，5 ℃/min 升至140 ℃保持3 min，然后10 ℃/min 升至170 ℃保持5 min；進(jìn)樣口250 ℃，檢測器250 ℃，分流比25 ∶1，高純氦氣（99.99%）設(shè)定流量為1.8 mL/min。乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸、正戊酸、異戊酸標(biāo)準(zhǔn)品用超純水分別制備標(biāo)準(zhǔn)品溶液，同法測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。組間比較采用one-way ANOVA 和Tukey 檢驗，采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，P ＜0.05 表示差異顯著，P ＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 對小鼠一般體征的影響

在整個實驗期間，各組小鼠攝食、日?；顒诱＃靼肴樘亲⑸浣M的小鼠皮毛光澤相比Normal組小鼠較差，而CP 組和CPTP 組小鼠皮毛光澤比Model 組小鼠好。在8 周內(nèi)，各組小鼠體質(zhì)量緩慢增加，組間體質(zhì)量無明顯差別（P ＞0.05），表明造模藥物和樣品對小鼠機能無明顯副作用（圖1）。

圖1 實驗期間各組小鼠體質(zhì)量的變化Fig.1 Changes in body weight during the period of experiment

2.2 對小鼠皮膚中羥脯氨酸和透明質(zhì)酸含量的影響

連續(xù)8 周D-半乳糖處理極顯著降低了Model組小鼠皮膚中羥脯氨酸和透明質(zhì)酸含量（P＜0.01）（見圖2），加速了皮膚衰老，而CP、CPTP 灌胃后極顯著提高了模型小鼠老化皮膚中羥脯氨酸和透明質(zhì)酸含量 （CP vs.Model，CPTP vs.Model，P＜0.01）。特別地，CPTP 組小鼠皮膚中羥脯氨酸和透明質(zhì)酸含量極顯著高于CP 組 （CPTP vs.CP，P＜0.01），表明膠原蛋白肽復(fù)配銀耳多糖后抗皮膚衰老活性明顯提升（圖2）。

圖2 實驗樣品對小鼠皮膚羥脯氨酸（a）和透明質(zhì)酸（b）含量的影響Fig.2 Influences of experiment samples on the contents of hydroxyproline （a） and hyaluronic acid （b） in skin

2.3 對組織中GSH-Px、SOD 活性和MDA 含量的影響

如圖3所示，與Normal 組相比，Model 組的GSH-Px 和SOD 活力極顯著降低，而MDA 極顯著增加（P＜0.01）（在血清、肝臟、心臟組織），進(jìn)一步證明D-半乳糖處理后衰老小鼠造模成功。顯然，CP 組、CPTP 組則可以明顯提高衰老小鼠體內(nèi)GSH-Px 活性（CP vs.Model，CPTP vs.Model，P＜0.01），而兩者作用效果無差異（圖3a）。同樣地，CP組和CPTP 組能極明顯提高衰老小鼠各組織中SOD 活力（P＜0.01）；然而在肝臟、心臟組織中，CPTP 組的SOD 活力卻比CP 組更低（P＜0.01）（圖3b）。對脂質(zhì)過氧化物MDA 濃度的比較，CP 組和CPTP 組的組織中MDA 濃度均比Model 組極顯著降低（P＜0.01），與組織中GSH-Px、SOD 活力上升結(jié)相吻合；在肝臟部位，CPTP 組的MDA 濃度比CP 組更低（P＜0.05）。

圖3 實驗樣品對血清、肝臟、心臟組織氧化壓力的影響Fig.3 Influences of experiment samples on oxidative stress in serum，liver，and heart tissues in mice

2.4 對IL-1β 和TNF-α 濃度的影響

由圖4可知，相比Normal 組小鼠，Model 組小鼠炎性細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α 水平極顯著上升（P＜0.01），表明Model 組小鼠體內(nèi)有高水平炎癥。CP 組和CPTP 組灌胃處理明顯降低了小鼠血清中IL-1β、TNF-α 濃度 （CP vs.Model，CPTP vs.Model，P＜0.01）；特別地，相比CP 組，CPTP 組的IL-1β、TNF-α 濃度更低（P＜0.01），表明CPTP 組對炎性細(xì)胞因子分泌抑制作用比CP 組強（圖4）。

圖4 實驗樣品對小鼠IL-1β、TNF-α 含量的影響Fig.4 Influences of experiment samples on the contents of IL-1β，TNF-α in serum in mice

2.5 小鼠腸道pH 值和SCFAs 的變化

pH 值表明小鼠小腸環(huán)境內(nèi)呈弱堿性，且各組小腸內(nèi)pH 值無明顯差別（圖5）；在結(jié)腸內(nèi)則表現(xiàn)為弱酸性（pH＜7），Model 組小鼠結(jié)腸內(nèi)pH 值顯著低于Normal 組小鼠（P＜0.01），而CP 組、CPTP 組小鼠極顯著高于Model 組小鼠（P＜0.01），表明CP組、CPTP 組能提高衰老小鼠結(jié)腸內(nèi)pH 值。進(jìn)一步利用氣相色譜檢測腸道中6 種主要SCFAs 的濃度，在小腸內(nèi)沒有檢出SCFAs，在結(jié)腸內(nèi)乙酸和丙酸是主要的SCFAs，其次是正丁酸，而異丁酸、正戊酸、異戊酸濃度均較低（圖6）。在總SCFAs 方面，Model 組小鼠總SCFAs 濃度顯著升高（Model vs.Normal，P＜0.05），這個結(jié)果與Model 組在結(jié)腸內(nèi)低pH 值的趨勢吻合；而CP 組、CPTP 組總SCFAs 與Model 組并無明顯差異。與Normal 組比較，Model 組異丁酸含量明顯升高（P＜0.01），而其余5種SCFAs 含量無明顯差異（圖6）。與Model 組比較，CP 組乙酸濃度提高（P＜0.05），提示膠原蛋白肽能增加衰老小鼠結(jié)腸內(nèi)乙酸濃度，而其余SCFAs 濃度各組間并無明顯差別（圖6），這些結(jié)果提示CP 組、CPTP 組對結(jié)腸內(nèi)SCFAs 濃度無明顯調(diào)節(jié)作用。

圖5 實驗樣品對小腸和結(jié)腸pH 值的影響Fig.5 Influences of experiment samples on pH value in small intestine and colon in mice

圖6 實驗樣品對結(jié)腸總SCFAs（a）和6 種SCFAs（b）含量的影響Fig.6 Influences of experiment samples on the contents of total SCFAs （a） and six subtypes of SCFAs （b） in colon in mice

3 討論

在本研究中，利用D-半乳糖致衰小鼠模型，發(fā)現(xiàn)膠原蛋白肽復(fù)合銀耳多糖對小鼠衰老皮膚中羥脯氨酸（膠原蛋白特征氨基酸）和透明質(zhì)酸含量改善作用優(yōu)于膠原蛋白肽，同時可明顯提高機體的抗氧化能力，降低機體炎癥水平，表明膠原蛋白肽復(fù)合銀耳多糖后，具有明顯抗衰老活性優(yōu)勢。

衰老是自然界中生物遵循的普遍規(guī)律。在機體衰老進(jìn)程中，機體抗氧化系統(tǒng)能力下降（包括抗氧化酶和抗氧化物質(zhì)），從而對ROS（Reactive oxygen species）清除能力降低，造成ROS 在細(xì)胞內(nèi)堆積，損害細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整和功能發(fā)揮，并進(jìn)一步加速衰老[18]。人體衰老伴隨皮膚膠原蛋白和透明質(zhì)酸含量的下降[19-20]。膠原蛋白肽具有良好的ROS 清除作用[21]，以及通過抑制內(nèi)源性抗氧化酶的耗竭，表現(xiàn)出抗氧化活性[22]。同時，人體臨床研究發(fā)現(xiàn)口服膠原蛋白肽能提高皮膚膠原蛋白原的含量[8]。這些研究報道與本實驗結(jié)果一致。此外，已有研究表明銀耳多糖可提高衰老小鼠體內(nèi)抗氧化酶，如SOD、GSH-Px 的活力，增加衰老皮膚中羥脯氨酸和透明質(zhì)酸含量[14]。在本研究中，對D-半乳糖致衰老小鼠模型皮膚中羥脯氨酸和透明質(zhì)酸含量檢測結(jié)果表明，CPTP 對衰老皮膚中羥脯氨酸和透明質(zhì)酸含量提升作用明顯優(yōu)于單一膠原蛋白肽，表明膠原蛋白肽復(fù)配銀耳多糖可能具有一定協(xié)同作用，值得進(jìn)一步深入研究。相比膠原蛋白肽，膠原蛋白肽復(fù)合銀耳多糖對機體中GSH-Px 活力并沒有進(jìn)一步提升，甚至反而使得SOD 活力出現(xiàn)下降現(xiàn)象，一方面表明CPTP 組小鼠體內(nèi)的ROS 積累水平可能低于CP 組，另一方面也提示實驗組小鼠衰老皮膚中羥脯氨酸和透明質(zhì)酸含量的增加并非是提升機體抗氧化能力的單獨作用。

除ROS 過量積累外，慢性炎癥也是加速機體衰老的元兇之一，衰老機體伴隨著高水平的炎性細(xì)胞因子[23]?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一類受Zn2+、Ca2+調(diào)控的蛋白水解酶，MMPs 具有降解細(xì)胞外基質(zhì)所有成分，如膠原、黏性蛋白、纖維黏連蛋白等的能力[24]。機體在炎癥狀態(tài)下，MMPs 活性增加[24]，造成胞外基質(zhì)降解增加。在D-半乳糖所致衰老小鼠模型中，炎性因子IL-1β 和TNF-α 水平顯著增加，表明衰老模型小鼠處于炎癥狀態(tài)。在本實驗中，膠原蛋白肽表現(xiàn)出一定的抗炎活性，作用機理可能與其調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號抑制NF-κB 的表達(dá)有關(guān)[22]。當(dāng)膠原蛋白肽復(fù)合銀耳多糖后，衰老小鼠體內(nèi)炎性細(xì)胞因子水平大大降低，證明實驗復(fù)合物抗炎效果優(yōu)于單一膠原蛋白肽。據(jù)報道，在體外實驗中，發(fā)現(xiàn)銀耳多糖可抑制NF-κB 信號通路和miR155 轉(zhuǎn)錄，從而降低LPS 處理的RAW264.7免疫細(xì)胞內(nèi)ROS 水平和抑制炎性細(xì)胞因子分泌[25]。由此提示，CPTP 可以通過多種方式發(fā)揮抗衰老（降低氧化壓力，抑制炎癥，提高免疫功能等）作用，從而有利于提升衰老皮膚中膠原蛋白和透明質(zhì)酸含量。

在衰老模型小鼠腸道中，結(jié)腸部位pH 值下降、SCFAs 濃度增加。然而，有研究報道，與成年人相比，老年人腸道中SCFAs 濃度降低[26]，提示D-半乳糖所致衰老小鼠模型并不能完全模擬自然衰老狀態(tài)。雖然膠原蛋白肽能增加模型小鼠腸道中乙酸濃度，但膠原蛋白肽和銀耳多糖對模型小鼠腸道中其它類型SCFAs 和總SCFAs 濃度并沒有明顯影響，表明膠原蛋白肽復(fù)合銀耳多糖可能通過非依賴SCFAs 途徑，提高衰老小鼠抗氧化酶活性和發(fā)揮抗炎作用。盡管有許多研究指出非消化性多糖經(jīng)腸道菌群代謝產(chǎn)生的SCFAs 能調(diào)控免疫細(xì)胞發(fā)育、分化和免疫功能響應(yīng)，以及抑制組蛋白脫乙酰酶活（Histone deacetylases）而調(diào)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)[27]。原因可能在于本實驗所使用的銀耳多糖劑量太低，僅100 mg/（kg·d）。有學(xué)者報道，杏鮑菇多糖（Pleurotus eryngii polysaccharide）在400 mg/（kg·d）及以上劑量時，才能明顯提高腸道中SCFAs 的濃度[28]。因此，膠原蛋白肽復(fù)合銀耳多糖提高組織抗氧化酶活性的分子機理需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

利用D-半乳糖致衰小鼠模型，發(fā)現(xiàn)相比單一CP，CPTP 能更有效提高模型小鼠衰老皮膚中羥脯氨酸和透明質(zhì)酸含量，其作用機理可能是通過非SCFAs 依賴途徑，保護(hù)機體抗氧化酶活性和抑制炎性因子表達(dá)作用而實現(xiàn)。本研究為膠原蛋白肽配伍銀耳多糖應(yīng)用于美容和抗氧化功能性食品，提供數(shù)據(jù)支撐。