李 恒，王澤亮，鄧維琴，范智義，李雄波，王鈺潞，李潔芝，張其圣，2*

（1 四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設計院有限公司 成都 611130 2 四川東坡中國泡菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院 四川眉山 620030 3 江南大學 江蘇無錫 214000）

甜瓣子發(fā)酵將為豆瓣醬提供豐富的游離氨基酸、有機酸、揮發(fā)性風味物質(zhì)及多種發(fā)酵微生物，是郫縣豆瓣生產(chǎn)的重要階段之一。目前，甜瓣子多采用高鹽度發(fā)酵，發(fā)酵的鹽度通常為12%～17%，成品豆瓣醬的鹽度高達16%～20%[1]。研究表明攝入過量的鹽分，可能會引起心腦血管、高血壓等疾病[2]。目前我國每人每天平均膳食鹽攝入量為（14.53 ± 11.04）g[3]，遠超過世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦攝入量5 g/d。豆瓣醬等高鹽調(diào)味品為我國膳食鹽分攝入的主要來源，低鹽化已成為其發(fā)展的必然趨勢。對甜瓣子發(fā)酵低鹽化的研究具有重要意義。

低鹽發(fā)酵甜瓣子因體系鹽度較低，其游離氨基酸種類及含量相對較多，且發(fā)酵體系pH 值相對較低，故極易造成生物胺等有害物質(zhì)積累[4]。生物胺是氨基酸在氨基酸脫羧酶的作用下脫羧生成的一類堿性次生代謝產(chǎn)物，過量攝入將造成一定的安全風險[5-6]。使用生物技術(shù)控制發(fā)酵食品中生物胺含量已有較廣泛的研究，如Kung 等[7]、OH 等[8]、Guo 等[9]均對發(fā)酵食品中降解生物胺微生物進行篩選，并研究相關菌株的降解生物胺能力。然而，針對低鹽發(fā)酵甜瓣子體系中產(chǎn)生物胺的菌株及降解菌株的研究相對較少。本研究采用熒光檢測定性分析和高效液相色譜法定量分析，篩選甜瓣子中產(chǎn)生物胺和降解生物胺的菌株，并進行回接驗證，分析含鹽量和降胺菌株對甜瓣子產(chǎn)品安全性的影響，以期為低鹽甜瓣子生物胺含量的控制提供參考。

1 試驗材料

1.1 試劑與儀器

丹磺酰氯、1，7-二氨基庚烷、脯氨酸、鳥氨酸、精氨酸、賴氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸、5-磷酸吡哆醛、硫胺素均為化學純，上海源葉生物科技集團股份有限公司；腐胺、尸胺、酪胺、苯乙胺、組胺、色胺、精胺、亞精胺均為色譜純，上海源葉生物科技集團股份有限公司；氯化鈉、乙腈、乙醚、七水合硫酸鎂、硫酸錳、硫酸亞鐵、磷酸氫二鉀均為分析純，成都科隆化工有限公司；Ezup 柱式真（細）菌基因組DNA 抽提試劑盒，生工生物工程股份有限公司。

126-Ⅱ高效液相色譜，安捷倫科技有限公司；凝膠成像儀，君意電泳有限公司；H2050R-1 離心機，長沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機儀器有限公司；DZKW-4 恒溫水浴鍋，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；ESJ200-4A 型分析天平，沈陽龍騰電子有限公司；SPX-150B-4 生化培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；THZ-82 水浴恒溫振蕩器，常州市中貝儀器有限公司；GeneAmpR9700 型PCR 儀，美國ABI 公司。

1.2 試驗所用培養(yǎng)基

生物胺顯色培養(yǎng)基：參考Sara 等[10]方法略作修改后配制；以生物胺為唯一氮源培養(yǎng)基（BAs）：參考趙佳迪[11]的方法，略作修改后配制。

6%/9%/12%鹽度甜瓣子模擬體系（以100 mL計）：霉瓣子25 g+鹽4.5，9.4，13 g+5-磷酸吡哆醛0.005 g+碳酸鈣0.01 g+70 g 水，混勻121 ℃，15 min 滅菌。

6%鹽度含生物胺的甜瓣子模擬體系（以100 mL 計）：霉瓣子25 g+鹽4.5 g+4 mL 生物胺100 mg/L （8 種）+5-磷酸吡哆醛0.005 g+碳酸鈣0.01 g+70 g 水，混勻121 ℃，15 min 滅菌。

2 試驗方法

2.1 甜瓣子中產(chǎn)生物胺菌株篩選及其不同鹽度下產(chǎn)胺能力研究

2.1.1 產(chǎn)胺菌株篩選 稱取200 g 霉瓣子，加入200 g 飲用水，稱取16 g 食用鹽，整個甜瓣子發(fā)酵體系的鹽度為4%，37 ℃發(fā)酵30 d。稱取10 g 4%鹽度甜瓣子，用生理鹽水逐級稀釋。選取適宜梯度的稀釋液100 μL 分別涂布于含有溴甲酚紫的固體顯色培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)12 h。挑取培養(yǎng)后使培養(yǎng)基變紫的菌株至LB 培養(yǎng)基上分離、純化即為初篩菌株。將初篩菌株接種至液體顯色培養(yǎng)基進行復篩，以不接種菌株的顯色培養(yǎng)基為空白對照。37 ℃過夜培養(yǎng)，挑選培養(yǎng)后培養(yǎng)液明顯變紫的菌株初步判定為產(chǎn)生物胺的菌株。采用生工生物工程股份有限公司基因組DNA 提取試劑盒提取DNA 后，分別利用PCR 擴增16S rDNA、18S rDNA 和ITS 序列，送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進行測序，通過BLAST 比對序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2.1.2 高效液相色譜法測定生物胺含量 參考陳功等[12]建立的HPLC 測定不同樣品生物胺含量的方法，略作修改，洗脫程序如表1所示。

表1 生物胺檢測的洗脫程序Table 1 Elution procedure for biogenic amine detection

采用HPLC 測定樣品生物胺含量，建立標準曲線，根據(jù)標準曲線計算試樣中生物胺的含量，所得含量明顯高于空白組的菌株即確定為產(chǎn)生物胺菌株。

2.1.3 高產(chǎn)生物胺菌株回接至不同鹽度甜瓣子體系產(chǎn)生物胺能力研究 將篩選得到高產(chǎn)生物胺的菌株回接于液體培養(yǎng)基（1 L）中，擴大培養(yǎng)24 h，8 000 r/min，4 ℃低溫離心10 min 得到菌體，以108CFU/g 回接至不同鹽度甜瓣子（6%，9%，12%）模擬體系中；以接種等量無菌水的滅菌甜瓣子模擬體系為空白對照，以該鹽度未滅菌甜瓣子接種等量無菌水為正常發(fā)酵甜瓣子對照，30 ℃恒溫發(fā)酵16 d 后，測定甜瓣子中生物胺含量。

2.2 生物胺降解菌株篩選及降解能力研究

2.2.1 不產(chǎn)生物胺菌株篩選 選取46 株課題組前期從甜瓣子中篩出的不同菌屬菌株為研究對象，分別活化后接種至生物胺液體顯色培養(yǎng)基中，以接種等量無菌水為空白對照。恒溫培養(yǎng)48 h后，挑選顯色培養(yǎng)基不變紫的菌株初步判定為不產(chǎn)生物胺菌株。

2.2.2 降解生物胺菌株篩選及其降解能力測定根據(jù)生物胺在熒光條件發(fā)色，生物胺含量與特定波長下熒光強度呈正相關原理，參考Judite 等[13]方法略作調(diào)整后，建立熒光定性分析樣品中生物胺含量的方法，初步篩選提取液熒光強度弱于空白對照的菌株為可能降解生物胺的菌株。將初篩得到的降解生物胺菌株接種到BAs 培養(yǎng)液中，以接種等量無菌水的BAs 培養(yǎng)液為空白對照，37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h 后，觀察其菌株生長情況并于620 nm 波長下測定其OD 值，測定菌株在以生物胺為唯一氮源的培養(yǎng)基中的生長情況。按上述方法對BAs 培養(yǎng)液提取衍生后，再次測定熒光強度，選取熒光強度弱于空白對照組的菌株為降解生物胺菌株。高效液相色譜測定降胺菌株培養(yǎng)液中生物胺含量，并用公式（1）計算其生物胺降解率。

式中，X——生物胺降解率（%）；C1——空白組中生物胺濃度 （mg/kg）；C2——接種菌株培養(yǎng)后培養(yǎng)液中生物胺濃度（mg/kg）。

2.2.3 降解生物胺菌株回接甜瓣子模擬體系 將篩選菌株回接到6%鹽度甜瓣子模擬體系中，以接種等量無菌水發(fā)酵體系為空白對照，30 ℃發(fā)酵30 d。根據(jù)表2甜瓣子感官評價標準對甜瓣子進行感官評分并采用高效液相色譜測定甜瓣子模擬體系中生物胺含量。

表2 甜瓣子感官評價標準[14]Table 2 Sensory evaluation criteria of sweet petals[14]

2.3 數(shù)據(jù)分析

以上數(shù)據(jù)均做3 個重復樣品，采用Excel、Origin、MEGA7 對數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理及作圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 標準曲線

生物胺標準曲線如表3所示，其回歸系數(shù)R2均≥0.998，可滿足檢測要求。

表3 生物胺標準曲線Table 3 Standard curve of biogenic amines

3.2 產(chǎn)胺菌株篩選結(jié)果

3.2.1 產(chǎn)胺菌株初篩結(jié)果 由于生物胺顯堿性，產(chǎn)胺菌株在顯色培養(yǎng)基中呈現(xiàn)紫色，不產(chǎn)生物胺或降解生物胺菌株在顯色培養(yǎng)基上不變色。過夜培養(yǎng)后得到培養(yǎng)基變紫的初篩菌株如圖1a 所示，挑取這些菌株進行分離、純化，如圖1b 所示，得到產(chǎn)胺菌株46 株。

圖1 產(chǎn)胺菌株顯色培養(yǎng)基顯色形態(tài)（a）及LB 平板培養(yǎng)形態(tài)（b）Fig.1 Colorimetric morphology of amine-producing strains in colorimetric medium （a）and LB plate culture （b）

3.2.2 產(chǎn)胺菌株復篩結(jié)果 將初篩菌株接種至生物胺液體顯色培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h，篩選培養(yǎng)后培養(yǎng)液為紫色的菌株為產(chǎn)胺菌株，如圖2所示，篩選得到32 株產(chǎn)胺菌。

通過固體顯色培養(yǎng)基初篩，液體顯色培養(yǎng)基復篩，再經(jīng)過16S rDNA、18S rDNA 和ITS 測序，通過BLAST 比對序列，采用MEGA 7.0 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。

圖2 產(chǎn)胺菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of amine-producing strains

結(jié)果顯示甜瓣子中所篩選出代謝生物胺的菌株主要為芽孢桿菌屬、短桿菌屬、腸桿菌屬及少量小孢根霉，這與Jeon 等[15]發(fā)現(xiàn)韓國傳統(tǒng)豆醬Cheonggukjang 中，主要由腸球菌屬和芽孢桿菌屬生成生物胺的研究結(jié)果一致。

3.2.3 高效液相色譜測定培養(yǎng)液中生物胺含量經(jīng)高效液相色譜測定，得到復篩的產(chǎn)胺菌株培養(yǎng)液中生物胺含量如圖3所示。

圖3 產(chǎn)胺菌株培養(yǎng)液中生物胺含量（mg/mL）Fig.3 Bioamine content in culture medium of amine-producing strain （mg/mL）

結(jié)合空白組進行分析可以得出，所篩出菌株培養(yǎng)液中生物胺總量均遠高于空白組中生物胺總量，不同菌株之間產(chǎn)生物胺能力存在較大差異，與空白組相比芽孢桿菌屬產(chǎn)組胺、酪胺的能力相對較強。其中，B11 菌株產(chǎn)苯乙胺能力相對較強，含量達78.4 mg/kg；B16 菌株產(chǎn)酪胺能力相對較強，含量達25.3 mg/kg。Y17 菌株和Y20 菌株具備較強的產(chǎn)腐胺、尸胺能力，其培養(yǎng)液中含量分別達257.5 mg/kg 和92.8 mg/kg，挑選這4 株菌株回接至甜瓣子發(fā)酵體系驗證產(chǎn)胺能力。

3.3 高產(chǎn)胺菌株回接至不同鹽度甜瓣子模擬體系中產(chǎn)生物胺的能力

高產(chǎn)生物胺菌株回接結(jié)果如圖4所示。可看出，6%鹽度體系中生物胺含量遠高于9%和12%鹽度體系，且8 種生物胺均有檢出，生物胺總量最高達4 207.6 mg/kg。對照組發(fā)酵過程主要產(chǎn)酪胺、腐胺、組胺和色胺，有少量尸胺檢出。該鹽度下，除B11 號菌株外其余各菌株體系中生物胺總量均高于食品中生物胺建議總量1 000 mg/kg[16]。其中，B16 回接體系中酪胺含量相對較高，含量為1 194.4 mg/kg，高于Ten 等[17]、Nout 等[18]提出的食品中酪胺為100～800 mg/kg 的限量標準；Y17 體系中腐胺含量較高，含量為3 363.9 mg/kg；Y20 回接體系中高產(chǎn)尸胺，為1 160.4 mg/kg，表明6%鹽度發(fā)酵甜瓣子可能存在較大安全風險。

圖4 高產(chǎn)胺菌株回接6%、9%、12%鹽度甜瓣子模擬體系后產(chǎn)胺能力Fig.4 The amine-producing capacity of the amineproducing strain after back connecting with the simulated system of sweet petal with 6%，9% and 12% salinity

在9%和12%含鹽量甜瓣子樣品中，生物胺總量最高分別為233.9，781.2 mg/kg，其生物胺組成相似。9%鹽度下B11 高產(chǎn)苯乙胺220.06 mg/kg；12%鹽度下B11 高產(chǎn)腐胺119.4 mg/kg、苯乙胺546.5 mg/kg，遠高于30 mg/kg 的推薦量[17]。B16、Y17、Y20 菌株在9%、12%鹽度回接體系中不產(chǎn)色胺，產(chǎn)生物胺種類和含量隨鹽度增加而減少，與對照組生物胺變化趨勢較為一致，可能是鹽對其生長起到了一定程度的抑制作用所致。精胺和亞精胺在不同含鹽量甜瓣子樣品中含量均較低。因此，實現(xiàn)甜瓣子低鹽化發(fā)酵不能一味的追求降低鹽的含量。

3.4 生物胺降解菌株篩選結(jié)果

3.4.1 不產(chǎn)胺菌株篩選結(jié)果 挑選46 株課題組前期從甜瓣子中篩選出的不同種屬菌株，活化后接種至生物胺液體顯色培養(yǎng)基中，篩選得到39 株不產(chǎn)生物胺的菌株，主要為酵母菌、乳酸菌（表4）。

表4 不產(chǎn)胺菌株篩選結(jié)果Table 4 Screening results of non-amine-producing strains

3.4.2 生物胺降解菌株初篩結(jié)果 將上述不產(chǎn)胺菌株未變紫培養(yǎng)液衍生后于300 nm 波長下檢測其熒光強度，初篩出降胺菌株。熒光檢測篩選結(jié)果如圖5所示。

圖5 降胺菌株初篩熒光檢測結(jié)果Fig.5 Fluorescence detection results of the initial screening of the aniline strain

選取熒光強度弱于空白組的菌株，初步斷定為降解生物胺菌株（圖5），共篩選出降解生物胺菌株9 株，其中酵母菌4 株，乳酸菌4 株，細菌1 株。

3.4.3 生物胺降解菌株復篩結(jié)果 將上述菌株回接至生物胺質(zhì)量濃度為100 mg/L 的BAs 培養(yǎng)液，30 ℃培養(yǎng)12 h 后，空白組未觀察到菌株的生長，其余組菌株均有生長，于620 nm 波長下測定其吸光度值，從而判定其在以生物胺為唯一氮源的培養(yǎng)基下的生長狀況，結(jié)果如圖6所示。

圖6 降解生物胺菌株BAs 培養(yǎng)液OD 值Fig.6 OD value of BAS culture medium of bioamine-degrading strain

研究結(jié)果表明，初步篩選的9 株菌均具備降解生物胺的能力。其中，美極梅奇酵母23J-5、食竇魏斯氏菌1R8S39 在BAs 培養(yǎng)基下生長狀況較好，表明其降解生物胺的能力可能較高。熒光檢測結(jié)果顯示，9 株菌株熒光強度均弱于空白組的菌株（圖7），表明其均為生物胺降解菌。

圖7 生物胺降解菌株熒光檢測結(jié)果Fig.7 Fluorescence detection results of biogenic amine degrading strains

3.4.4 降胺菌株BAs 培養(yǎng)液降解能力測定 使用高效液相色譜測定各菌株BAs 培養(yǎng)液生物胺含量并計算其降解率，結(jié)果如圖8所示。所篩選菌株都具有一定生物胺降解能力，然而均無法降解亞精胺，不同菌株降解不同種類生物胺的能力差異較大。9 株菌株對色胺的降解率在14.10%～21.37%之間；苯乙胺的降解率在5.94%～20.09%之間；腐胺的降解率在14.46%～24.94%之間；尸胺的降解率在23.52%～30.82%之間；組胺的降解率在5.65%～33.43%之間；酪胺的降解率在4.75%～15.10%之間；精胺的降解率在34.67%～65.58%之間；其中，扣囊復膜酵母MTQ1004 具備較強的降解腐胺、組胺、精胺能力，其降解率分別為24.94%，33.43%，65.58%；美極酶奇酵母23J-5 具備較強的降解尸胺、酪胺能力，降解率分別為30.82%，15.10%；香腸乳桿菌F003 具備較強的降解苯乙胺和色胺能力，降解率分別為20.09%，21.37%，且能降解除亞精胺外的其余7 種生物胺。通過比較分析可知，扣囊復膜酵母（MTQ1004）和香腸乳桿菌（F003）的生物胺降解率相對較高，與楊利昆等[19]、趙佳迪[11]研究結(jié)果較為一致。

圖8 降胺菌株BAs 培養(yǎng)液的生物胺降解率（%）Fig.8 Degradation rate of biogenic amines in culture medium of BAS by amine-lowering strain （%）

3.5 降胺菌株回接甜瓣子模擬體系驗證結(jié)果

3.5.1 降胺菌株回接甜瓣子模擬體系的降解能力測定 將上述降胺菌株回接至含100 mg/L 生物胺的甜瓣子模擬體系中培養(yǎng)16 d，提取衍生后，通過高效液相色譜法測定生物胺含量，結(jié)果如圖9所示。由于尖包念珠菌為有害菌，因此不考慮回接應用。其中，降胺能力最強的是香腸乳桿菌F003，與前期篩選結(jié)果一致，其對苯乙胺的降解率高達100%，對危害較大的組胺、酪胺和精胺的降解率分別可達57.61%，25.52%，45.99%；扣囊復膜酵母MTQ1004 對苯乙胺和腐胺的降解率達100%，對組胺降解率為37.78%；其余菌株對各種生物胺均有一定的降解能力。

圖9 甜瓣子模擬體系中的生物胺降解率（%）Fig.9 Degradation rate of biogenic amines in the sweet petal simulation system （%）

在甜瓣子模擬體系下，菌株降解率與對應菌株降解生物胺能力強弱較為一致。而降解生物胺種類數(shù)量減少，這與該菌株降解生物胺能力特性有所不同，可能是因為甜瓣子正常發(fā)酵時，環(huán)境因素對菌株降解生物胺能力造成影響所致[20]。

3.5.2 降胺菌株回接甜瓣子模擬體系的感官評價 由圖10可以看出，在回接純種發(fā)酵體系中，所篩選出降胺菌株發(fā)酵的甜瓣子感官評價結(jié)果存在一定差異。其中，生物胺降解能力較強的扣囊復膜酵母MTQ1004 具有生物胺降解能力，而強化發(fā)酵的甜瓣子霉味較重，以腐臭味、氨味為主，感官品質(zhì)相對較差；生物胺降解菌株香腸乳桿菌F003 強化發(fā)酵所得的甜瓣子同正常發(fā)酵的甜瓣子相比，其酯香、醬香味較濃，所得甜瓣子樣品感官品質(zhì)最佳，可以考慮用作低鹽化甜瓣子中的降胺發(fā)酵菌株。

圖10 降胺菌株回接甜瓣子模擬體系的感官評價Fig.10 Sensory evaluation of aniline strain tieback sweet petal simulation system

4 結(jié)論

本研究從4%鹽度甜瓣子中篩出產(chǎn)生物胺菌株32 株，其中腸桿菌屬Y17、小孢根霉Y20、枯草芽孢桿菌B11 和B16 產(chǎn)生物胺能力最強，主要產(chǎn)酪胺、尸胺、腐胺、苯乙胺。鹽度對菌株產(chǎn)生物胺能力有明顯抑制作用，將4 株菌株回接至甜瓣子發(fā)酵體系中，其中6%發(fā)酵體系含有大量生物胺，9%和12%發(fā)酵體系中產(chǎn)生物胺明顯得到抑制。

篩選出降解生物胺菌株9 株；篩選出1 株可用于甜瓣子低鹽化發(fā)酵的降胺菌株香腸乳桿菌F003，它能有效降解苯乙胺、組胺、酪胺和精胺等生物胺，在生物胺含量為100 mg/L 時，降解率分別為100%，57.61%，25.52%，45.99%，且回接體系中感官品質(zhì)最佳，具有較好的生長能力，可考慮為甜瓣子低鹽發(fā)酵時的降胺菌株。