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生物標(biāo)志物與小兒燒傷膿毒癥的早期診斷*

2022-11-23 08:39朱悅悅朱振洪
關(guān)鍵詞:靈敏性組學(xué)膿毒癥

朱悅悅,朱振洪

(蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院小兒燒傷整形外科,蘇州 215000)

膿毒癥被認(rèn)為是由宿主對(duì)感染的反應(yīng)失調(diào)導(dǎo)致的危及生命的器官功能障礙[1]。燒傷創(chuàng)面的持續(xù)開(kāi)放,腸道屏障功能失調(diào),重度燒傷患者所需的侵入性設(shè)備如中央靜脈和動(dòng)脈導(dǎo)管,嚴(yán)重?zé)齻颊叨嗵幱诖x亢進(jìn)及免疫抑制狀態(tài)等,這些都增加了燒傷患者潛在的感染和燒傷膿毒癥風(fēng)險(xiǎn),小兒燒傷患者則因?yàn)榇x調(diào)節(jié)能力和免疫功能不成熟,更易受到燒傷膿毒癥的威脅[2]。隨著燒傷護(hù)理措施的改善,液體復(fù)蘇和營(yíng)養(yǎng)支持水平的提高,燒傷患者的死亡原因已經(jīng)從休克轉(zhuǎn)變?yōu)槟摱景Y及其并發(fā)癥占主導(dǎo)地位[3],燒傷膿毒癥的早期識(shí)別和積極干預(yù)顯得極為重要。

然而,長(zhǎng)期暴露于炎癥介質(zhì)及亢進(jìn)的代謝水平使許多膿毒癥診斷指標(biāo)如發(fā)熱、心動(dòng)過(guò)速、呼吸急促、白細(xì)胞增多等全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)癥狀成為燒傷群體的常見(jiàn)臨床表現(xiàn),加之不同年齡段兒童生理特征的特殊性,這些傳統(tǒng)指標(biāo)對(duì)小兒燒傷膿毒癥患者的早期診斷和嚴(yán)重性評(píng)估價(jià)值不高。采樣時(shí)間、方式、培養(yǎng)效率等使微生物培養(yǎng)在燒傷膿毒癥早期診斷的應(yīng)用也存在一定的局限性[4]。因此,膿毒癥標(biāo)志物對(duì)于燒傷膿毒癥的早期診斷一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。盡管小兒燒傷好發(fā),但由于多為小面積燒傷,相關(guān)膿毒癥標(biāo)志物對(duì)小兒燒傷患者的診斷和臨床應(yīng)用卻較為局限。

1 傳統(tǒng)膿毒癥標(biāo)志物與小兒燒傷膿毒癥的早期診斷

1.1 C 反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)CRP 是由肝臟合成的急性時(shí)相蛋白,能結(jié)合病原體和受損細(xì)胞的磷脂成分,激活受體并活化補(bǔ)體系統(tǒng)發(fā)揮作用,是反映機(jī)體損傷和感染的敏感指標(biāo)之一。燒傷后24 h內(nèi)患者血漿CRP 水平明顯升高,48 h 達(dá)到峰值,且CRP 水平與燒傷面積(burn surface area,BSA)呈正相關(guān),其升高與燒傷患者感染及膿毒癥的發(fā)生有關(guān)。

B.GüLHAN 等[5]指出,火焰?zhèn)?、血漿CRP 水平>60 mg/L 和BSA>25%都是燒傷患兒發(fā)生膿毒癥的高危因素,與早先一項(xiàng)納入918 例燒傷兒童的隊(duì)列研究[6]一樣,CRP 水平與嚴(yán)重?zé)齻純築SA 呈正相關(guān);燒傷后第2 天起,死亡組患兒血漿CRP 水平明顯高于膿毒癥存活組,即燒傷患兒血漿動(dòng)態(tài)CRP 水平和死亡事件顯著相關(guān)。盡管如此,CRP 被證實(shí)在創(chuàng)傷、外科手術(shù)后、組織壞死、細(xì)菌感染及非細(xì)菌感染刺激下均可快速上升,其作為機(jī)體炎癥反應(yīng)水平指標(biāo)固然有廣泛適用性,對(duì)膿毒癥的發(fā)生進(jìn)行除外性診斷也有一定的可靠性,但對(duì)于燒傷患兒膿毒癥發(fā)生與非感染所致炎癥進(jìn)行區(qū)分的特異性不高,且不能反映感染的嚴(yán)重程度,對(duì)燒傷膿毒癥患兒預(yù)后的判斷價(jià)值也十分有限[7]。

1.2 白細(xì)胞介素(interleukin,IL)IL-6 是一種由免疫細(xì)胞及多種相關(guān)細(xì)胞產(chǎn)生的具有多效性的細(xì)胞因子,是參與機(jī)體炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子的核心成員,其血漿水平的急劇增高是一種危險(xiǎn)的信號(hào)。血漿IL-6 水平在患兒燒傷發(fā)生后早期即可達(dá)到峰值,燒傷膿毒癥患兒血漿IL-6 水平明顯高于非膿毒癥燒傷患兒,此后緩慢下降至正常水平;燒傷死亡組IL-6 水平在燒傷后亦始終高于膿毒癥組,且在死亡事件發(fā)生前無(wú)下降趨勢(shì)[8-9]。表明血漿IL-6 水平對(duì)燒傷患兒膿毒癥及其嚴(yán)重性有較好的早期預(yù)警作用。

作為應(yīng)對(duì)損傷及感染的急性時(shí)相炎癥介質(zhì),IL-8在機(jī)體受到損傷之后參與中性粒細(xì)胞的活化和組織修復(fù)機(jī)制(如細(xì)胞增殖和血管生成)以及炎癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。在燒傷患兒,高水平的IL-8 與燒傷膿毒癥、多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)和死亡事件發(fā)生有高度相關(guān)性,許多研究[8,10]也證實(shí)了其對(duì)燒傷患兒感染的診斷效能。此外,一項(xiàng)納入468 例嚴(yán)重?zé)齻麅和?0 d 內(nèi)血漿IL-8 水平走勢(shì)的前瞻性研究[11]甚至指出,血漿IL-8 水平達(dá)0.234 g/L 對(duì)燒傷患兒死亡事件預(yù)測(cè)具有最大的靈敏性和特異性。

燒傷使機(jī)體產(chǎn)生的大量細(xì)胞因子是燒傷患者SIRS 狀態(tài)產(chǎn)生的基礎(chǔ)[12],故不少針對(duì)燒傷膿毒癥的治療如烏司他丁、血液凈化及創(chuàng)面負(fù)壓吸引和早期切痂等已經(jīng)將IL-4、IL-6、IL-8 等作為判定膿毒癥治療效果的依據(jù)。此外,血漿腫瘤壞死因子α、IL-10 等炎癥因子水平盡管在成人和小兒燒傷的不同時(shí)期均呈現(xiàn)出差異性,但對(duì)燒傷膿毒癥的早期診斷和預(yù)后評(píng)估價(jià)值尚頗有爭(zhēng)議[8,13],需進(jìn)一步探究。實(shí)際上,由于檢測(cè)試劑的價(jià)格較高,上述細(xì)胞因子主要用于研究,在燒傷膿毒癥早期診斷的臨床應(yīng)用尚未能普及。

1.3 降鈣素原(procalcitonin,PCT)PCT 是降鈣素的前體,生理狀態(tài)下是主要來(lái)源于甲狀腺濾泡旁細(xì)胞,由116 個(gè)氨基組成的多肽,其半衰期短(25~30 h),健康人群血清PCT 水平低。細(xì)菌感染刺激非內(nèi)分泌細(xì)胞中其編碼基因CALC-1 轉(zhuǎn)錄,從而導(dǎo)致PCT 產(chǎn)生增加。細(xì)菌感染事件3 h 內(nèi)PCT 水平即升高,發(fā)生膿毒癥起始的2~4 h 內(nèi)可增加甚至1 000 倍,20 h 左右達(dá)到峰值。感染得到控制后,血漿PCT 水平每天下降約50%,是目前較為經(jīng)典的膿毒癥標(biāo)志物[14-15]。

由于診斷標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一,成人燒傷群體發(fā)生膿毒癥的PCT 臨界值為0.5~3 ng/mL[16-17],近年來(lái)血漿PCT 水平在兒童燒傷群體已經(jīng)有一定的研究。入院時(shí)PCT 水平在非感染性燒傷患兒與燒傷膿毒癥患兒中存在明顯差異,且與患兒燒傷總面積大小、血培養(yǎng)陽(yáng)性率、抗生素的依賴程度及重癥監(jiān)護(hù)時(shí)間明顯呈正相關(guān)。死亡組患兒PCT 水平在燒傷后迅速升高,明顯高于燒傷膿毒癥存活組并始終保持較高水平,具有優(yōu)于CRP 等其他標(biāo)志物的預(yù)測(cè)價(jià)值[18]。M.F.KUNDES 等[19]研究發(fā)現(xiàn),PCT>0.5 ng/dL 對(duì)燒傷膿毒癥患兒早期診斷具有100%的靈敏性和83%的特異性。此外,PCT 對(duì)細(xì)菌性膿毒癥的發(fā)生尤為敏感,對(duì)病原體具有區(qū)分意義,且PCT 動(dòng)態(tài)水平被證實(shí)在燒傷感染的治療過(guò)程中展現(xiàn)出良好的抗生素指導(dǎo)作用[20]??梢?jiàn),PCT 對(duì)燒傷患兒膿毒癥的發(fā)生發(fā)展及臨床治療具有良好的臨床指導(dǎo)意義。

2 兒童燒傷群體具有探索價(jià)值的蛋白類(lèi)燒傷膿毒癥早期標(biāo)志物

由于燒傷患者病理生理的復(fù)雜性,單一生物標(biāo)志物難以盡早而精確判斷燒傷膿毒癥的發(fā)生及其預(yù)后,膿毒癥標(biāo)志物聯(lián)合診斷能提高早期診斷的靈敏性和特異性[21]。近年研究[22]表明,下述標(biāo)志物在成人燒傷群體顯示出一定的燒傷膿毒癥早期診斷和嚴(yán)重性評(píng)估價(jià)值,但在小兒燒傷群體中的研究報(bào)道尚少,進(jìn)一步展開(kāi)研究實(shí)屬必要。

2.1 腎上腺髓質(zhì)素(adrenomedullin,ADM)及其前體中間片段(mid-regional proADM,MR-proADM)ADM是具有52 個(gè)氨基酸的肽,胚胎發(fā)育時(shí)期和成年時(shí)期的大多數(shù)器官、組織均表達(dá)ADM,尤其在內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞和白細(xì)胞等表達(dá)量較高,此外,在血供豐富的器官或組織,如胎盤(pán)、肺、心臟、腎上腺髓質(zhì)和脂肪組織也少量表達(dá)。但ADM 半衰期只有20 min,其MR-proADM 因更穩(wěn)定、易測(cè)量而更多被用于間接反映其血漿水平。近年來(lái)研究[23]認(rèn)為血漿ADM 及其前體對(duì)膿毒癥的早期診斷率及預(yù)后評(píng)估有極大幫助,且能對(duì)不同程度器官功能障礙進(jìn)行預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)分層。血漿MR-proADM 對(duì)膿毒癥診斷具有較好的靈敏性,聯(lián)合運(yùn)用血漿PCT 則可以顯著提高膿毒癥的早期診斷率[24]。昆明醫(yī)科大學(xué)魏星等[25]最早指出,燒傷膿毒癥患兒血漿pro-ADM 含量早期上升,其含量與全身炎癥反應(yīng)、靶器官損傷程度高度一致,與燒傷患兒序貫性器官衰竭估計(jì)(sequential organ failure assessment,SOFA)評(píng)分極大相關(guān),其對(duì)于輕癥膿毒癥及部分病原體的鑒別可能要優(yōu)于PCT。由于報(bào)道尚少,ADM 及其前體在燒傷感染早期診斷的價(jià)值還有待研究證實(shí)。

2.2 CD64 中性粒細(xì)胞(neutrophil CD64,nCD64)CD64是IgG 的FC 受體之一,屬免疫球蛋白超家族成員,主要分布于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞表面。nCD64 上調(diào)也一直被認(rèn)為是對(duì)感染免疫反應(yīng)的早期步驟。nCD64 在燒傷患者膿毒癥組、局部感染組和非細(xì)菌感染對(duì)照組中表達(dá)依次降低且有明顯差異性,被證實(shí)比CRP 和中性粒細(xì)胞、血小板等其他血液學(xué)檢測(cè)方法具有更高的靈敏性[26-27],表明nCD64 有望成為燒傷膿毒癥新的早期診斷標(biāo)志物。盡管中性粒細(xì)胞數(shù)量和功能在不同年齡段小兒略有差異,nCD64在感染發(fā)生時(shí)的表達(dá)尚未發(fā)現(xiàn)有年齡差異性,故而在小兒燒傷患者中展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。

2.3 CD14 亞 型(sCD14-ST,presepsin)CD14 是脂多糖(lipopolylysaccharides,LPS)-脂多糖結(jié)合蛋白(lipopolysaccharide binding protein,LBP)復(fù)合物的受體,可以激活炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,在LPS引起的全身性炎癥反應(yīng)、內(nèi)毒素休克等病理反應(yīng)中起到重要作用??扇苄訡D14 的蛋白酶切割的產(chǎn)物sCD14-ST(soluble CD14 subtype),后來(lái)命名為presepsin,同樣被發(fā)現(xiàn)對(duì)SIRS 和膿毒癥的鑒別診斷中比CRP、PCT 等展現(xiàn)出更好的特異性和靈敏性,對(duì)革蘭陰性菌感染具有獨(dú)到的優(yōu)勢(shì),尤其對(duì)早產(chǎn)兒膿毒癥發(fā)生的早期診斷作用已得到肯定[28-29]。已經(jīng)證實(shí)presepsin 對(duì)燒傷膿毒癥的診斷價(jià)值,在燒傷感染病原體的鑒別和抗生素使用方面也有一定的幫助,對(duì)燒傷患兒發(fā)生感染的早期診斷具有可行性。

2.4 高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGB1)作為一類(lèi)非組蛋白染色體結(jié)合蛋白,高遷移率族蛋白(high mobility group protein,HMG)廣泛分布于真核生物細(xì)胞核內(nèi),對(duì)轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、DNA修復(fù)和核小體形成等一系列過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。內(nèi)毒素刺激等病理情況下,HMGB1 由胞核主動(dòng)或被動(dòng)分泌至胞外與Toll 樣受體(Toll-like receptor,TLR)2 及TLR4 等結(jié)合發(fā)揮其炎癥介質(zhì)作用,在自身免疫性疾病、肝癌、膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要地位[30]。成人燒傷后7~21 d 膿毒癥組患者外周血HMGB1 水平顯著高于未并發(fā)膿毒癥組,且在傷后3~21 d,膿毒癥存活組的HMGB1 水平顯著低于死亡組[31]。除了誘導(dǎo)膿毒癥和MODS 的發(fā)生,HMGB1趨化中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞向炎癥向創(chuàng)面的遷移,有助于吞噬和清潔燒傷組織釋放的壞死組織和毒素、激活人微血管內(nèi)皮細(xì)胞,與創(chuàng)面愈合及瘢痕形成相關(guān)[32]。故盡管HMGB1 是晚期炎癥介質(zhì),生物學(xué)功能作用機(jī)制多樣復(fù)雜,其表達(dá)量卻與燒傷膿毒癥的發(fā)生發(fā)展及其預(yù)后以及治療顯著相關(guān),不失為一個(gè)良好的燒傷感染標(biāo)志物研究方向。

3 分子類(lèi)膿毒癥診斷標(biāo)志物及蛋白質(zhì)和代謝組學(xué)在燒傷領(lǐng)域展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景

3.1 分子類(lèi)膿毒癥標(biāo)志物與燒傷膿毒癥的早期診斷 基于對(duì)膿毒癥病理生理的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)和相關(guān)技術(shù)的提高,尋找更為敏感和特異的生物標(biāo)志物在分子生物學(xué)領(lǐng)域取得較多發(fā)展,并展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。

循環(huán)游離DNA(circulating free DNA,cfDNA)自上世紀(jì)40 年代被發(fā)現(xiàn)可存在于機(jī)體外周血以來(lái),后續(xù)研究[33]表明人體處于特殊狀態(tài)(如炎癥、腫瘤、妊娠等)時(shí),外周血中cfDNA 含量急劇上升并存在點(diǎn)突變、DNA 甲基化及微衛(wèi)星不穩(wěn)定等基因改變。目前已廣泛應(yīng)用于腫瘤監(jiān)測(cè)、炎癥、創(chuàng)傷性、自身免疫性疾病及產(chǎn)前診斷等的病理生理評(píng)估。劉瀟等[34]證實(shí)燒傷患者cfDNA 與MODS 評(píng)分及凝血功能等生化指標(biāo)顯著相關(guān),可對(duì)燒傷患者嚴(yán)重程度及預(yù)后進(jìn)行評(píng)估。

在基因組學(xué)方面,研究[35]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種與感染易感性和膿毒癥有聯(lián)系的基因組變異,大多是涉及病原菌檢測(cè)及炎癥介質(zhì)相關(guān)物質(zhì)如TLR4、TLR2及CD14 的基因多態(tài)性。其中,血漿纖溶酶原激活物抑制劑1 及CD14-159C/T 等位基因等與燒傷患者較高的膿毒癥及死亡風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[36-37]。

單個(gè)炎癥因子的基因表達(dá)分析在燒傷膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中受到一定的研究,IL1、IL-6、IL-8、IL-10等的基因表達(dá)被證實(shí)在燒傷膿毒癥的早期診斷及嚴(yán)重性評(píng)估方面展現(xiàn)出應(yīng)用前景[38]。此外,除DNA甲基化外,非編碼RNA 的失調(diào)、基因沉默和增強(qiáng)等表觀遺傳學(xué)改變也均與嚴(yán)重的炎癥和膿毒癥密切相關(guān)[39]。

3.2 蛋白質(zhì)和代謝組學(xué)的應(yīng)用價(jià)值 嚴(yán)重?zé)齻箼C(jī)體產(chǎn)生復(fù)雜的病理生理過(guò)程,導(dǎo)致體液中蛋白質(zhì)和酶水平的多種變化。蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)能進(jìn)行高通量和大規(guī)模的蛋白質(zhì)及其他代謝物質(zhì)分析?;诟咝б合嗌V分離及質(zhì)譜分析等方法發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者血清多種蛋白質(zhì)及其他代謝物水平的上升及下調(diào)[40];研究[41-42]也表明蛋白質(zhì)和代謝組學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)可以用來(lái)區(qū)別感染性休克患者與沒(méi)有感染的SIRS反應(yīng)。故繼基因和轉(zhuǎn)錄組學(xué)之后,蛋白質(zhì)和代謝組學(xué)的興起為更具靈敏性和特異性膿毒癥標(biāo)志物的鑒定提供了幫助,可能是將來(lái)開(kāi)發(fā)更好的新型燒傷生物標(biāo)志物的關(guān)鍵。

眾所周知,對(duì)臨床癥狀不典型、病情進(jìn)展迅速急需早期診斷和干預(yù)的小兒燒傷膿毒癥群體來(lái)說(shuō),因?yàn)榧议L(zhǎng)的疼惜,檢驗(yàn)標(biāo)本常難以獲取,更具靈敏性和特異性的診斷標(biāo)志物能顯示出絕對(duì)的優(yōu)越性和適用性。盡管已經(jīng)取得長(zhǎng)足進(jìn)步,上述分子類(lèi)及蛋白質(zhì)和代謝組學(xué)標(biāo)志物診斷方法在小兒燒傷群體中的應(yīng)用涉足尚少,在感染和膿毒癥早期診斷的深層次機(jī)制和可行性也需要更多的探索。

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