羅雅琴，黃 偉

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟南 250014；2.山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟南 250014；3.齊魯工業(yè)大學(xué)/山東省科學(xué)院山東省分析測試中心，山東 濟南 250014)

細胞自噬是一種自我消化現(xiàn)象，廣泛參與細胞生命活動，與細胞生存或死亡密不可分。自噬不僅是細胞重要的內(nèi)在保護機制，而且也參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、克羅恩病等多種自身免疫性疾病[1]。免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia，ITP)是一種機體自身免疫異常引起的血小板破壞過多的出血性疾病，以外周血小板減少、骨髓巨核細胞正?；蛟龆酁橹饕R床表現(xiàn)，嚴(yán)重者可出現(xiàn)顱內(nèi)以及消化道出血等，影響患者生命[2]。目前，導(dǎo)致ITP發(fā)生的主要機制尚未完全闡明，除抗體介導(dǎo)的血小板破壞以外，多種細胞免疫機制的異常也參與了ITP的發(fā)生過程。研究表明，T、B淋巴細胞免疫失衡及巨核細胞功能障礙是ITP發(fā)生的中心環(huán)節(jié)[3-4]。近年來，越來越多的研究顯示，自噬在ITP疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本文就細胞自噬在ITP中的作用及機制進行綜述，以期為探索ITP的新型自噬靶向治療藥物提供參考。

1 細胞自噬概述

細胞自噬又稱為“自我吞噬”，是細胞內(nèi)細胞器與生物大分子被降解和回收利用的過程。細胞自噬主要分為3類：巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬。細胞自噬的過程分為起始、延伸、成熟和結(jié)束4個階段[5]。起始：細胞受到自噬刺激后，細胞內(nèi)會形成雙層膜結(jié)構(gòu)；延伸：雙層膜的結(jié)構(gòu)不斷延伸并將底物包裹起來形成自噬體；成熟：在自噬的成熟階段，閉合的雙層膜結(jié)構(gòu)與溶酶體融合；結(jié)束：自噬小體在溶酶體內(nèi)多種酶的作用下被降解掉。細胞自噬廣泛參與細胞多種重要生命活動，包括細胞凋亡、細胞更新、細胞死亡等，是細胞的一種重要內(nèi)在保護機制；同時，細胞自噬也參與機體多種疾病的發(fā)病過程，自噬不足或過度都會導(dǎo)致機體發(fā)生病變。

2 細胞自噬調(diào)控機制

在細胞內(nèi)，自噬被嚴(yán)格調(diào)節(jié)以維持細胞穩(wěn)態(tài)。研究表明，細胞自噬通過響應(yīng)細胞外或細胞內(nèi)的應(yīng)激和信號如饑餓、生長因子剝奪、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)應(yīng)激、未折疊蛋白積聚和病原體感染等上調(diào)自噬體的表達。自噬體可由不同來源的膜形成，包括ER、高爾基體、線粒體和質(zhì)膜[6]。自噬體的形成需要自噬相關(guān)蛋白(autophagy-related protein，Atg)的參與，目前已鑒定出至少35個Atg基因，大多數(shù)Atg基因有助于自噬體的形成，從酵母菌到人類進化過程Atg基因保持高度保守。酵母菌的Atg僅有一種形式，而哺乳動物所含Atg均有多種亞基，如Atg1、Atg4、Atg5、Atg8和Atg18，每個Atg在自噬過程中發(fā)揮特定功能[7]。目前研究證實，至少4種復(fù)合物涉及調(diào)控細胞自噬[8]，包括Atg1/Unc-51樣自噬激活激酶1復(fù)合物、Atg6/Beclin1/Ⅲ型磷脂酰肌醇-3激酶復(fù)合物、跨膜Atg 9/空泡膜蛋白1復(fù)合物和泛素樣蛋白復(fù)合物[如Atg12和Atg8/微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)]，其中LC3分子由LC3Ⅰ 轉(zhuǎn)化為LC3Ⅱ參與自噬體膜的形成，LC3Ⅱ常被作為評價細胞內(nèi)自噬發(fā)生及自噬活性的主要標(biāo)志物之一[9]。細胞自噬調(diào)控信號通路主要分為2大類：哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)依賴途徑和mTOR非依賴途徑，目前研究主要集中在mTOR依賴途徑。mTOR是磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinases,PI3K)家族的重要成員，是細胞代謝的關(guān)鍵參與者之一，在維持營養(yǎng)有效性、能量以及機體代謝平衡中發(fā)揮重要作用[10]。mTOR作為自噬調(diào)控的中心環(huán)節(jié)，主要包括mTOR復(fù)合物1(mTOR complex 1，mTORC1)和mTORC2等2種形式。研究發(fā)現(xiàn)，mTOR在細胞內(nèi)受多條信號通路的調(diào)控，包括PI3K/蛋白激酶B (protein kinase B,PKB/AKT)、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-actived proteinkinase,p38 MAPK)、腺苷酸激活蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)/結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合體(tuberous sclerosiscomplex,TSC)等[11]。mTOR非依賴途徑主要受Class III-PI3K、RAS-MAPK、Ca-AMPK、p53、磷酸酶及張力蛋白同源物、ER應(yīng)激等信號通路的調(diào)控[12]。目前，小分子自噬抑制劑如氯喹、3-甲基腺嘌呤、巴弗洛霉素A1、毒胡蘿卜素、(±)BayK8644等已廣泛用于臨床和實驗研究中，為研究細胞自噬與疾病的相關(guān)性提供了新的思路和工具。

3 ITP

ITP是臨床上一種常見的出血性疾病，以外周血血小板減少為特點，嚴(yán)重者可危及生命。ITP患者因出血風(fēng)險增大、疾病轉(zhuǎn)歸的不可預(yù)測性、對疾病的恐懼感、需長時間治療、社會活動減少、影響工作等各種因素導(dǎo)致其生活質(zhì)量嚴(yán)重降低，甚至其生活質(zhì)量低于癌癥患者[13]。ITP的發(fā)病機制主要為血小板破壞增多、血小板生成減少及T淋巴細胞免疫失衡。ITP的一線治療方法主要包括：糖皮質(zhì)激素、靜脈注射用免疫球蛋白和抗-D免疫球蛋白；二線治療方法包括：脾臟切除術(shù)、利妥昔單抗、促血小板生成素受體激動劑、環(huán)孢素、免疫抑制劑等。臨床中有部分患者因治療效果不佳，發(fā)展成為難治性ITP[14]。ITP患者體內(nèi)血小板破壞增多，主要是因為血小板自身抗體介導(dǎo)的免疫失耐受，產(chǎn)生針對血小板糖蛋白(glycoprotein，GP)的自身抗體，包括抗血小板GPIb/Ⅸ和GPIIb/Ⅲ a抗體等，該抗體可與血小板表面的GP抗原表位結(jié)合，介導(dǎo)血小板被脾臟網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中的單核巨噬細胞過度清除[15]。另有研究發(fā)現(xiàn)，ITP中細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocytes，CTLs) 可通過穿孔素、顆粒酶B直接裂解血小板，造成血小板破壞增多；且CTLs可引起骨髓巨核細胞成熟和凋亡障礙，導(dǎo)致機體血小板生成減少[16]。但ITP的發(fā)病機制復(fù)雜，至今尚未完全闡明。

4 細胞自噬與ITP

細胞自噬不僅是一個重要的細胞內(nèi)在保護機制，而且對于微生物細胞反應(yīng)、主要組織相容性復(fù)合體抗原呈遞以及淋巴細胞的分化、生存和增殖也起非常重要的作用。細胞自噬參與細胞的發(fā)育、分化、衰老和免疫。在生理條件下，自噬不僅調(diào)節(jié)免疫細胞存活和內(nèi)源性細胞因子依賴性炎癥等核心細胞過程，且在控制細胞內(nèi)病原體中也起主要作用[17]。許多免疫過程包括病原體識別和破壞、抗原呈遞、淋巴細胞發(fā)育和功能、體液免疫和炎癥調(diào)節(jié)等高度依賴自噬[18-19]。有證據(jù)表明，自噬參與T、B淋巴細胞的激活和增殖以及決定B細胞存活的機制[20]。在病理情況下，自噬因不能對細胞外和細胞內(nèi)的應(yīng)激有足夠的反應(yīng)而出現(xiàn)異常[21]。研究表明，T、B淋巴細胞免疫失衡及巨核細胞功能障礙是ITP發(fā)生的中心環(huán)節(jié)[3-4]。因此，細胞自噬通過對T、B淋巴細胞和巨核細胞功能的調(diào)節(jié)作用對ITP的發(fā)生、發(fā)展起重要作用。

4.1 自噬調(diào)控T淋巴細胞在ITP發(fā)生、發(fā)展中的作用T淋巴細胞是ITP發(fā)病的關(guān)鍵成員，了解T細胞的功能缺陷對于闡明ITP的發(fā)病機制至關(guān)重要[22]。ITP是一種自身免疫性出血性疾病，通過T細胞和B細胞識別血小板抗原啟動ITP的發(fā)生。健康人具有血小板特異性自身反應(yīng)T細胞，可對外周刺激產(chǎn)生免疫耐受，而ITP患者存在活化的血小板自身反應(yīng)性T細胞可增加促炎因子水平[23-24]。這表明ITP可能是由于血小板特異性自身反應(yīng)性T細胞失去對外周的免疫耐受所導(dǎo)致。T淋巴細胞的發(fā)育、生存和增殖尤其依賴于自噬[25-26]。研究表明，細胞自噬可調(diào)控T細胞的存活、活化、病原體清除和記憶等生物功能，通過促進T細胞增殖和抑制死亡而有利于其存活[27]。王琦等[28]研究顯示，與健康兒童相比，初診自身抗體陽性的ITP患兒Treg數(shù)量顯著降低，并伴隨增殖相關(guān)蛋白AKT、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶磷酸化水平及細胞自噬蛋白Atg5和Atg7水平降低。JIA等[29]研究發(fā)現(xiàn)，自噬基因Atg7缺失的T細胞導(dǎo)致細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1B累積增加，從而抑制T細胞自身增殖。而自噬基因缺失的T細胞由于線粒體活性氧的堆積增加、促凋亡蛋白增加而促進T細胞凋亡[30]。細胞自噬缺陷不僅影響T細胞存活，而且影響其正?；罨?。研究發(fā)現(xiàn)，從老年小鼠獲得的T細胞以及從健康志愿者獲得的循環(huán)CD8+、CD57+衰老細胞均顯示自噬功能減弱，這與DNA損傷增加有關(guān)[31]。因此，由于衰老導(dǎo)致的自噬缺陷可能導(dǎo)致T細胞的免疫低下。自噬還可通過介導(dǎo)T細胞受體(T cell receptor，TCR)下游信號通路的負向調(diào)控分子非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶1的降解促進T細胞活化[32]。在活化的T細胞中，CD8+T細胞更容易受到細胞自噬的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，Atg5-/-的CD8+T細胞更容易獲得效應(yīng)記憶表型，并產(chǎn)生更多的干擾素γ(interferon gamma，IFN-γ)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，這種表型變化伴隨著葡萄糖代謝的增強，導(dǎo)致組蛋白甲基化的改變，以及糖酵解和免疫反應(yīng)基因的上調(diào)[33]；自噬蛋白Atg7和NIP3樣蛋白(Nip3-like protein X，NIX)介導(dǎo)的線粒體自噬對缺氧誘導(dǎo)因子-1a蛋白及脂肪酸代謝的調(diào)控與CD8+T細胞對特異性抗原的記憶有關(guān)[34]。研究表明，輔助型T細胞1(T helper 1 cell，Th1)可通過誘導(dǎo)自噬增強對入侵病菌的清除或促進細胞死亡[35]。巨噬細胞參與許多重要的免疫功能，IFN-γ加強了巨噬細胞在細胞先天性免疫中的作用。CHANG等[36]報道，IFN-γ可以增強刀豆球蛋白A誘導(dǎo)的肝癌細胞株發(fā)生自噬潮和細胞死亡。因此，推測T淋巴細胞自噬可能在ITP發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，但具體機制仍需進一步深入研究。

4.2 自噬調(diào)控B淋巴細胞在ITP發(fā)生、發(fā)展中的作用自噬對B淋巴細胞的生存起著復(fù)雜的作用，以確保免疫系統(tǒng)的正常。研究表明，B細胞經(jīng)活化后高度增殖，引起細胞代謝過程加快，從而提供細胞增殖所需能量和物質(zhì)等，而細胞自噬參與該過程并發(fā)揮重要作用[27]。自噬促進體內(nèi)B淋巴細胞亞群的生存，包括發(fā)育中的前B細胞和B1細胞[37]。WATANABE 等[38]研究發(fā)現(xiàn)，自噬特別容易被凋亡的B細胞受體信號誘導(dǎo);采用Cre-Lox P技術(shù)刪除B淋巴細胞的Atg5，或重新輻照Atg5-/-小鼠胚胎肝臟祖細胞，可導(dǎo)致腹膜B-1B細胞顯著減少。在B細胞發(fā)育中，Atg5-/-的祖細胞在將原B細胞轉(zhuǎn)為前B細胞時表現(xiàn)出顯著的缺陷，而骨髓B細胞的低效發(fā)育與增加的B細胞死亡有關(guān)，表明Atg5在發(fā)育過程中對B細胞的生存很重要。此外，B-1a B細胞需要外圍Atg5的維護?？梢?，Atg5在細胞發(fā)育的不同階段所起的作用不一樣，但與細胞系傳代數(shù)密切相關(guān)[39]。MARTINEZ-MARTIN等[40]研究發(fā)現(xiàn)，病毒感染激活初級濾泡B細胞發(fā)育為生發(fā)中心B細胞過程中，在自噬基因WIPI2調(diào)控下，細胞mTORC1表達上調(diào)，LC3-Ⅱ水平升高，線粒體代謝加快，從而促進B細胞分化；脂多糖刺激下漿母細胞的分化和存活主要依賴于Atg5介導(dǎo)的細胞自噬[41]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，B細胞特異性缺失Atg7的小鼠在針對流感疫苗免疫后顯示正常的一抗反應(yīng)，但在受到流感病毒攻擊時未能產(chǎn)生保護性的二抗反應(yīng)，從而導(dǎo)致高病毒載量、廣泛肺部損傷和死亡率增加，表明細胞自噬在維持記憶B細胞對特定抗原的保護性抗體中發(fā)揮重要作用[42]。綜上所述，自噬可促進B淋巴細胞的生存和早期B細胞祖細胞的發(fā)育。B淋巴細胞通過抗體偶聯(lián)和抗體非依賴作用的結(jié)合在ITP的發(fā)病機制中發(fā)揮核心作用，自身反應(yīng)性B細胞針對抗原產(chǎn)生的自身抗體，特別是針對抗GPIIb/IIIa和(或) GPIb/IX產(chǎn)生的免疫球蛋白G抗體，被認為在ITP的發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用[43-45]。細胞自噬在調(diào)節(jié)B細胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，Atg5和Atg7是主要的自噬調(diào)節(jié)蛋白，但該過程中是否涉及新的自噬途徑及關(guān)鍵分子有待深入研究。

4.3 自噬通過調(diào)控巨核細胞在ITP發(fā)生、發(fā)展中的作用ITP是一種常見的自身免疫介導(dǎo)的出血性疾病，其中血小板膜蛋白變成抗原，刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體，導(dǎo)致血小板減少[46]。大約50%的ITP患者具有自身抗體，這些抗體不僅會破壞血小板，還會損害骨髓中巨核細胞的成熟和血小板生成[47]。研究發(fā)現(xiàn)，ITP小鼠未成熟巨核細胞/血小板和相應(yīng)的祖細胞頻率更高，且吞噬作用增加，導(dǎo)致外周血血小板計數(shù)減少[48]。MCMILLAN等[47]研究發(fā)現(xiàn)，慢性ITP患者的巨核細胞存在缺陷，向正常巨核細胞添加抗血小板抗體會導(dǎo)致巨核細胞增殖受損和異常倍性分布。CAO等[49]通過Atg7基因敲除小鼠模型發(fā)現(xiàn)，核心自噬機制對于正常的巨核細胞生成和血小板功能很重要；在ITP患者中，自噬的喪失阻止了巨核細胞的形成和分化，對血小板生成產(chǎn)生了負面影響，導(dǎo)致血小板體積變大、數(shù)量減少，最終嚴(yán)重阻礙了血小板的生成。為了評估血小板自噬的生理作用，OUSEPH等[50]通過對具有巨核細胞和血小板特異性刪除Atg7小鼠血小板的體外分析發(fā)現(xiàn)，血小板聚集和顆粒包裝存在缺陷，結(jié)果提示自噬與巨核細胞的成熟有關(guān)。細胞自噬對巨核細胞的作用主要表現(xiàn)在2個方面：(1)自噬受損影響造血干細胞向巨核細胞的分化。自噬在維持造血干細胞的干性和微環(huán)境中起重要作用，也是CD34+CD133+細胞自我更新和分化所必需的[51]。盡管自噬在細胞分化中的作用尚不清楚，但有證據(jù)表明其可以控制分化過程[52]。CAO等[49]研究發(fā)現(xiàn)，Atg5-/-小鼠模型表現(xiàn)出異常的巨核細胞分化和增殖以及血小板生成障礙，出現(xiàn)凝血功能降低，最終導(dǎo)致ITP。CD41和CD61是巨核細胞的2個標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn)，Atg7-骨髓細胞中CD41+CD61+細胞的百分比降低，并與凋亡增加和壞死有關(guān)；當(dāng)自噬被bafilomycin A1抑制或雷帕霉素誘導(dǎo)時，觀察到高倍性巨核細胞顯著減少，CD41和CD61共表達細胞以及血小板形成減少；而當(dāng)成熟巨核細胞的自噬發(fā)生改變時，前血小板的形成沒有顯著變化[53]。這一結(jié)果表明，在巨核細胞生成早期，自噬上調(diào)或抑制會影響巨核細胞和血小板生成，自噬是造血干細胞生存和分化為巨核細胞所必需的。(2)自噬異常影響巨核細胞向血小板的分化。造血、巨核細胞生成和分化以及血小板生成是連續(xù)的成熟過程，最后有組織地釋放到血管中，經(jīng)反復(fù)脫落產(chǎn)生循環(huán)的血小板[54]。成熟的巨核細胞可通過特定的細胞表面標(biāo)記來鑒定，包括CD41、CD61、CD42和糖蛋白V。有研究通過Atg7-小鼠模型證明，自噬對正常的巨核細胞生成和血小板功能不可或缺，自噬通量的破壞可導(dǎo)致血小板聚集和黏附的損害[49-55]。另有研究報道，巨核細胞超微結(jié)構(gòu)異常與骨髓巨核細胞凋亡相關(guān)，表明巨核細胞的損傷可能會降低血小板生成[56]。

5 結(jié)語與展望

細胞自噬廣泛存在于真核生物中，通過平衡細胞內(nèi)成分的合成和降解，調(diào)節(jié)細胞的穩(wěn)態(tài)，是一個重要的細胞內(nèi)在保護機制，對于維持細胞穩(wěn)態(tài)、存活、更新至關(guān)重要。隨著研究的不斷深入，有關(guān)細胞自噬發(fā)生、發(fā)展的認識也不斷加深，尤其是自噬調(diào)控機制的發(fā)現(xiàn)，使臨床上可以更好地利用自噬治療疾病和規(guī)避風(fēng)險。

細胞自噬調(diào)控與ITP發(fā)病機制之間存在一定相關(guān)性，包括對T、B淋巴細胞以及巨核細胞功能的調(diào)節(jié)作用。ITP患者的自身抗原如GPIIb/IIIa和GPIb/IX，可能通過自噬而導(dǎo)致細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解形成，從而有助于ITP患者自身免疫的啟動或持續(xù)。但考慮到細胞自噬復(fù)雜的生物學(xué)作用，自噬途徑成員表達改變和自噬功能受損在ITP中的作用仍需進一步研究。通過對異常自噬途徑的適當(dāng)調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)機體免疫失衡，可減輕免疫介導(dǎo)的血小板破壞和(或)血小板生成的抑制。因此，有關(guān)自噬的未來研究可能會導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)新的治療靶標(biāo)，這些靶標(biāo)可為研發(fā)ITP治療的個性化藥物提供新的機會。