黃桂林

（遵義醫(yī)科大學(xué)第五附屬（珠海）醫(yī)院口腔科，廣東 珠海 519180）

放射治療是頭頸部惡性腫瘤治療的主要手段之一，該區(qū)域唾液腺的放射性損傷常常導(dǎo)致口干癥（xerostomia）及唾液分泌減少（hyposalivation）等后遺癥。 近年來(lái)，調(diào)強(qiáng)放療技術(shù)（intensity-modulated radiation therapy，IMRT） 和劑量調(diào)節(jié)手段在頭頸部腫瘤放射治療中逐步應(yīng)用，其部分減少了造成唾液腺損害的放射劑量[1]。 但是，位于頜面部的唾液腺還是不能完全避免輻射的傷害。 目前，臨床上常用的治療方法包括應(yīng)用催唾劑，如匹羅卡品（pilocarpine）、西維美林（cevimeline）及人工唾液等[2]。 輻射性損害的保護(hù)劑Amifostine 近年也在美國(guó)上市， 但其毒性可能對(duì)腫瘤組織具有保護(hù)作用，從而限制了這種藥物在臨床上的應(yīng)用[3-4]。 我國(guó)學(xué)者王松靈教授最近發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充膳食中的硝酸鹽能預(yù)防放射性損害引起的口干[5]。 以上這些治療及預(yù)防措施多數(shù)只能部分減緩臨床癥狀，并未能從根本上修復(fù)損傷后的唾液腺組織及恢復(fù)功能。 從再生醫(yī)學(xué)的角度出發(fā)，本文將對(duì)輻射引起唾液腺分泌功能障礙的原因， 以及近年來(lái)干細(xì)胞及無(wú)細(xì)胞治療的進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 放射性唾液腺功能損傷的表現(xiàn)和機(jī)制

頭頸部鱗狀細(xì)胞癌 （head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC）患者在接受放射治療后的1 周內(nèi)即出現(xiàn)急性唾液腺分泌減少癥狀， 減少量可達(dá)正常唾液流量的50%~60%[6]。 而慢性的唾液分泌減少通常是在頭頸部惡性腫瘤放射治療后的6 個(gè)月后發(fā)生[7]。 慢性口干可以導(dǎo)致語(yǔ)言障礙，吞咽、進(jìn)食困難及消化不良，還可以導(dǎo)致猛性齲、牙周炎、口腔黏膜潰瘍、感染等臨床癥狀，對(duì)患者全身健康造成嚴(yán)重威脅。

放射性唾液腺功能損傷相關(guān)機(jī)制的研究主要是在動(dòng)物模型（主要是鼠）上進(jìn)行的。 在動(dòng)物接受輻射后的3 d 內(nèi)， 其唾液腺功能就會(huì)出現(xiàn)急性損傷并表現(xiàn)出相應(yīng)的癥狀， 主要表現(xiàn)為腺泡細(xì)胞明顯喪失、唾液流量減少較多、唾液成分明顯改變[8]。 輻射的主要損傷機(jī)制包括急性DNA 損害、 腺泡細(xì)胞凋亡、鈣通道調(diào)節(jié)異常即細(xì)胞內(nèi)鈣水平升高、活性氧（reactive oxygen species）對(duì)分泌細(xì)胞的損害。 同時(shí)，在鼠腮腺細(xì)胞中還發(fā)現(xiàn)ATP 酶釋放后激活P2X7受體（purinergic receptor P2X7, P2RX7/P2X7）,導(dǎo)致P2RX7/P2X7 依賴(lài)性前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）的釋放[9]。在30~300 d 后的慢性期，唾液腺組織中纖維化的發(fā)生和唾液流量明顯減少[10]。 慢性期唾液腺損害的主要機(jī)制包括Yes 相關(guān)蛋白（Yes-associated protein, YAP） 增加、 代償性增生（compensatory proliferation）、細(xì)胞衰老、細(xì)胞骨架重排等，這些均導(dǎo)致了慢性病變期間唾液腺組織的損害。 另外，在急性、慢性期均能觀(guān)察到血管神經(jīng)損傷對(duì)唾液腺分泌功能有明顯影響。

輻射引起唾液腺功能損傷的機(jī)制復(fù)雜，各種預(yù)防措施及恢復(fù)功能的治療，如恢復(fù)血管、神經(jīng)支配，利用藥物保護(hù)腺體組織以減輕輻射損害，抗氧化治療等都顯示出了一定的效果。 然而，唾液腺分泌功能的恢復(fù)最終還是需要受損腺體中自身干/祖細(xì)胞的增殖、分化來(lái)補(bǔ)充已經(jīng)耗竭的、負(fù)責(zé)分泌功能的腺泡細(xì)胞的數(shù)量[11]。近年來(lái)，隨著干細(xì)胞及無(wú)細(xì)胞治療研究的發(fā)展，放射性唾液腺損傷治療的研究有了較大進(jìn)展。

2 放射性唾液腺損傷的干細(xì)胞治療及無(wú)細(xì)胞治療的現(xiàn)狀及前景

2.1 放射性唾液腺損傷的干細(xì)胞治療

研究者最初設(shè)想的是在體外植入干細(xì)胞，待干細(xì)胞在損傷組織內(nèi)存活、分化成具有功能結(jié)構(gòu)的組織，從而恢復(fù)機(jī)體功能。 在早年的研究中包括了多種間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的移植治療，如利用骨髓MSCs、造血干細(xì)胞、人羊膜MSCs、牙髓干細(xì)胞、唾液腺干細(xì)胞、 皮膚MSCs 等修復(fù)不同組織的損傷[12]。我們將人羊膜MSCs 經(jīng)腺體局部注射到放射性損傷SD 大鼠唾液腺組織中， 發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞在體內(nèi)存活并部分恢復(fù)了分泌功能[13]。Lim 等[14]將人脂肪MSCs連續(xù)3 周（每周1 次）經(jīng)C3H 鼠的尾靜脈注射，12 周后，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)放射性損傷唾液腺的唾液流率明顯增加,唾液分泌延遲時(shí)間（salivation lag times）明顯縮短，在第4 周時(shí)，在損傷腺體內(nèi)還能找到移植的脂肪MSCs， 這些干細(xì)胞部分已經(jīng)分化成了具有分泌功能的頜下腺上皮細(xì)胞 （salivary gland epithelial cells, SGCs）。 Pringle 等[15]將人頜下腺組織中分離培養(yǎng)得到的、在體外培養(yǎng)具有自我更新能力的c-kit+成體干細(xì)胞直接注射到輻射后損傷的鼠唾液腺腺體組織中，結(jié)果顯示，這些c-kit+干細(xì)胞在鼠的體內(nèi)能自我更新、分化，最后具有修復(fù)唾液腺的分泌功能。Lombaert 等[16]將唾液腺干細(xì)胞移植到放射性損傷的唾液腺組織中后，干細(xì)胞能定植在唾液腺的主要導(dǎo)管處分化成腺泡細(xì)胞， 并形成腺泡樣及導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)，進(jìn)而改善腺體的分泌功能。 隨后的一系列研究發(fā)現(xiàn)，c-kit+的唾液腺成體干細(xì)胞在修復(fù)放射性損傷唾液腺功能方面相比其他的干細(xì)胞， 具有明顯的優(yōu)勢(shì)[15]。盡管c-kit+干細(xì)胞在修復(fù)放射性損傷唾液腺方面具有明顯優(yōu)勢(shì)，但是在作為干細(xì)胞供體來(lái)源的腺體中，這類(lèi)細(xì)胞的數(shù)量卻很少，而且隨著年齡的增加，數(shù)量減少得更加明顯，導(dǎo)致治療性來(lái)源的干細(xì)胞獲取困難[17]。

放射性唾液腺損傷的干細(xì)胞治療除了干細(xì)胞來(lái)源不足、數(shù)量不足等問(wèn)題外，還面臨著許多其他挑戰(zhàn)。 如移植到組織內(nèi)的單個(gè)干細(xì)胞很難在受體細(xì)胞、神經(jīng)及血管再生，以及炎癥調(diào)節(jié)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)[18]。另外，用于自體移植的唾液腺干細(xì)胞還存在免疫反應(yīng)，植入體內(nèi)瘤變，細(xì)胞在體內(nèi)能否長(zhǎng)期存活、分化及增殖，進(jìn)而發(fā)揮功能等問(wèn)題。 而且MSCs 在體內(nèi)長(zhǎng)期存活并分化為腺泡細(xì)胞的證據(jù)并不確切。 有報(bào)道稱(chēng)，干細(xì)胞移植后的1 周，只有<1%的細(xì)胞能夠存活下來(lái)[19]。 Su 等[20]把這些挑戰(zhàn)總結(jié)歸納為：①獲得唾液腺干細(xì)胞進(jìn)行侵入性手術(shù)存在困難；②獲取的唾液腺組織有限，難以進(jìn)行干細(xì)胞擴(kuò)增；③將干細(xì)胞輸送到損傷組織存在困難，如通過(guò)血管輸送干細(xì)胞很可能導(dǎo)致血栓栓塞的并發(fā)癥；④如是異體移植干細(xì)胞則可能產(chǎn)生排斥反應(yīng)；⑤唾液腺干細(xì)胞在運(yùn)輸配送方面存在問(wèn)題。

有學(xué)者在對(duì)唾液腺主導(dǎo)管進(jìn)行結(jié)扎制作的腺體損傷模型中發(fā)現(xiàn)，結(jié)扎導(dǎo)致腺體內(nèi)的腺泡上皮細(xì)胞損傷，而這種損傷可以被腺體內(nèi)位于導(dǎo)管內(nèi)皮的唾 液 腺 干/祖 細(xì) 胞 （salivary gland stem/progenitor cells）通過(guò)增殖和分化而修復(fù)[21]。 另外，人們觀(guān)察到少數(shù)接受IMRT 的頭頸腫瘤患者， 其分泌功能可以部分自行恢復(fù)[22]。以上研究表明，無(wú)論是導(dǎo)管結(jié)扎的機(jī)械性損傷還是放射性損傷的腺體組織，其自身的內(nèi)源性干細(xì)胞均能在一定條件下增殖、分化，從而對(duì)損傷的腺體組織進(jìn)行自我修復(fù)，進(jìn)而恢復(fù)腺體的分泌功能。 人們以往觀(guān)察到的干細(xì)胞移植修復(fù)放射性損傷唾液腺功能的原因可能并非是植入腺體組織內(nèi)干細(xì)胞分化成腺泡細(xì)胞的結(jié)果，而是移植的干細(xì)胞通過(guò)旁分泌作用于腺體自身內(nèi)源性干細(xì)胞的結(jié)果。 也就是說(shuō)，放射性損傷后，唾液腺組織的內(nèi)源性干細(xì)胞可以在一定條件的刺激下增殖、 分化，進(jìn)行受損腺體的功能修復(fù)。Mimeault 等[23]認(rèn)為，組織內(nèi)存活并駐留的干細(xì)胞能夠繼續(xù)釋放生長(zhǎng)因子對(duì)損傷的組織進(jìn)行修復(fù)， 并能分化為組織特異性細(xì)胞（tissue-specific cells）。Pringle 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)激活唾液腺組織中受到放射性損傷而處于休眠狀態(tài)的內(nèi)源性干細(xì)胞，可以自我修復(fù)損傷唾液腺的部分分泌功能。 Nguyen 等[24]也證實(shí)了放射性損傷后，鼠的腮腺組織內(nèi)仍能夠分離培養(yǎng)出能形成腺體細(xì)胞微球（salisphere）的單個(gè)細(xì)胞，他們進(jìn)而認(rèn)為放射性損傷唾液腺功能的修復(fù)可以通過(guò)這些干細(xì)胞的分化、增殖來(lái)實(shí)現(xiàn)。 以上研究均說(shuō)明，只要能激活放射性損傷唾液腺組織內(nèi)本身尚存的、處于休眠狀態(tài)的干細(xì)胞，促使它們?cè)鲋场⒎只癁楣δ苄韵倥菁?xì)胞，進(jìn)而恢復(fù)分泌功能，就能達(dá)到修復(fù)損傷腺體功能的目的。 這些研究成果為無(wú)細(xì)胞治療的研究提供了理論依據(jù)。

2.2 放射性唾液腺損傷的無(wú)細(xì)胞治療

近年來(lái)，干細(xì)胞治療的模式開(kāi)始逐步轉(zhuǎn)變。 最初人們?cè)O(shè)想的干細(xì)胞在病灶區(qū)增殖、分化，重新構(gòu)建組織結(jié)構(gòu)的愿望并未完全實(shí)現(xiàn)。 有研究發(fā)現(xiàn)，被標(biāo)記的MSCs 注入體內(nèi)后， 雖然有部分細(xì)胞能夠到達(dá)受植靶器官，但這些干細(xì)胞很快就消失了。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)， 經(jīng)靜脈注入的MSCs 雖然有少部分能夠到達(dá)受損組織，但大部分都被肺部的毛細(xì)血管攔截并清除了[25]。 盡管干細(xì)胞能否在體內(nèi)存活的問(wèn)題受到質(zhì)疑， 但MSCs 植入體內(nèi)的短期治療效果是肯定的。 多年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，MSCs 能產(chǎn)生大量的生長(zhǎng)因子并能調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。 有研究也證實(shí)了SD 大鼠唾液腺細(xì)胞與人羊膜上皮細(xì)胞（amniotic epithelial cell）之間存在細(xì)胞旁分泌的交互作用，細(xì)胞因子在細(xì)胞之間的相互影響[26]?；谶@些發(fā)現(xiàn)，學(xué)者們逐漸意識(shí)到移植到損傷組織內(nèi)的干細(xì)胞起到的修復(fù)治療作用實(shí)際是旁分泌因子的結(jié)果，而非移植入體內(nèi)存活的干細(xì)胞進(jìn)行再生修復(fù)的結(jié)果[27]。Bruno 等[28]及Lai 等[29]的研究分別證實(shí)了MSCs 來(lái)源的細(xì)胞微囊泡（microvesicles，MVs）、外泌體能防止腎臟損傷，減少心肌梗死的面積。隨后，包括MSCs 的細(xì)胞裂解液（extract）、分泌物（secretome）、外囊泡（EVs）及外泌體對(duì)放射性損傷組織再生修復(fù)的研究均證實(shí)了它們的治療效果。 Tran 等[30]在前期應(yīng)用骨髓來(lái)源細(xì)胞移植重建輻射損傷的唾液腺功能成功的基礎(chǔ)上，將該細(xì)胞裂解后的胞內(nèi)可溶性物質(zhì)用于治療放射性損傷小鼠的腺體功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是局部腺體內(nèi)注射還是靜脈注射，裂解液均能修復(fù)唾液腺的功能，保護(hù)唾液腺的腺泡細(xì)胞、導(dǎo)管及肌上皮細(xì)胞和干細(xì)胞， 還能促進(jìn)損傷組織中細(xì)胞和血管增殖，上調(diào)與組織再生和修復(fù)相關(guān)的基因， 如MMP2、CyclinD1、BMP7、EGF、NGF 基因。 他們將這種細(xì)胞提取物命名為“骨髓細(xì)胞湯（bone marrow soup）”。 An等[31]在研究低氧預(yù)處理脂肪干細(xì)胞修復(fù)放射性損傷唾液腺功能的機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，放射損傷后，唾液腺組織內(nèi)上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肌上皮細(xì)胞和涎腺干細(xì)胞均受到MSCs 分泌的蛋白質(zhì)組 （secreted proteome）的保護(hù)，其富含GM-CSF、VEGF、IL-6、IGF-1等促進(jìn)組織修復(fù)的相關(guān)因子，他們認(rèn)為放射損傷唾液腺組織修復(fù)的部分原因應(yīng)該是MSCs 分泌的營(yíng)養(yǎng)因子作用的結(jié)果。 Lombaert 等[16]總結(jié)了MSCs 中含有 的EGF、FGF2/7、G-CSF、SHH、VEGF、WNT 等 各種細(xì)胞因子的作用：它們通過(guò)各種信號(hào)途徑阻止放射性損傷細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)腺體內(nèi)處于休眠狀態(tài)的內(nèi)源性干細(xì)胞增殖，減少氧化應(yīng)激反應(yīng)和脂質(zhì)的過(guò)氧化反應(yīng)；用這些分泌物修復(fù)損傷組織的效果明顯優(yōu)于全細(xì)胞、單個(gè)或多個(gè)因子的聯(lián)合應(yīng)用。 Su 等[20]切取人的小唾液腺（頰腺）后進(jìn)行唾液腺干細(xì)胞分離、擴(kuò)增，然后對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行3 個(gè)循環(huán)的凍融，高速離心后獲得頰部唾液腺干細(xì)胞提取液 （labial stem cells extract，LSCE），將這些提取液經(jīng)血管注射到放射性唾液腺損傷的小鼠體內(nèi)，損傷的唾液腺功能得到部分恢復(fù)。 他們還檢測(cè)到這些提取液中主要含有與血管形成相關(guān)的生物因子（FGF-1、FGF-2、KGF、angiopoietin、uPA、VEGF）和有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用的血管形成因子（PEDF、PTX3、VEGF）。 這些生物因子對(duì)放射性損傷的唾液腺均有保護(hù)和功能修復(fù)作用。 如在LSCE 中表達(dá)最高的FGF-2，是一種眾所周知的有絲分裂素，在血管生成和傷口愈合中起重要作用。 另外，轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞的FGF-2 是放射性損傷唾液腺治療的關(guān)鍵因子。 該因子對(duì)放射誘導(dǎo)的唾液腺細(xì)胞凋亡也具有明顯的保護(hù)作用[32-33]。 這些研究說(shuō)明，利用干細(xì)胞分泌的生物活性因子就有可能修復(fù)放射性損傷的唾液腺組織，進(jìn)而恢復(fù)其分泌功能。

隨著研究的進(jìn)展， 人們逐步認(rèn)識(shí)到應(yīng)用MSCs來(lái)源的EVs 正成為可能代替干細(xì)胞治療的有效手段。 EVs 是細(xì)胞釋放的一類(lèi)膜性小囊，主要包括外泌體和MVs。 EVs 中含有多種生物活性物質(zhì)，如mRNA、 miRNA、非編碼RNA（non-coding RNA）、蛋白、脂質(zhì)體及DNA。這些物質(zhì)具有減輕炎癥、促血管生成和促進(jìn)損傷組織內(nèi)干/祖細(xì)胞存活及增殖的組織修復(fù)作用[34]。

雖然迄今為止我們還未查閱到有關(guān)EVs 修復(fù)放射性損傷唾液腺功能的相關(guān)信息。 EVs 在修復(fù)造血系統(tǒng)、肝臟、肺、消化道系統(tǒng)及皮膚的放射性損傷中有相關(guān)報(bào)道[35]。有研究證實(shí)，MSCs 可通過(guò)分泌EVs發(fā)揮其復(fù)雜的旁分泌抗炎、 抗纖維化和促再生作用，進(jìn)而修復(fù)放射性損傷的組織[36]。EVs 主要是通過(guò)提高組織或器官中干/祖細(xì)胞的增生及存活來(lái)促進(jìn)血管增生，抗炎、抗氧化作用，以及減少纖維化發(fā)生來(lái)達(dá)到修復(fù)組織放射性損傷的目的[37]。在神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)疾病的治療研究中，MSCs外泌體也表現(xiàn)出了理想的組織修復(fù)效果[38]。 外泌體對(duì)組織損傷修復(fù)的主要機(jī)制包括減輕炎癥反應(yīng)、促血管生成及促進(jìn)損傷組織內(nèi)干/祖細(xì)胞存活及增殖的組織修復(fù)作用[34]。 還有研究發(fā)現(xiàn)，受到輻射的細(xì)胞膜上高表達(dá)能促進(jìn)外泌體被受損細(xì)胞攝取整合素和四磷酸復(fù)合物CD29/CD81[39]。外泌體可通過(guò)miRNA 保護(hù)輻射對(duì)組織造成的急性或慢性損傷，這表明輻射照射后，細(xì)胞可能利用外泌體來(lái)增加其對(duì)電離輻射的抵抗力[40]。 miRNA-210 可通過(guò)控制缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）的轉(zhuǎn)錄從而對(duì)輻射損傷的細(xì)胞DNA 進(jìn)行有效修復(fù)[41]。到目前為止，外泌體修復(fù)放射性損傷組織的具體作用機(jī)制并不清楚。Pu 等[35]在造血系統(tǒng)放射性損傷的研究中認(rèn)為， 其機(jī)制包括3 個(gè)方面： ①外泌體中的miRNA 對(duì)放射損傷的血細(xì)胞具有促進(jìn)再生和抗凋亡作用， 比如骨髓基質(zhì)干細(xì)胞外泌體中，miRNA-221、miRNA-451、miRNA-654-3p 能促進(jìn)放射損傷骨髓細(xì)胞再生， 而miRNA-210-5p、miRNA-106b-3p 和miRNA-155-5p 能防止血細(xì)胞的凋亡；②外泌體可以通過(guò)刺激造血相關(guān)細(xì)胞因子的分泌來(lái)恢復(fù)造血功能，研究表明，外泌體能夠在體外誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生高水平的造血相關(guān)細(xì)胞因子，如G-CSF、IL-6、IL-8及VEGF； ③骨髓MSCs 外泌體能直接恢復(fù)輻射后的骨髓MSCs[35]。

2.3 放射性唾液腺損傷再生醫(yī)學(xué)研究的前景

非細(xì)胞治療在放射性損傷組織修復(fù)再生的研究中表現(xiàn)出良好的效果，也給以后可能的標(biāo)準(zhǔn)化治療提供了希望。 但是，包括其他組織在內(nèi)的唾液腺放射性損傷的非細(xì)胞修復(fù)治療尚存在許多問(wèn)題，如放射性組織損傷修復(fù)的具體機(jī)制， 特別是miRNA及non-coding RNA 等的再生修復(fù)機(jī)制仍不清楚，有待深入研究。 另外，MSCs 分泌的細(xì)胞因子和（或）外泌體攜帶物的穩(wěn)定性問(wèn)題， 如MSCs 在體外低氧預(yù)處理后，其分泌的細(xì)胞因子與常氧處理后的細(xì)胞因子有一定變化；而體外培養(yǎng)條件也會(huì)影響干細(xì)胞外泌體中miRNA 的攜帶量[42]。 此外，無(wú)細(xì)胞治療的細(xì)胞因子或是外泌體在純化、所含成分的定性及定量上都存在許多困難。 這些因素都影響了研究結(jié)果的一致性，也是下一步需要研究的問(wèn)題。 不過(guò)，多年的研究也證實(shí)，無(wú)論是MSCs 的裂解液、分泌物蛋白還是EVs，在放射性唾液腺或其他組織/器官損傷中的修復(fù)治療效果都是肯定的。 我們認(rèn)為，放射性唾液腺功能損害的修復(fù)應(yīng)該包括再生醫(yī)學(xué)在內(nèi)的多種手段的綜合治療，這樣才可能達(dá)到更好的治療效果。