施佳君 楊欽欽 富丹婷 鄭純威 黃 強(qiáng) 陳 宇

浙江省中醫(yī)藥研究院 浙江 杭州 310007

心力衰竭（heart failure，HF）是各種心臟疾病的終末階段，具有發(fā)病率高，死亡率高的特點(diǎn)。心衰的產(chǎn)生受多種因素影響，蒽環(huán)類抗癌藥物長(zhǎng)期使用的患者中后期常出現(xiàn)心力衰竭癥狀。阿霉素是一種有效且常用的化療藥，具有劑量依賴的心臟毒性，使其在臨床使用中受到限制[1]。因此，迫切需要找到新的輔助治療方案，降低化療過(guò)程中對(duì)心臟的毒副作用，保護(hù)心臟。

從丹參和川芎中提取而成的冠心寧片（GXN），具有活血化瘀，通脈養(yǎng)心的功效。本課題組前期的研究表明，冠心寧片具有抗炎、降低炎癥因子水平、降低心肌耗氧量、調(diào)節(jié)缺血缺氧狀態(tài)下的氧代謝和能量供需平衡,改善心衰小鼠的心肌細(xì)胞凋亡等多途徑多靶點(diǎn)的作用[2-4]。越來(lái)越多的證據(jù)表明冠心寧片在臨床上對(duì)心衰防治有益，但其治療作用的分子機(jī)制仍然未知，基于此，本研究觀察冠心寧片對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的心衰大鼠心臟的保護(hù)作用，探討冠心寧片的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物：冠心寧片，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z20150028，由正大青春寶藥業(yè)有限公司提供。地高辛片，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H33021738，由賽諾菲（杭州）制藥有限公司提供。注射用鹽酸多柔比星（阿霉素），批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H33021980，由瀚暉制藥有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)雄性SD大鼠30只，6～8周齡，體重180～220g，購(gòu)于杭州醫(yī)學(xué)院[SCXK（浙）2019-0002]，飼養(yǎng)于浙江省中醫(yī)藥研究院SPF級(jí)屏障實(shí)驗(yàn)室[SYXK（浙）2019-0010]，環(huán)境溫度：（22±2）℃，相對(duì)濕度50%～65%，光照12h明暗交替，噪音＜50dB。實(shí)驗(yàn)期間，遵循3R原則給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人道主義的關(guān)懷。倫理審查批號(hào)：浙中研動(dòng)物倫理審字第[2022]014號(hào)。

1.3 主要試劑與儀器：分述如下。

1.3.1 主要試劑：NT-proBNP試劑盒（H334-1-1/20220516）、IL-1β試劑盒（H022-1-1/20220516）和IL-18試劑盒（H015-1-1/20220516）購(gòu)于南京建成，β-actin（B661202）及PCR引物的設(shè)計(jì)合成購(gòu)于生工生物；TRTzol Reagent RNA提取試劑（15596-026）購(gòu)于invitrogen公司；PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒（RR036A）、TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ 試 劑 盒（RR820A）購(gòu)于日本 TaKaRa公司。

1.3.2 主要儀器：M9vet小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)（深圳邁瑞動(dòng)物醫(yī)療有限公司）；脫水機(jī)及包埋機(jī)（湖北貝諾醫(yī)療科技有限公司）；轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)（徠卡顯微系統(tǒng)上海有限公司）；Power Wave XS型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Gene Company Limited）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法：分述如下。

1.4.1 模型的建立與分組給藥：將30只SD大鼠（雄性）按體質(zhì)量隨機(jī)分成5組，即為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、GXN低劑量組（600mg/kg）、GXN高劑量組（1200mg/kg）、地高辛組（0.05mg/kg），每組6只。正常對(duì)照組和模型對(duì)照組每日灌胃純水10mL/kg，GXN低、高劑量組、地高辛組每日對(duì)應(yīng)的劑量連續(xù)給藥9周。給藥的當(dāng)天開(kāi)始阿霉素造模，每5天腹腔注射（i.p.）2.5mg/kg，連續(xù)7次，累積濃度17.5mg/kg。

1.4.2 狀態(tài)觀察：試驗(yàn)中，觀察大鼠的精神狀態(tài)，二便情況及毛色狀態(tài)，并統(tǒng)計(jì)存活情況。

1.4.3 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)：給藥9周時(shí)行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)。大鼠異氟烷誘導(dǎo)麻醉后，使用超聲影像系統(tǒng)記錄 M型超聲心動(dòng)圖。選取連續(xù) 3個(gè)心動(dòng)周期上測(cè)量各指標(biāo)取其平均值。統(tǒng)計(jì)各組大鼠左室舒張末期室間隔厚度（IVSd）、左室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）、左室后壁舒張末期厚度（LVPWd）、舒張末期容積（EDV）、左室收縮末期室間隔厚度（IVSs）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVIDs）、左室后壁收縮末期厚度（LVPWs）、收縮末期容積（ESV）、每搏輸出量（SV）、射血分?jǐn)?shù)(EF)和短軸率（FS）等指標(biāo)。

1.4.4 血液指標(biāo)檢測(cè)：大鼠行頜下靜脈取血，分離血清備用，用于測(cè)定N末端腦利鈉肽前體（NT-proBNP）水平。

1.4.5 心肌組織病理學(xué)觀察：取大鼠心臟非心尖部分置于10%中性甲醛溶液中固定1周后，脫水，透明，浸蠟，包埋。制成蠟塊后，用切片機(jī)切成4μm薄片，待用于病理染色分析。①蘇木素-伊紅（HE）染色：行HE染色，掃描后用K-Viewer觀察心肌組織病理變化。②Masson染色：Masson染色按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，評(píng)估心肌纖維化程度，使用Image-ProPlus軟件測(cè)算每個(gè)切片各視野的心肌組織膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF）（CVF=膠原藍(lán)色陽(yáng)性面積 /心肌組織總面積×100%）[5]。

1.4.6 RT-PCR檢測(cè)焦亡相關(guān)基因的蛋白表達(dá)：使用TRIzol法提取各組心肌組織的RNA，按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和Real-time PCR檢測(cè)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37℃ 15min，85℃ 5s，4℃保存。RT-PCR反應(yīng)條件：95℃ 30s，95℃ 5s，60℃ 30s，40 個(gè)循環(huán)；熔解曲線95℃ 15s，60℃ 60s，95℃ 15s。以β-Actin作為內(nèi)參基因，通過(guò)2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，各目的基因的引物序列。見(jiàn)表1。

表1 定量PCR的引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：用SPSS 19.0軟件和Image-Pro Plus分析數(shù)據(jù)，以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)量資料應(yīng)用ANOVA方差分析評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果，組間比較采用LSD分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察：正常組大鼠狀態(tài)良好，毛色光亮順滑，實(shí)驗(yàn)期間未出現(xiàn)死亡；模型對(duì)照組大鼠前4周未見(jiàn)明顯異常，第5周開(kāi)始出現(xiàn)輕微腹水，狀態(tài)萎靡，后期出現(xiàn)嚴(yán)重腹水、腹瀉癥狀，期間死亡1只；冠心寧低、高劑量組和地高辛組狀態(tài)均較模型組有所改善，期間均未出現(xiàn)死亡。

2.2 大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能改變：9周后，與正常對(duì)照組比，模型對(duì)照組 IVSd、IVSs、LVPWs、SV顯著減?。≒＜0.01，P＜0.05），LVIDs、ESV顯著增加（P＜0.01），F(xiàn)S、EF顯著降低（P＜0.01），心率顯著減緩（P＜0.05）。與模型對(duì)照組相比，GXN低劑量組IVSs、SV、FS、EF和HR（P＜0.01，P＜0.05）顯著增加；GXN 高劑量組 IVSs、LVIDs、SV、FS和EF（P＜0.01，P＜0.05）顯著增加，ESV（P＜0.01）顯著降低；地高辛組IVSs、LVIDs、FS和EF（P＜0.01，P＜0.05）顯著增加，ESV（P＜0.01）顯著降低。見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠超聲心動(dòng)圖指標(biāo)分析

2.3 血清NT-proBNP的指標(biāo)變化：給藥9周后，與正常組相比，模型組的NT-proBNP顯著升高（P＜0.01）；給予不同劑量的冠心寧片和地高辛后，各組的NT-proBNP較模型組均顯著降低（P＜0.01，P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 大鼠血清NT-proBNP變化

2.4 冠心寧片對(duì)大鼠心肌病理形態(tài)的影響：HE染色顯示，正常對(duì)照組心肌細(xì)胞排列致密規(guī)則，細(xì)胞核呈橢球形，位于細(xì)胞中央，細(xì)胞形態(tài)完整，間隙清楚分明，周圍血管清晰，有薄層結(jié)締組織；模型對(duì)照組心肌組織分布不規(guī)則，結(jié)構(gòu)雜亂，心肌細(xì)胞形態(tài)改變，肌纖維增厚，部分肌纖維斷裂，心肌細(xì)胞肥大，間隙增大，血管的基本結(jié)構(gòu)喪失不飽滿，結(jié)締組織增生，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。給予不同濃度的冠心寧片和地高辛后，心肌組織損傷有一定的改善，心肌組織排列較為緊密，肌纖維斷裂的情況顯著改善，血管形態(tài)和外膜結(jié)締組織得到控制，炎癥浸潤(rùn)減少。見(jiàn)圖3。

2.5 冠心寧片對(duì)大鼠心肌纖維化的影響：Masson染色顯示，正常組心肌細(xì)胞形態(tài)正常，無(wú)明顯的膠原沉積。模型組細(xì)胞間隙大量膠原纖維沉積，給予冠心寧片后，細(xì)胞間隙的膠原纖維明顯減少。見(jiàn)圖4。

圖4 大鼠心肌組織Masson染色圖（200×）

模型對(duì)照組的CVF顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01）；與模型對(duì)照組比，各給藥組及地高辛組的CVF均顯著下降（P＜0.01，P＜0.05），提示冠心寧片能顯著降低阿霉素誘導(dǎo)的心肌纖維化。見(jiàn)圖5。

圖5 大鼠心肌組織膠原容積分?jǐn)?shù)

2.6 冠心寧片對(duì)焦亡相關(guān)基因表達(dá)的影響：由圖6可知，模型對(duì)照組NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18的mRNA水平較正常對(duì)照組均顯著升高（P＜0.01），給予GXN后，NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18的mRNA水平均有不同程度的降低（P＜0.01，P＜0.05）。

圖6 大鼠心肌組織mRNA的差異表達(dá)

3 討論

HF是由多種因素引起的慢性心功能障礙疾病，其最基本的原因是心臟收縮或舒張功能障礙，導(dǎo)致心臟射血無(wú)法滿足機(jī)體的需求[6]。中醫(yī)學(xué)對(duì)心力衰竭沒(méi)有明確的定義，根據(jù)辨證論治和病因病機(jī)多將其歸為“胸痹”“真心痛”[7]。冠心寧是根據(jù)中醫(yī)學(xué)“活血化瘀”理論和多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而來(lái)，用于治療心臟疾病的代表復(fù)方，主要由丹參和川芎組成。同時(shí)，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，丹參和川芎中的多糖類和酚酸類在心血管治療中起到了重要作用[8]。

蒽環(huán)類化療藥阿霉素作為有效的化療藥，常導(dǎo)致心臟毒副作用，主要表現(xiàn)為左心室功能障礙最終導(dǎo)致充血性心衰和擴(kuò)張性心肌病，本研究運(yùn)用該原理通過(guò)多次阿霉素腹腔注射建立心衰模型[9]。本研究結(jié)果顯示，冠心寧片能改善HF大鼠的存活情況，降低血清NT-proBNP、IL-1β和IL-18水平，表明冠心寧片對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的心衰大鼠心臟有保護(hù)作用。

阿霉素誘導(dǎo)的心衰表現(xiàn)為心肌擴(kuò)張、結(jié)構(gòu)重塑[10]超聲心動(dòng)結(jié)果顯示IVSd、IVSs、LVPWd、LVPWs均顯著降低，ESV顯著增加，冠心寧片干預(yù)后，沒(méi)有模型對(duì)照組改變的那么明顯，冠心寧片可延緩心肌擴(kuò)張、結(jié)構(gòu)重塑。本研究顯示，阿霉素誘導(dǎo)的心衰大鼠SV、EF、FS顯著降低，表明心臟功能嚴(yán)重?fù)p傷，GXN干預(yù)后，這些指標(biāo)顯著增加，提示GXN可保護(hù)阿霉素誘導(dǎo)的心臟功能損傷，但是與給藥劑量并沒(méi)有明顯的依賴性，可能與劑量的設(shè)置有關(guān)系。

心臟的舒縮功能與心臟的順應(yīng)性密切相關(guān)，心肌間質(zhì)膠原沉積形成的纖維化是導(dǎo)致順應(yīng)性降低的主要原因，是各種心臟疾病末期的必然結(jié)果，是心室重構(gòu)的重要形式。HE和Masson染色顯示，心衰大鼠心肌發(fā)生了明顯的病理改變，且產(chǎn)生了大面積的纖維化，冠心寧片干預(yù)后，心臟的病理改變得到顯著緩解，纖維化明顯減少，表明冠心寧片可抑制膠原沉積，改善心臟重塑，提示抑制心肌纖維化可能是冠心寧片保護(hù)阿霉素誘導(dǎo)的心衰大鼠的重要機(jī)制之一。

研究顯示，阿霉素可通過(guò)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致NLRP3炎癥小體激活，使Caspase-1活性增強(qiáng)，促進(jìn)IL-18和IL-1β的成熟，加重炎癥反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞膨脹并最終溶解，從而誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡[11]，并且細(xì)胞焦亡是除凋亡之外誘導(dǎo)心肌損傷的另一種重要形式，可導(dǎo)致心肌收縮功能下降，進(jìn)而導(dǎo)致心衰。研究結(jié)果顯示，模型對(duì)照組的NLRP3、Caspase-1、IL-18和IL-1β的mRNA表達(dá)顯著增加，冠心寧片干預(yù)后，這些指標(biāo)的mRNA有所降低，血清中IL-18和IL-1β水平亦降低，進(jìn)一步證實(shí)了冠心寧片具有抵抗心肌細(xì)胞焦亡的作用。

綜上所述，冠心寧片能改善HF大鼠的存活情況，改善心肌重塑，增強(qiáng)心臟的功能，降低心肌纖維化，其作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制Caspase-1介導(dǎo)的焦亡通路來(lái)減少心肌細(xì)胞焦亡，從而保護(hù)心衰大鼠。這也為長(zhǎng)期使用阿霉素抗癌而導(dǎo)致心臟毒性副作用的患者提供了新的保護(hù)策略。