任澤明 陳思思 陳 璇 童曄玲 戴關(guān)海 薛曉敏 吳人照

浙江省中醫(yī)藥研究院 浙江 杭州 310007

鐵皮楓斗顆粒（簡(jiǎn)稱GD）由鐵皮石斛和西洋參組方而成，中醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)記載石斛具有“厚腸胃”“平胃氣”“養(yǎng)胃生津”等功效，西洋參可益氣滋陰，所以鐵皮楓斗顆粒既往已批準(zhǔn)的主要功能為益氣養(yǎng)陰、養(yǎng)胃生津。因此，該藥是氣陰兩虛證型慢性萎縮性胃炎（CAG）的有效藥物。前期我們一些研究提示，該藥對(duì)CAG有一定的療效[1,2]。為了進(jìn)一步研究其對(duì)CAG及其并發(fā)癥（上皮內(nèi)瘤變和腸化）的治療效果，以及可能的機(jī)制，更好地利用該藥物提供科學(xué)依據(jù)，開(kāi)展了下述研究。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物：Wistar大鼠：12周齡，體質(zhì)量（180±20）g，均為雌性，SPF級(jí)。購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006，合格證號(hào)：1100111911044265；動(dòng)物飼養(yǎng)于浙江省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SYXK（浙2019-0010）。

1.2 藥物：鐵皮楓斗顆粒（浙江天皇藥業(yè)有限公司提供）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模及分組：以12周齡Wistar大鼠70只，15只為正常組，其余55只，采用綜合法造模：采用同品系大鼠胃黏膜添加弗氏佐劑（m：v=1∶1），制備胃黏膜細(xì)胞懸液，腹部皮下注射0.5mL/只，兩周后再次注射。然后經(jīng)口給予60%的酒精溶液，1mL/只，間隔1個(gè)月，再給予1次。在此期間，配制20%的酒精溶液放在水瓶中供自由飲用。取模型組大鼠兩只，對(duì)照組兩只處死，做胃組織病理檢查，觀察成模情況。根據(jù)病理結(jié)果，改成亞硝基胍水溶液167μg/mL放入避光的水瓶自由飲用繼續(xù)造模，1個(gè)月后，再次取模型組大鼠3只，對(duì)照組3只，做病理檢查，觀察到基本成模后，將造模的動(dòng)物，隨機(jī)分成高、中、低3個(gè)劑量組，另設(shè)模型組及正常組作為對(duì)照，開(kāi)始給予治療，同時(shí)亞硝基胍水溶液繼續(xù)飲用。治療周期為3個(gè)月。

2.2 指標(biāo)檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)結(jié)束，腹腔注射麻醉大鼠，解剖取材，標(biāo)本為全胃，上段留0.5cm食管，下段留1.5cm十二指腸，沿胃大彎剪開(kāi)，一半用大頭針、塑料泡沫板固定，浸于10%甲醛溶液中。委托浙江中醫(yī)藥大學(xué)做病理檢查，分別做HE染色和AB染色。掃描病理切片，觀察胃黏膜炎癥情況、腺體厚度、腺體數(shù)目、上皮內(nèi)瘤變、腸化生、壁細(xì)胞和主細(xì)胞數(shù)目等項(xiàng)目。另一半凍存，采用全自動(dòng)蛋白定量檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)目標(biāo)蛋白烯酯酰輔酶A水合酶1（Ech1）、Bcl-2相關(guān)X（Bax）及B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）進(jìn)行定量檢測(cè)。

2.3 病理閱片：①胃黏膜炎癥情況：用半定量法，即在低倍鏡下觀察整個(gè)胃黏膜，然后在胃竇部取10個(gè)視野，參照1994年美國(guó)休斯敦提出的胃炎診斷標(biāo)準(zhǔn)，按炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的程度分為0～3 7個(gè)級(jí)別。②胃黏膜腺體厚度：每張切片取胃竇部黏膜5個(gè)視野，用測(cè)微器測(cè)出每個(gè)視野的胃竇黏膜腺體厚度，得出每張切片5個(gè)視野的平均值（μm）。③胃腺體數(shù)目：100倍鏡下，找到每只大鼠的幽門(mén)環(huán)0.2～1.2mm（200～1200μm）之間（即1mm范圍）胃竇固有腺體總個(gè)數(shù)，單位以“個(gè)/mm”表示。④上皮內(nèi)瘤變：每張切片取5個(gè)高倍鏡視野觀察胃黏膜上皮細(xì)胞有無(wú)細(xì)胞核多形性，腺體不典型增生（采用輕、中、重級(jí)別報(bào)告）。⑤壁細(xì)胞、主細(xì)胞數(shù)目：400倍鏡下，每張切片取前胃和胃體部交界以下1.0mm開(kāi)始的胃體部黏膜5個(gè)視野平均值。⑥腸上皮化生表現(xiàn)：AB染色，觀察胃黏膜的腸化情況（杯狀細(xì)胞等）。每個(gè)動(dòng)物胃黏膜病理切片經(jīng)濱松數(shù)字切片掃描系統(tǒng)掃描后，在100倍放大截取3張胃竇部黏膜照片，照片分辨率1920×1216，實(shí)際物理尺寸：1.70mm×1.06mm，各組在相同條件下操作。采用ImagePro Plus 6.0（IPP6.0）圖像分析系統(tǒng)分析，各組以相同條件下選取每張照片的陽(yáng)性總面積、平均光密度、總光密度，進(jìn)行組間統(tǒng)計(jì)比較。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，多組均數(shù)比較，先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)后采用方差分析，若差異有顯著性，進(jìn)一步兩兩比較，若方差不齊，采用Dunnett T3檢驗(yàn)，P＜0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)于計(jì)數(shù)資料，根據(jù)不同等級(jí)進(jìn)行賦值，轉(zhuǎn)化成計(jì)量資料進(jìn)行分析。

4 結(jié)果

4.1 鐵皮楓斗顆粒對(duì)大鼠體質(zhì)量及相關(guān)臟器的影響：經(jīng)統(tǒng)計(jì)，與正常組比較，模型組在初始體質(zhì)量、終末體質(zhì)量及肝臟濕重上有顯著差異（P＜0.05），在胃組織重量有所降低，但差異未見(jiàn)顯著差異。上述差異可能是因?yàn)樵炷Ｒ?。除正常組外，其他各組與模型組相比，均未見(jiàn)顯著差異。見(jiàn)表1。

表1 鐵皮楓斗顆粒對(duì)大鼠體重及臟器的影響（±s，g）

表1 鐵皮楓斗顆粒對(duì)大鼠體重及臟器的影響（±s，g）

注：與正常組比較，*P＜0.05。

組別高劑量組中劑量組低劑量組模型組正常組胃9.36±1.48 8.66±1.69 7.58±0.95 8.19±1.71 8.58±1.18樣本數(shù)（只）10 10 10 10 10初始體質(zhì)量281.35±16.19 276.86±17.25 280.95±20.79 282.05±15.53*301.43±16.91終末體質(zhì)量310.58±27.33 317.91±32.66 305.94±22.81 310.24±25.11*344.46±19.30肝臟2.26±0.30 2.19±0.22 2.05±0.23 2.14±0.20*2.49±0.18

4.2 鐵皮楓斗顆粒對(duì)大鼠胃組織病理的影響：經(jīng)統(tǒng)計(jì)，與正常組比較，模型組在炎癥等級(jí)、腺體數(shù)量及腺體厚度上有顯著性差異（P＜0.05），主細(xì)胞和壁細(xì)胞數(shù)量有所降低，可能因變異過(guò)大，差異未見(jiàn)顯著性。與模型組相比，各劑量組在炎癥等級(jí)、腺體數(shù)量及腺體厚度上明顯好轉(zhuǎn)，效果顯著。主細(xì)胞和壁細(xì)胞數(shù)量有所增加，向正?？拷?，但因組內(nèi)變異較大，效果不顯著，但可見(jiàn)改善的趨勢(shì)。見(jiàn)表2。

表2 鐵皮楓斗顆粒對(duì)大鼠胃組織病理的影響（±s）

表2 鐵皮楓斗顆粒對(duì)大鼠胃組織病理的影響（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別高劑量組中劑量組低劑量組模型組正常組壁細(xì)胞（個(gè)）585.40±97.13 556.50±65.88 542.5±23.22 506.40±62.83 568.00±84.49樣本數(shù)（只）10 10 10 10 10炎癥等級(jí)0.40±0.39#0.35±0.41#0.30±0.26#1.50±0.33*0.10±0.21腺體數(shù)量（個(gè)/mm）55.80±4.85#56.60±2.01#55.70±2.90#48.20±1.75*57.40±2.59腺體厚度（μm）287.82±23.44#274.26±37.71#267.46±35.14#231.04±17.44*296.22±21.86主細(xì)胞（個(gè)）527.60±145.82 441.00±107.75 477.00±39.07 450.20±102.10 528.90±122.82

4.3 鐵皮楓斗顆粒對(duì)大鼠胃組織上皮內(nèi)瘤變及腸化的影響：經(jīng)統(tǒng)計(jì)，與正常組比較，模型組在上皮內(nèi)瘤變和腸化方面（腸化陽(yáng)性面積、灰度值和總光密度）均有顯著性差異（P＜0.05）；與模型組相比，各劑量組在上皮內(nèi)瘤變、腸化面積及灰度值均有改善，但無(wú)顯著性差異。見(jiàn)表3。

表3 鐵皮楓斗顆粒對(duì)大鼠胃組織上皮內(nèi)瘤變及腸化的影響（±s）

表3 鐵皮楓斗顆粒對(duì)大鼠胃組織上皮內(nèi)瘤變及腸化的影響（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別高劑量組中劑量組低劑量組模型組正常組總光密度2308569.33±956373.71 3509121.25±1089716.96 5934910.68±1945244.80 5198760.39±3351544.50*2390027.39±1900571.69樣本數(shù)（只）10 10 10 10 10上皮內(nèi)瘤變情況0.40±0.52 0.30±0.48 0.50±0.71 0.60±0.51*0.00±0.00腸化陽(yáng)性面積（μm2）12175.40±5100.42 18739.60±6070.13 30841.70±9896.05 26516.00±17074.58*12488.80±9796.26灰度值201.48±1.97#198.90±3.82#203.17±2.91 205.92±3.18*200.72±3.98

4.4 鐵皮楓斗顆粒對(duì)大鼠胃組織中Ech1、Bax及Bcl-2表達(dá)的影響：經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析，與模型組相比，Bax和Ech1蛋白表達(dá)水平在高劑量組顯著升高（P＜0.05），在其他劑量組表達(dá)也有增加，但是差異不顯著。Bcl-2各劑量組未見(jiàn)顯著差異，但表達(dá)有增加的趨勢(shì)。見(jiàn)圖1。

圖1 鐵皮楓斗顆粒對(duì)大鼠胃組織中Ech1、Bax及Bcl-2表達(dá)的影響

5 討論

我國(guó)新近調(diào)查表明，胃癌發(fā)病人數(shù)和死亡例數(shù)均約占世界的一半，疾病負(fù)擔(dān)嚴(yán)重，是癌癥防治的重點(diǎn)[3]。治療或者逆轉(zhuǎn)胃癌前病變，對(duì)于防治胃癌，減輕疾病負(fù)擔(dān)，意義重大。CAG常伴隨腸化生、上皮內(nèi)瘤變等癌前病變[4]。上皮內(nèi)瘤變也稱為不典型增生，異型增生，2000年后，國(guó)際上逐漸統(tǒng)一，便于臨床分類(lèi)與治療[5]。上皮內(nèi)瘤進(jìn)一步發(fā)展即是胃癌[6]。改善或者逆轉(zhuǎn)這些改變，成為治療慢性萎縮性胃炎，防治胃癌的關(guān)鍵策略。

本研究從改善或逆轉(zhuǎn)這些不良改變?nèi)胧?，觀察鐵皮楓斗顆粒對(duì)慢性萎縮性胃炎及其并發(fā)癥的治療效果及可能作用機(jī)制。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，鐵皮楓斗顆粒能夠顯著減輕慢性萎縮性胃炎的炎癥情況，并能夠促進(jìn)腺體狀態(tài)的恢復(fù)。對(duì)于主細(xì)胞和壁細(xì)胞數(shù)量上也有一定的好轉(zhuǎn)，這與我們前期相關(guān)研究結(jié)果相似[2]，該研究提示損傷胃黏膜在鐵皮楓斗顆粒治療下，萎縮得到明顯恢復(fù)，分泌功能也得到一定程度的改善。本研究還發(fā)現(xiàn)鐵皮楓斗顆粒對(duì)大鼠胃組織慢性萎縮性伴上皮內(nèi)瘤變和（或）腸化生均有一定的減輕緩解作用，各治療組大鼠胃組織上皮內(nèi)瘤變及腸化情況向正常方向逆轉(zhuǎn)。

烯酯酰輔酶A水合酶1（enoyl coenzyme A hydratase 1，Ech1）是一種具有烯酰輔酶水合酶活性的蛋白質(zhì)，是脂肪酸β氧化的關(guān)鍵酶[7]。Ech1表達(dá)異常與胃癌等腫瘤密切相關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)Ech1在胃癌中下調(diào)[8]。故本研究對(duì)慢性萎縮性胃炎及其并發(fā)癥胃黏膜組織中Ech1蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組動(dòng)物Ech1與正常組相比，顯著降低，經(jīng)過(guò)給藥，該蛋白表達(dá)水平有所回升，其中，高劑量組顯著上升，接近正常組水平。這說(shuō)明鐵皮楓斗顆?？赡芡ㄟ^(guò)上調(diào)Ech1起到逆轉(zhuǎn)慢性萎縮性胃炎伴上皮內(nèi)瘤變的作用。

Bax和Bcl-2是兩個(gè)具有代表性的細(xì)胞凋亡相關(guān)基因，目前認(rèn)為，這兩種基因的比例決定細(xì)胞的凋亡程度[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，鐵皮楓斗顆粒能夠上調(diào)這兩種蛋白的表達(dá)水平，改變這兩種蛋白的比例情況，通過(guò)調(diào)節(jié)胃黏膜細(xì)胞的凋亡來(lái)改善慢性萎縮的癥狀，抑制萎縮的進(jìn)展，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)慢性萎縮性胃炎及其并發(fā)癥。

該研究表明，鐵皮楓斗顆粒對(duì)治療慢性萎縮性胃炎有較好的治療作用，同時(shí)對(duì)于萎縮性胃炎伴隨的上皮內(nèi)瘤變及腸化也有一定的逆轉(zhuǎn)作用，這可能是通過(guò)對(duì)Ech1調(diào)節(jié)起作用，這為慢性萎縮性胃炎伴隨并發(fā)癥的治療提供了新的思路。