賴蓉蓉,翟苑好,林媛媛,曾瑤,伍艷,徐月紅

(中山大學(xué)藥學(xué)院,廣東 廣州 510006)

三伏貼(Sanfu patch)為一種傳統(tǒng)的中醫(yī)外治療法,是取《素問·四氣調(diào)神大論篇》中“春夏養(yǎng)陽,秋冬養(yǎng)陰”的原理[1-2],于三伏陽氣旺盛之際,將陽性、熱性的藥物敷貼于肺俞(Feishu acupoint,FS)、膏肓、膻中、天突、定喘等穴位之上[3-4],使其通過經(jīng)絡(luò)循行和氣血輸送到達(dá)病灶部位,達(dá)到調(diào)節(jié)陰陽平衡,祛除外邪的目的。目前,三伏貼多以清代名醫(yī)張璐冷哮方(白芥子、延胡索、甘遂和細(xì)辛)為基礎(chǔ)[3,5],結(jié)合不同疾病的臨床特點和四時變化加減,主要用于支氣管哮喘、變應(yīng)性鼻炎等呼吸系統(tǒng)疾病的治療[6]?，F(xiàn)代藥效學(xué)研究表明:三伏貼可以通過調(diào)節(jié)IL-4、IL-5、IL-γ和IL-2等細(xì)胞因子調(diào)節(jié)Th1/Th2免疫平衡,達(dá)到防治哮喘的目的[7]。三伏貼經(jīng)穴位給藥防治呼吸系統(tǒng)疾病具有廣泛的臨床基礎(chǔ)和確切的療效,但作為經(jīng)皮給藥系統(tǒng),其經(jīng)穴位促滲,內(nèi)病外治的機理尚待探明。

瞬時感受器電位離子通道(Transient receptor potential ion channels,TRP)是廣泛分布于感覺神經(jīng)細(xì)胞、肥大細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞上的非選擇性陽離子通道,主要介導(dǎo)單價或者二價陽離子,如Ca2+、K+等內(nèi)流進(jìn)入細(xì)胞,以響應(yīng)各種化學(xué)刺激和物理刺激。TRP通道根據(jù)主要氨基酸結(jié)構(gòu)的不同可以分為7個亞家族:TRPA、TRPC、TRPM、TRPML、TRPP、TRPV和TRPN[8-9]。其中瞬時受體電位香草酸亞型1[Transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1,又稱為辣椒素(Capsaicin,CAP)受體]和瞬時受體電位錨蛋白1(Transient receptor potential ankyrin 1,TRPA1)是TRP通道家族中研究較多的2種通道蛋白,不僅參與溫度、pH、機械等物理刺激和化學(xué)刺激的調(diào)節(jié),而且與瘙癢、疼痛、神經(jīng)源性炎癥等疾病的發(fā)生有密切關(guān)系[10-12]。2021年,諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎授給發(fā)現(xiàn)溫度和觸覺感受器的美國科學(xué)家David教授和Ardem教授,其中David教授首次揭示了TRPV1可以介導(dǎo)CAP引起的灼熱、疼痛等感覺的功能并解析了TRPV1通道蛋白的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)[13]。研究發(fā)現(xiàn)TRP通道中TRPV1及TRPA1均表達(dá)于表皮角質(zhì)細(xì)胞,與表皮屏障功能密切相關(guān)[11,14]。同時,TRPV1及TRPA1也均表達(dá)于皮膚感覺神經(jīng),介導(dǎo)皮膚對溫度和化學(xué)感知和調(diào)節(jié),參與痛癢覺發(fā)生以及皮膚神經(jīng)源炎癥發(fā)生,這一點可能與三伏貼作用于皮膚后產(chǎn)生溫感、燒灼或辛辣感及瘙癢相關(guān)。因此,我們推測三伏貼有可能通過激活穴位皮膚TRPV1和TRPA1通道而發(fā)揮經(jīng)皮促滲和增效的作用。

本研究首先考察三伏貼有效成分芥子堿硫氰酸鹽(Sinapine thiocyanate,SPT)和延胡索乙素(Tetrahydropalmatine,THP)對TRP通道的激活作用。以肺俞穴為代表性穴位,比較肺俞穴和非穴位(Non-acupoint,NFS)皮膚TRP通道表達(dá)的差異,并比較TRP通道激動劑激活TRP通道后三伏貼在體經(jīng)皮滲透有效成分SPT和THP在穴位與非穴位皮膚滯留的差異,進(jìn)一步驗證TRP通道對三伏貼經(jīng)皮滲透的影響。本研究為三伏貼經(jīng)穴位皮膚促滲增效機制研究提供新的契入點。

1 材料

DZTW型電子調(diào)溫電熱套(上海邦西儀器科技有限公司),Sartorius BT 25S十萬分之一天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司),FV3000激光掃描超高分辨率顯微鏡(日本奧林巴斯公司),電泳儀(北京六一儀器廠),5200化學(xué)發(fā)光成像儀(上海天能公司),LC-2030島津高效液相色譜儀(日本島津公司)。

白芥子、延胡索、細(xì)辛藥材購自廣州市誠濟藥業(yè)有限公司;SPT對照品(批號:111702-200501)、THP對照品(批號:111726-201011)購自中國藥品生物制品檢定所;鼠源神經(jīng)生長因子(NGF)、CAP購自美國Sigma公司;0.25%胰蛋白酶-EDTA、青霉素-鏈霉素、胎牛血清(FBS)、Ⅱ型膠原酶購自美國Gibco公司;DMEM/F12培養(yǎng)基購自美國Thermo公司;4%多聚甲醛(批號:CR2101179)、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG購自武漢塞維爾公司;TRPA1抗體購自美國Novusbio公司;TRPV1抗體、Alexa Flour 594標(biāo)記山羊抗兔IgG購自英國Abcam公司;即用型山羊血清購自武漢博士德公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號:122120210323)、RIPA裂解液(批號:11252021020)購自碧云天;ECL化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒(批號:S0023721)購自Yeasen公司;異硫氰酸丙烯酯(Allyl isothiocyanate,AITC)，甲醇、乙腈(色譜純)購自美國Sigma-Aldrich公司。

Wistar乳鼠(1～3 d)、SPF級SD大鼠,雌性,體質(zhì)量180～220 g,購于中山大學(xué)(大學(xué)城)實驗動物中心,實驗動物合格證號:SCXK(粵)2016-0029。動物實驗方案通過中山大學(xué)實驗動物倫理委員會審查，實驗動物倫理批號：SYSU-IACUC-2019-B235。

2 方法

2.1 三伏貼的制備

在本課題組前期的研究中，甘遂在三伏貼用藥時易引起皮膚破潰，但是預(yù)防哮喘發(fā)作的作用較弱，因此本研究對三伏貼進(jìn)行加減后去掉甘遂[15]。粉碎白芥子、延胡索后按質(zhì)量比1∶1配伍,加入10倍量80%乙醇回流提取2 h,重復(fù)3次,合并提取液,過濾,濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮,得到相對密度為1.1～1.3 g·mL-1的浸膏。

用水蒸氣提取法提取細(xì)辛揮發(fā)油。粉碎細(xì)辛后(細(xì)辛粒徑為50～80目)加入適量水,120 ℃加熱回流6 h,收集揮發(fā)油,揮發(fā)油的得率為0.64%。

每20 g浸膏中加入1 mL揮發(fā)油混合均勻,制備成三伏貼。三伏貼中有效成分SPT的含量為(27.30±0.81)mg·g-1,THP的含量為(2.87±0.18)mg·g-1。含20 μmol·L-1CAP和0.5 μmol·L-1AITC浸膏的制備：將對應(yīng)量CAP和AITC與三伏貼浸膏均勻混合后制得。

SPT的高效液相色譜測定方法如下[16]:色譜柱:Kromsil 100-5-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相:乙腈-0.08 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液(10∶90,v/v);流速:1 mL·min-1;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:20 μL;檢測波長:326 nm。

THP的高效液相色譜測定方法如下[16]:色譜柱:Kromsil 100-5-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相:甲醇-0.1%磷酸溶液(三乙胺調(diào)pH至6.0)(55∶45,v/v);流速:1 mL·min-1;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:20 μL;檢測波長:280 nm。

2.2 三伏貼中有效成分對TRP通道的作用

2.2.1 原代背根神經(jīng)元(Dorsal root ganglion,DRG)細(xì)胞提取和培養(yǎng) 取出乳鼠脊柱分離脊神經(jīng)節(jié),用0.1%Ⅱ型膠原酶和0.25%胰蛋白酶消化,加入血清終止消化,離心棄上清,加入含有50 ng·mL-1鼠源NGF、10%FBS、1%青霉素-鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,接種培養(yǎng)皿內(nèi),移入37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱。

2.2.2 Ca2+內(nèi)流試驗 將DRG細(xì)胞以2×104mL-1的密度接種于多聚賴氨酸包被的Confocal皿中,待細(xì)胞貼壁后,用臺氏液清洗2次。各組細(xì)胞加200 μL鈣離子熒光探針Fluo-4,AM(1∶1 000),避光孵育30 min后,用臺氏液清洗2次,再加入400 μL臺氏液,培養(yǎng)箱孵育15 min,于激光共聚焦掃描顯微鏡(Confocal laser scanning microscope,CLSM)下進(jìn)行Ca2+內(nèi)流實驗,激發(fā)波長488 nm,發(fā)射波長516 nm。在預(yù)設(shè)時間點分別向培養(yǎng)皿中加入終濃度為20 μmol·L-1CAP、100 μmol·L-1SPT和100 μmol·L-1THP溶液,對細(xì)胞進(jìn)行動態(tài)觀察,細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化(Δ[Ca2+]i)以熒光強度值的百分比值來表示,根據(jù)公式Δ[Ca2+]i=(F-F0)/F0×100%=ΔF/F0×100%計算,式中F為給藥后的熒光強度峰值,F0為給藥前的熒光強度基礎(chǔ)值[17]。

2.3 肺俞穴與非穴位皮膚TRP通道表達(dá)差異

2.3.1 Western blot檢測TRP通道表達(dá)差異 大鼠肺俞穴位于第三胸椎下旁開0.75 mm,以肺俞穴穴位點為中心,選取1 cm2的皮膚為肺俞穴皮膚[18],非穴位的皮膚為距離肺俞穴5 cm下1 cm2的背部皮膚。取3只SD大鼠脫頸處死后,立即分離所需皮膚并除去皮下脂肪。研碎皮膚,用RIPA裂解液提取皮膚總蛋白,BCA法測定蛋白濃度,SDS-PAGE電泳分離蛋白,轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉1 h,放入稀釋的TRPA1或TRPV1一抗中(1∶1 000),4 ℃搖床孵育過夜。加入稀釋的二抗(1∶3 000)室溫孵育1 h,TBST洗膜后用ECL化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒顯影,用化學(xué)發(fā)光成像儀進(jìn)行拍照,用Image J進(jìn)行灰度分析

2.3.2 免疫熒光考察TRP通道表達(dá)差異 另取3只SD大鼠，根據(jù)“2.3.1”中方法獲取肺俞穴與非穴位皮膚,用4%多聚甲醛4 ℃固定4 h后,在30%蔗糖中下沉過夜,OCT包埋,制作冰凍切片,于-80 ℃保存。切片放至室溫后,PBS清洗3次,每次5 min,用4%多聚甲醛室溫固定20 min,用即用型山羊血清封閉2 h,滴加一抗(Anti-TRPV1抗體1∶500，Anti-TRPA1抗體1∶100),于濕盒中4 ℃過夜。PBS清洗3次,每次5 min,滴加二抗(Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG 1∶200，Alexa Fluor 594山羊抗兔IgG H&L 1∶200),室溫孵育1 h,PBS清洗3次,每次5 min,用甘油封片。于CLSM下觀察:Alexa Fluor 488激發(fā)波長488 nm,發(fā)射波長516 nm;Alexa Fluor 594激發(fā)波長590 nm,發(fā)射波長617 nm。

2.4 三伏貼對TRPA1通道的作用

將15只SD大鼠隨機分為5組,根據(jù)“2.3.1”中方法確定肺俞穴和非穴位位置,分別于第0、1、2、3、7天給藥,給藥面積為1 cm2,給藥量為0.21 g·cm-2。每次給藥6 h后,將大鼠脫頸處死并立即分離所需皮膚,根據(jù)“2.3.2”中方法進(jìn)行免疫熒光實驗。

2.5 激動TRP通道對三伏貼穴位敷貼透皮行為的影響

2.5.1 在體透皮實驗 將10只SD大鼠隨機分為CAP(TRPV1激動劑)組和AITC(TRPA1激動劑)組,麻醉后將背部脫毛。其中,CAP組在左側(cè)肺俞穴與非穴位皮膚分別給予含20 μmol·L-1CAP的三伏貼,AITC組分別給予含0.5 μmol·L-1AITC的三伏貼,在所有組別右側(cè)的肺俞穴與非穴位皮膚給予不含CAP和AITC的三伏貼作為對照,給藥面積為1 cm2,三伏貼給藥量為0.21 g·cm-2。給藥6 h后,將大鼠脫頸處死,擦除皮膚表面藥物,剪下給藥部位并剪碎,加入500 μL甲醇,超聲30 min后,離心取上清液,過0.22 μm濾膜后用于HPLC測定,計算經(jīng)皮滲透后SPT的皮膚滯留量。

2.5.2 激光共聚焦3D掃描 THP具有自發(fā)熒光,其在皮膚的滲透和滯留可通過CLSM可視化研究。給藥方案與“2.5.1“項下一致。將皮膚角質(zhì)層面朝蓋玻片鋪平,蓋上蓋玻片,進(jìn)行CLSM觀察。

THP的激發(fā)波長為488 nm,發(fā)射波長為520 nm。選擇3D掃描模式拍攝,Image J進(jìn)行熒光半定量,并用Imaris對所得熒光掃描圖片進(jìn)行3D重構(gòu)。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 CLSM考察三伏貼有效成分對TRP通道的作用

TRP通道屬于非選擇性陽離子通道,在DRG中高表達(dá),可以通過DRG細(xì)胞內(nèi)Ca2+離子濃度的變化判斷受試物對TRP通道的作用,CAP是激動TRPV1的陽性對照藥。如圖1所示,分別考察了20 μmol·L-1CAP、100 μmol·L-1SPT和100 μmol·L-1THP對DRG細(xì)胞Ca2+濃度的影響,其中Fluo-4為Ca2+熒光探針,其熒光強度的變化可以顯示Ca2+離子濃度水平。從圖1A中可以看出,CAP和SPT的加入都可以引起DRG細(xì)胞Ca2+離子的內(nèi)流,對TRP通道均有激活作用,而THP的加入沒有引起DRG細(xì)胞Ca2+離子濃度的變化,對TRP通道沒有激活作用。

注：A.分別給予20 μmol·L-1 CAP、100 μmol·L-1 SPT和100 μmol·L-1 THP后DRG細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化(ΔF/F0);B.分別給予20 μmol·L-1 CAP和100 μmol·L-1 SPT前后DRG細(xì)胞的CLSM圖像,標(biāo)尺=20 μm

3.2 肺俞穴和非穴位皮膚TRP通道的表達(dá)

研究表明,TRP通道在感覺神經(jīng)元細(xì)胞、肥大細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞中均有分布,與皮膚屏障功能有密切的關(guān)系[14,19-21]。如圖2A所示,通過對大鼠肺俞穴和非穴位皮膚進(jìn)行冷凍切片和免疫熒光標(biāo)記可視化TRPV1和TRPA1在皮膚組織的分布,結(jié)果發(fā)現(xiàn),TRPV1和TRPA1主要分布在表皮組織中,而且肺俞穴皮膚的熒光強度明顯強于非穴位皮膚,說明肺俞穴皮膚TRPV1和TRPA1的表達(dá)高于非穴位皮膚。相似的結(jié)果也體現(xiàn)在Western blot實驗(圖2B)中,且該結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),進(jìn)一步證實肺俞穴皮膚TRPV1和TRPA1的表達(dá)高于非穴位皮膚。

注：A.CLSM觀察肺俞穴和非穴位皮膚TRPV1和TRPA1的表達(dá),標(biāo)尺=100 μm;B.皮膚中TRPA1、TRPV1蛋白表達(dá)量的Western blot結(jié)果圖和灰度分析；FS.肺俞穴組；NFS.非穴位組；與非穴位組比較，

3.3 三伏貼對肺俞穴和非穴位皮膚TRPA1表達(dá)的影響

采用CLSM和免疫熒光標(biāo)記分別考察三伏貼作用前和作用1、2、3、7 d后對肺俞穴和非穴位皮膚TRPA1表達(dá)量的影響。從圖3可以觀察到隨著三伏貼作用時間的延長,肺俞穴和非穴位皮膚中TRPA1的含量逐漸下降,直至第3天幾乎觀察不到TRPA1的熒光標(biāo)記,說明三伏貼持續(xù)給藥后能夠降低肺俞穴和非穴位皮膚中TRPA1表達(dá),三伏貼的持續(xù)給藥可能會導(dǎo)致皮膚中TRPA1的耗竭,出現(xiàn)TRP脫敏現(xiàn)象,但這個現(xiàn)象的機制有待進(jìn)一步研究。

注：FS.肺俞穴組；NFS.非穴位組

3.4 激活TRP通道對三伏貼敷貼透皮行為的影響

為了進(jìn)一步闡明三伏貼經(jīng)穴位促滲的機理,本實驗利用TRPV1的特異性激動劑CAP以及TRPA1的特異性激動劑AITC[13,22],觀察這些激動劑激活TRPV1和TRPA1通道后對三伏貼敷貼透皮行為的影響。

3.4.1 激活TRPV1對三伏貼敷貼滲透行為的影響 首先通過在體滯留實驗研究激活TRPV1對三伏貼經(jīng)皮滲透行為的影響,以三伏貼中有效成分SPT為指標(biāo),對三伏貼在體滯留行為進(jìn)行量化。從圖4A可以看出,當(dāng)20 μmol·L-1CAP與三伏貼同時作用于肺俞穴皮膚后,SPT在體滯留量可以達(dá)到(3.30±0.36)μg·cm-2,而單獨三伏貼給藥組的滯留量僅有(2.17±0.27)μg·cm-2,顯著低于CAP+三伏貼聯(lián)合給藥組(P<0.05)。然而,因為非穴位中TRPV1表達(dá)顯著低于穴位皮膚,CAP與三伏貼聯(lián)合給藥與否對SPT在非穴位皮膚的滯留量無顯著影響(P>0.05),說明CAP通過激活穴位皮膚的TRPV1通道促進(jìn)三伏貼中有效成分的經(jīng)穴位滲透。激光共聚焦結(jié)果與在體滯留實驗類似,由于THP本身具有自發(fā)綠色熒光,因此以THP為指標(biāo)對三伏貼在體滯留行為進(jìn)行可視化比較。從圖4B～D可以看出:在CAP和三伏貼聯(lián)合給藥之后,穴位皮膚部位綠色熒光顯著高于非穴位皮膚,且可以達(dá)到100 μm深處,而單獨三伏貼給藥組藥物到達(dá)的深度為60 μm。此外,CAP對于非穴位皮膚的滲透行為無顯著影響。

注：A.CAP與三伏貼同時作用于大鼠皮膚6 h后SPT在體皮膚滯留量;B.CAP與三伏貼同時作用于肺俞穴和非穴位皮膚后皮膚不同深度的CLSM圖像;C.大鼠不同皮膚深度的熒光半定量圖;D.熒光三維重構(gòu)圖,標(biāo)尺=200 μm；FS+CAP.CAP和三伏貼聯(lián)合給予大鼠肺俞穴皮膚組；FS.僅給予三伏貼于大鼠肺俞穴皮膚組；NFS+CAP.CAP和三伏貼聯(lián)合給予大鼠非穴位皮膚組；NFS.僅給予三伏貼于大鼠非穴位皮膚組；與FS+CAP組比較，*P<0.05;與FS組比較，

產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是:①肺俞穴皮膚TRPV1的表達(dá)量顯著高于非穴位皮膚;②激活TRPV1對肺俞穴皮膚屏障功能的影響更強,從而能促進(jìn)三伏貼的經(jīng)穴位滲透。

3.4.2 激活TRPA1對三伏貼經(jīng)皮滲透行為的影響 通過在體滯留實驗對TRPA1激活后三伏貼中有效成分SPT的透皮行為進(jìn)行量化。從圖5A中可以看出,當(dāng)TRPA1通道特異性激動劑AITC與三伏貼共同作用6 h后,SPT在肺俞穴皮膚中的滯留量[(3.05±0.40)μg·cm-2]顯著高于三伏貼單獨給藥組[(2.11±0.30)μg·cm-2](P<0.05),但是AITC對SPT在非穴位皮膚中的滯留量沒有顯著影響(P>0.05)。對于激光共聚焦結(jié)果,如圖5B～D所示:當(dāng)0.5 μmol·L-1AITC與三伏貼同時作用于肺俞穴皮膚時,與單獨三伏貼組相比,THP在肺俞穴皮膚的綠色熒光更強,且能達(dá)皮膚更深處(140 μm)。而當(dāng)AITC與三伏貼同時作用于非穴位皮膚,THP在非穴位皮膚的綠色熒光強度僅略微增強。

注：A.AITC與三伏貼同時作用于大鼠皮膚6 h后SPT在體皮膚滯留量;B.AITC與三伏貼同時作用于肺俞穴和非穴位皮膚后皮膚不同深度的CLSM圖像;C.大鼠不同皮膚深度的熒光半定量圖;D.熒光三維重構(gòu)圖,標(biāo)尺=200 μm；FS+AITC.AITC和三伏貼聯(lián)合給予大鼠肺俞穴皮膚組；FS.僅給予三伏貼于大鼠肺俞穴皮膚組；NFS+AITC.AITC和三伏貼聯(lián)合給予大鼠非穴位皮膚組；NFS.僅給予三伏貼于大鼠非穴位皮膚組；與FS+AITC組比較，*P<0.05;與FS組比較，

4 討論

本課題組前期的研究已經(jīng)證明:三伏貼經(jīng)肺俞穴皮膚的透過量、穩(wěn)態(tài)滲透速率以及皮膚滯留量均顯著高于非穴位皮膚,并比較了穴位和非穴位皮膚在物理滲透屏障上的區(qū)別,包括皮膚電阻和角質(zhì)層厚度[23-24]。為進(jìn)一步研究三伏貼經(jīng)穴位促滲以及內(nèi)病外治的機制,本研究從穴位與非穴位皮膚的神經(jīng)屏障進(jìn)行研究。通過研究三伏貼中有效成分對TRP通道的激動作用以及肺俞穴和非穴位皮膚TRP通道表達(dá)量的差異,闡明了三伏貼經(jīng)穴位促滲與TRP通道相關(guān)。通過在體滯留實驗和激光共聚焦可視化進(jìn)一步對這個結(jié)論進(jìn)行了驗證。本研究還探討了三伏貼給藥后對大鼠肺俞穴和非穴位皮膚TRPA1通道表達(dá)量的影響,有助于解釋三伏貼內(nèi)病外治,產(chǎn)生“經(jīng)脈-臟腑”相關(guān)效應(yīng)的機制[25]。

有研究表明,芥子油中的異硫氰酸酯化合物可以激活TRPA1通道[22]。而實驗結(jié)果顯示三伏貼中的有效成分SPT對TRP通道的TRPV1也具有激活的作用,而且肺俞穴TRPV1和TRPA1的表達(dá)量明顯高于非穴位皮膚,證實三伏貼中SPT對TRP通道的激活作用是三伏貼在肺俞穴的經(jīng)皮滲透和滯留量高于非穴位皮膚的原因之一。另外,實驗結(jié)果顯示三伏貼的持續(xù)給藥可以引起穴位和非穴位皮膚中TRPA1表達(dá)量下降。這可能是因為三伏貼作用于穴位皮膚后,通過持續(xù)激動TRPA1通道,導(dǎo)致穴位皮膚TRPA1通道蛋白耗竭從而脫敏[26-29]。同時,激活TRP通道并脫敏最終導(dǎo)致表達(dá)TRP的感覺神經(jīng)脫敏或去功能化是TRP激動劑臨床發(fā)揮作用的機理之一,如CAP臨床的止痛止癢作用[30-31]。TRPA1除了在皮膚中有表達(dá),在肺組織也有表達(dá),而且激動TRPA1可以引起類似支氣管收縮、黏液分泌、氣道炎癥、刺激和咳嗽等哮喘反應(yīng)[32-34],因此推測TRPA1通道可能是肺俞穴與肺產(chǎn)生“經(jīng)脈-臟腑相關(guān)”效應(yīng)的機理之一,三伏貼持續(xù)激動皮膚上的TRPA1通道致其耗竭脫敏,可能會進(jìn)一步導(dǎo)致呼吸道中迷走神經(jīng)和感覺神經(jīng)纖維上的TRPA1通道蛋白脫敏或表達(dá)下調(diào),從而發(fā)揮在哮喘緩解期預(yù)防及治療哮喘的作用。我們將進(jìn)一步對此皮膚-肺臟的級聯(lián)調(diào)控進(jìn)行研究,期望能進(jìn)一步基于TRP通道闡明三伏貼內(nèi)病外治,通過“經(jīng)絡(luò)-臟腑”相關(guān)效應(yīng)防治哮喘的機制。