喬鵬麗,魏旭超,瞿葉清,董潔,殷書梅,鄭仕中,陳軍

(1.南京中醫(yī)藥大學江蘇省中醫(yī)外用藥開發(fā)與應(yīng)用工程研究中心,江蘇 南京 210023;2.南京中醫(yī)藥大學藥學院,江蘇 南京 210023;3.南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院實驗動物中心,江蘇 南京 210008;4.江蘇康緣陽光藥業(yè)有限公司,江蘇 南京 210046)

中藥成方制劑復方南星止痛膏(Compound nanxing zhitong plaster,CNZP)屬于外用橡皮膏制劑,由肉桂、丁香、白芷、生天南星、徐長卿等12味中藥組成,主要用于治療寒濕瘀阻證的骨性關(guān)節(jié)炎[1-2]。CNZP通過經(jīng)皮給藥的方式,具有避免胃腸首過效應(yīng),減少給藥次數(shù)等優(yōu)點,其透皮吸收效果直接決定藥效,目前主要通過體外透皮吸收實驗表征CNZP中活性成分的吸收特性[3]。

經(jīng)皮給藥研究成功的關(guān)鍵因素之一在于選擇與人體皮膚滲透性相似的皮膚模型,目前經(jīng)皮滲透研究比較公認的最接近人體皮膚性質(zhì)的是豬耳皮[4],但比較難獲得,因此常用其他動物皮膚模型如大鼠皮替代。人工皮膚膜的出現(xiàn),為替代動物皮膚模型提供了可能[5],課題組前期研制了“磚-砂漿”結(jié)構(gòu)的復合磷脂脂質(zhì)體人工皮膚膜(Composite phospholipid liposome-based artificial skin membrane,CPLASM)以模擬皮膚角質(zhì)層的組成與結(jié)構(gòu),能有效表征中藥溶液中活性成分的透皮吸收行為[6-7],但尚未有用于中藥成方制劑的研究。

本文在建立同時測定CNZP中5種活性成分HPLC方法的基礎(chǔ)上,以真實皮膚豬耳皮和大鼠皮為對照,制備CPLASM并考察了其與市售Strat-MTM人工皮膚膜用于評價CNZP體外透皮吸收行為的效果,以期為以CNZP為代表的中藥貼膏劑提供能夠替代動物皮膚的評價模型和表征方法,從而有效評價其透皮吸收性質(zhì)以控制質(zhì)量。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級健康雄性SD大鼠,體質(zhì)量(200±20)g,購自浙江維通利華實驗技術(shù)有限公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK(浙)2019-0001。巴馬小型豬,體質(zhì)量(18±2)kg,江蘇亞東動物研究院有限公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK(蘇)2021-0015。

1.2 實驗試劑與儀器

標準品桂皮醛(批號：B50765)、丹皮酚(批號：B20266)、丁香酚(批號：B20301)、水楊酸甲酯(批號：B21198)、歐前胡素(批號：B20929)(純度均高于95%,上海源葉生物科技有限公司),CNZP(江蘇康緣陽光藥業(yè)有限公司,批號：220202),氫化大豆磷脂(上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司),大豆磷脂(上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司),膽固醇(上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司),膽固醇硫酸酯鈉(上海美侖試劑公司),聚乙二醇400(PEG400,國藥集團化學試劑有限公司),甲醇(美國Tedia公司,色譜純),乙腈(美國Anaqua公司,色譜純),水為超純水,其他試劑均為分析純。

Strat-MTM(Merck millipore公司),24孔嵌套、24孔板(Corning公司,TranswellTM),高效液相色譜儀[沃特世科技(上海)有限公司,Waters2695型],紫外可見分光光度計(上海尤尼柯儀器有限公司,UV2800AH型),渦旋混合器(上海滬西分析儀器廠有限公司,XW80A型),超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司,KH5200E型),離心機(上海安亭科學儀器廠,TGL-16B型),分析天平(奧多利斯科學儀器北京有限公司,BT124S型),超純水機(Merck Millipore,DIRECT-Q5型),透皮擴散試驗儀(上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司,TK-12D型)。

2 方法和結(jié)果

2.1 HPLC測定活性成分含量

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Ultimate XB-C18柱(250 mm×2.6 mm,5 μm),流動相乙腈-水,梯度洗脫條件見表1,柱溫30 ℃,流速1 mL·min-1,檢測波長276 nm,進樣體積10 μL。

表1 梯度洗脫條件

2.1.2 樣品溶液的制備

2.1.2.1 供試品溶液的制備 剪取CNZP膜片約0.22 g,精密稱定,加入甲醇8 mL,冰浴超聲提取60 min,超聲提取后4 000 r·min-1冷凍離心10 min,上清液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中,重復3次,最后加甲醇定容至刻度,搖勻,即得。

2.1.2.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取桂皮醛、丹皮酚、丁香酚、水楊酸甲酯、歐前胡素對照品適量于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容得到混合對照品溶液,桂皮醛、丹皮酚、丁香酚、水楊酸甲酯、歐前胡素質(zhì)量濃度分別為10.14 μg·mL-1、9.42 μg·mL-1、144.44 μg·mL-1、96.96 μg·mL-1、7.36 μg·mL-1。

2.1.3 方法學考察

2.1.3.1 專屬性考察 取CNZP供試品溶液、已知濃度混標工作液和透皮接收液溶液,按“2.1.1”項下色譜條件檢測。見圖1。

注：A.混合對照品溶液;B.CNZP供試品溶液;C.透皮接收液

2.1.3.2 線性關(guān)系考察 取“2.1.2.2”混合對照品溶液用甲醇逐級稀釋成5份不同濃度的混標工作液,按“2.1.1”項下色譜條件進行分析。以被測化合物的峰面積(Y)對質(zhì)量濃度(X)進行線性回歸。結(jié)果分別為:桂皮醛(Y=80 787X+13 108,R2=0.999 4)、丹皮酚(Y=49 616X+4 219.3,R2=0.999 8)、丁香酚(Y=3 017.4X+9 722.6,R2=0.999 8)、水楊酸甲酯(Y=8 590.4X+10 500,R2=0.999 9)、歐前胡素(Y=15 076X+1 093.7,R2=0.999 2),線性范圍分別為:桂皮醛0.32～10.14 μg·mL-1,丹皮酚0.29～9.42 μg·mL-1,丁香酚4.51～144.44 μg·mL-1,水楊酸甲酯3.03～96.96 μg·mL-1,歐前胡素0.23～7.36 μg·mL-1。

2.1.3.3 精密度試驗 取“2.1.2.2”項下混合對照品溶液,按“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次,以被測化合物的峰面積(Y)為指標,計算相對標準偏差(RSD)為精密度。桂皮醛、丹皮酚、丁香酚、水楊酸甲酯、歐前胡素的RSD分別為0.72%、0.98%、0.79%、0.60%、0.71%,表明儀器精密度良好。

2.1.3.4 重復性試驗 取“2.1.2.1”項下供試品溶液,平行制備6份,按“2.1.1”項下色譜條件進樣,測定并計算各成分的RSD,桂皮醛、丹皮酚、丁香酚、水楊酸甲酯、歐前胡素的RSD分別為1.09%、1.23%、0.88%、0.88%、1.09%,表明該方法重復性良好。

2.1.3.5 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.3.4”項下同一份供試品溶液,分別于0、4、8、12、24、48 h進樣,按“2.1.1”項下色譜條件進樣,測定并計算各成分峰面積的RSD。桂皮醛、丹皮酚、丁香酚、水楊酸甲酯、歐前胡素的RSD分別為2.24%、2.18%、2.28%、2.51%、1.68%,表明各成分在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.3.6 加樣回收率 稱取0.11 g CNZP 6份,測定各成分的含量,分別加入等量混合對照品后按“2.1.2.1”項下制備供試品溶液并進樣測定。取透皮接收液6份,分別接入等量混合對照品,進樣測定。CNZP供試品溶液中桂皮醛、丹皮酚、丁香酚、水楊酸甲酯、歐前胡素的加樣回收率分別為(104.53±0.36)%、(101.95±0.34)%、(101.84±0.37)%、(99.63±0.25)%、(105.33±1.22)%;接收液中桂皮醛、丹皮酚、丁香酚、水楊酸甲酯、歐前胡素的加樣回收率分別為(97.77±0.11)%、(107.91±1.78)%、(107.48±0.35)%、(95.46±0.85)%、(104.48±1.43)%,表明方法準確度良好。

2.1.3.7 CNZP成分含量測定 取“2.1.2.1”項下供試品溶液進樣測定。CNZP中各成分含量分別為桂皮醛(0.34±0.03)mg·g-1,丹皮酚(0.78±0.13)mg·g-1,丁香酚(6.24±3.03)mg·g-1,水楊酸甲酯(16.19±0.96)mg·g-1,歐前胡素(0.22±0.04)mg·g-1(n=3)，，可見水楊酸甲酯和丁香酚的含量最高。

2.2 透皮吸收行為考察

2.2.1 豬耳皮制備 于-20 ℃冰箱中取出豬耳恢復至室溫,用刀片將豬耳背部毛剔除干凈,剝離豬耳背部皮膚,除去皮下血管及組織,于-20 ℃保存,實驗使用前將皮膚自然解凍。

2.2.2 大鼠皮制備 取SD大鼠,麻醉后固定在大鼠板上。肥皂水濕潤毛發(fā),用刀片輕輕刮去腹部毛發(fā),用紙巾吸干表面水分,飼養(yǎng)過夜。取脫毛后大鼠,頸椎脫臼處死,采用手術(shù)器械小心剝?nèi)「共科つw,去除皮下脂肪及黏液組織,置于濾紙夾層中,-20 ℃冰箱保存，2周內(nèi)使用。實驗前將皮膚解凍,檢查皮膚的完整性。

2.2.3 CPLASM的制備 采用薄膜分散法制備復合磷脂脂質(zhì)體[6-7],小粒徑脂質(zhì)體:大豆磷脂-膽固醇(77∶23,w/w);大粒徑脂質(zhì)體:大豆磷脂-氫化大豆磷脂-神經(jīng)酰胺-膽固醇-膽固醇硫酸酯-棕櫚酸(56.25∶18.75∶13.75∶6.25∶1.25∶3.75,w/w)。制備好的小粒徑脂質(zhì)體混懸液用高壓均質(zhì)機控制粒徑在200～300 nm,大粒徑脂質(zhì)體混懸液用探頭式超聲儀控制粒徑大于500 nm。

將粘有尼龍膜的嵌套放在24孔板中,加入小粒徑脂質(zhì)體100 μL,2 000 r·min-1離心10 min,更換24孔板方向重復上述步驟,去除多余混懸液,50 ℃加熱干燥45 min。后加入大粒徑脂質(zhì)體100 μL,2 000 r·min-1離心10 min。55 ℃加熱干燥2 h,放入-80 ℃冰箱冷凍1 h,然后真空干燥箱30 ℃加熱2 h,凍融循環(huán)2次。制備好的CPLASM置于-20 ℃儲存。

2.2.4 CNZP活性成分體外透皮(膜)吸收 取Strat-MTM、大鼠皮和豬耳皮于PBS(pH7.4)中水合1 h,角質(zhì)層朝上安裝在Franz擴散池上,取CNZP圓片稱質(zhì)量后置于皮膚表面,接收液采用超聲脫氣的30%PEG400生理鹽水。透皮擴散儀保持恒溫，循環(huán)水浴溫度37 ℃,轉(zhuǎn)速300 r·min-1。分別在不同時間點取接收液0.3 mL(及時補充等溫空白接收液),14 000 r·min-1冷凍離心10 min,取上清液用HPLC法測定濃度并計算單位面積累計透過量。

取CPLASM,加入PBS(pH7.4)中水合1 h,下層加入600 μL超聲脫氣的30%PEG400生理鹽水,上層加入CNZP圓片,分別在不同時間點取接收液0.3 mL(及時補充等溫空白接收液),14 000 r·min-1冷凍離心10 min,取上清液用HPLC法測定濃度并計算單位面積累計透過量。

按公式Q=(V×Cn+∑VS×Cn-1)/A求算不同時間單位面積的藥物累積透過量(Q);A為有效透皮吸收面積(3.14 cm2),V為接收室體積,Vs為取樣體積,Cn為第n個取樣點測得的接收液中藥物質(zhì)量濃度(μg·mL-1),Cn-1為第n-1個取樣點測得的接收液中藥物質(zhì)量濃度(μg·mL-1)。以各時間點Q為縱坐標,時間t為橫坐標作圖,將曲線尾部直線部分數(shù)據(jù)進行線性回歸,得到Q-t方程,直線的斜率為穩(wěn)態(tài)流量(Jss,μg·cm-2·h-1),表觀滲透系數(shù)Papp=Jss/(3 600×C0),C0為加入供給室中各成分初始質(zhì)量濃度。

結(jié)果如圖2和表2所示,采用豬耳皮和大鼠皮評價CNZP中各活性成分的透過能力排序依次是:桂皮醛>丁香酚>丹皮酚>歐前胡素>水楊酸甲酯,采用Strat-MTM和CPLASM評價得到的滲透量排序依次是:桂皮醛>丁香酚>水楊酸甲酯>丹皮酚>歐前胡素。在5種活性成分中,桂皮醛和丁香酚是透過性能最好的2種成分。

圖2 CNZP 5種活性成分體外透皮行為

以接近人皮的豬耳皮為對照,同時選取實驗室常用的大鼠腹部皮膚做對照,對CNZP中5種活性成分在豬耳皮、大鼠皮、Strat-MTM和CPLASM的表觀滲透系數(shù)(Apparent permeability coefficient,Papp)進行相關(guān)分析(表2,圖3)。相關(guān)性比較結(jié)果顯示,豬耳皮的Papp與CPLASM和Strat-MTM的Papp相關(guān)性系數(shù)(R)分別是0.965 8和0.943 3。大鼠皮的Papp與CPLASM和Strat-MTM的Papp相關(guān)性系數(shù)(R)分別是0.949 3和0.946 0。與市售Strat-MTM的體外透皮結(jié)果相比,CPLASM對CNZP中5種活性成分的透皮吸收行為的表征效果與豬耳皮和大鼠皮的基本一致,Papp相關(guān)性優(yōu)于采用Strat-MTM的評價結(jié)果。

表2 CNZP中5種活性成分采用Strat-MTM、豬耳皮、CPLASM及大鼠皮評價得到的透皮參數(shù)

圖3 CNZP 5種活性成分在不同皮膚模型中的透皮參數(shù)相關(guān)性

3 討論

CNZP作為成方制劑上市20余年,因其療效確切,深受廣大患者好評,目前對于其透皮吸收研究主要有指標性成分丁香酚、歐前胡素的透皮行為,凝膠膏劑、壓敏膠貼劑等劑型對丁香酚透皮吸收的影響,以及水楊酸甲酯在CNZP中對活性成分的促滲作用影響[8-11],為CNZP劑型優(yōu)化和質(zhì)量控制提供了依據(jù)。李璐等[3]對CNZP主要藥物丁香、肉桂、徐長卿中發(fā)揮消炎抗菌鎮(zhèn)痛作用的成分丁香酚、肉桂酸、桂皮醛、丹皮酚和水楊酸甲酯在不同接收介質(zhì)(生理鹽水,pH7.4磷酸鹽緩沖液和30%PEG400生理鹽水)中的透皮擴散規(guī)律進行研究,發(fā)現(xiàn)5種成分均能夠透過裸小鼠皮膚進而發(fā)揮藥效,并且確定最佳的接收介質(zhì)為含有30%PEG400的生理鹽水,因此本實驗采用該介質(zhì)作為透皮接受液。

目前常用于透皮吸收研究的實驗動物有小鼠、大鼠、豚鼠、豬和兔等,其中裸小鼠毛囊[12]數(shù)目和直徑與有毛小鼠相比更接近人類皮膚,但其角質(zhì)層厚度減半,透皮吸收參數(shù)評價結(jié)果有時與人皮結(jié)果差異較大。大鼠皮膚[13]因獲得容易而應(yīng)用較多。小型豬是公認[14-15]的經(jīng)皮滲透研究實驗動物,透射電鏡結(jié)果顯示豬皮膚表皮-真皮連接結(jié)構(gòu)與人皮膚相似[16],但價格昂貴。采用動物皮膚評價透皮吸收往往受動物的品系、年齡、性別、部位差異的影響而差異較大,皮膚制備過程也會影響皮膚的滲透性,因此采用人工皮膚膜[6]替代動物皮膚是大勢所趨,不僅能夠有效模擬人皮或豬耳皮,而且能夠減少評價結(jié)果的差異。

本實驗通過優(yōu)化HPLC方法,實現(xiàn)了同時測定CNZP中5種活性成分的透皮吸收行為,同時首次采用CPLASM和Strat-MTM與大鼠皮、豬耳皮對成方制劑CNZP中5種活性成分的透皮吸收行為進行比較研究,結(jié)果表明CNZP中5種活性成分在CPLASM的透皮行為與真實皮膚的相關(guān)度高于市售Strat-MTM人工皮膚膜,因此有望能夠替代動物皮膚應(yīng)用于中藥貼膏劑的體外透皮吸收評價,為中藥經(jīng)皮給藥制劑的質(zhì)量控制提供有效手段。

采用人工皮膚膜評價水楊酸甲酯的結(jié)果偏高,其原因可能是水楊酸甲酯的脂溶性較高,因而對于脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的人工皮膚膜透過性更好,而對于含有水性通道的真實皮膚透過性相對較低。因此未來的人工皮膚膜可能也要在成分上考慮采用角蛋白以構(gòu)建水性通道,以便進一步提升模擬真實皮膚的效果。