曹冰倩,譚峰,方美鳳,霍綺雯

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬佛山市中醫(yī)院,佛山 528000)

中風(fēng)已成為全球死亡和殘疾的第二大原因,中國的首位致死致殘病因,嚴(yán)重危害人們的生命健康[1-2]。缺血性卒中中的前循環(huán)腦梗死(anterior cerebral infarction, ACI)發(fā)病率遠(yuǎn)高于后循環(huán)腦梗死,發(fā)病后對(duì)患者日常生活、運(yùn)動(dòng)及認(rèn)知等神經(jīng)功造成極大的損害。目前腦梗死的干預(yù)措施十分有限,尋找有效的治療措施促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù),減輕腦卒中負(fù)擔(dān)已迫在眉睫。文獻(xiàn)證實(shí),包括炎性反應(yīng)、能量代謝障礙、興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等在內(nèi)的多種機(jī)制引起的神經(jīng)元和血管微循環(huán)損傷是腦缺血再灌注(cerebral infarction/reperfusion, CI/R)病理損害的主要原因[3-4],其中細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是近年來研究得最為廣泛的機(jī)制之一。新近研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)典炎癥小體 NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域 3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3, NLRP3)在激活后也會(huì)產(chǎn)生一系列的炎癥反應(yīng),將更多免疫細(xì)胞募集至病灶,誘發(fā)瀑布式炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),加重中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)的病理性損害,最終影響后期的神經(jīng)功能修復(fù)[5-8]。本課題組前期研究已經(jīng)證實(shí),電針能通過下調(diào)大腦的炎癥反應(yīng),促進(jìn)神經(jīng)功能修復(fù)?？墒请娽樖欠衲芨深A(yù)血清中NLRP3炎癥小體的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)ACI患者神經(jīng)修復(fù)?因此本研究基于NLRP3炎癥小體,探討電針干預(yù)ACI后炎癥反應(yīng)的深層機(jī)制。

1 臨床資料

1.1 一般資料

選取自2018年4月至2019年1月在廣州中醫(yī)藥大學(xué)第八臨床醫(yī)學(xué)院腦病科2區(qū)住院的ACI患者66例(樣本量采用《衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)》中等效性檢驗(yàn)進(jìn)行估算),按隨機(jī)數(shù)字表分為治療組和對(duì)照組,每組33例。治療組因進(jìn)展性卒中和治療療程不足脫落 3例,對(duì)照組因并發(fā)嚴(yán)重性疾病及療程不足脫落4例。最終實(shí)際納入治療組30例,對(duì)照組29例。兩組患者年齡、性別、發(fā)病時(shí)間、基礎(chǔ)疾病組成比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。基線一致性好,具有可比性,詳見表1。本研究經(jīng)佛山市中醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),批準(zhǔn)號(hào)為(2018)011號(hào)。

表1 兩組一般資料比較

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)制定的《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》[9]中急性期腦梗死診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

①符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn),發(fā)病14 d內(nèi);②年齡35～80歲;③美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(National Institute of Health stroke scale, NIHSS)評(píng)分為5～22分;④符合牛津郡社區(qū)卒中(Oxfordshire Community stroke project, OCSP)分型中的完全前循環(huán)梗死(total anterior cerebral infarction, TACI)或部分前循環(huán)梗死(part anterior cerebral infarction, PACI);⑤本次發(fā)病前無嚴(yán)重殘疾,改良Rankin量表評(píng)分≤3分;⑥非進(jìn)展性卒中;⑦意識(shí)清醒,自愿參加研究且已簽署知情同意書者。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

①24 h內(nèi)自行緩解的短暫性腦缺血發(fā)作,或已明確由其他原因引起腦栓塞者;②無其他可能影響試驗(yàn)結(jié)果的嚴(yán)重急慢性疾病者,如血液腫瘤疾病、自身免疫性疾病、嚴(yán)重的器官功能障礙等疾病;③發(fā)病前兩周或入院兩周內(nèi)出現(xiàn)影響觀測(cè)結(jié)果的并發(fā)癥者,包括感染性疾病等;④發(fā)病前存在影響功能恢復(fù)的CNS疾病者,如精神障礙、嚴(yán)重癡呆或留有卒中后遺癥。

1.5 中止與剔除標(biāo)準(zhǔn)

①未嚴(yán)格遵照規(guī)定方案治療,或療程不足;②無法判斷療效,或不配合治療;③自行要求退出試驗(yàn);④治療過程中出現(xiàn)不可控意外事件需退出試驗(yàn);⑤入組后發(fā)現(xiàn)不符合納入標(biāo)準(zhǔn)或符合排除標(biāo)準(zhǔn)的研究對(duì)象。

2 治療方法

參照《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》[9],給予規(guī)范治療,改善腦代謝,調(diào)控血壓和血糖,維持水電解質(zhì)平衡及對(duì)癥支持治療等。連續(xù)治療14 d。

2.1 對(duì)照組

參照《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》[9],給予規(guī)范基礎(chǔ)治療,予口服阿司匹林腸溶片(拜耳,規(guī)格 100 mg/片)和阿托伐他汀鈣片(輝瑞,規(guī)格 20 mg/片),對(duì)阿司匹林過敏或不能耐受可服用硫酸氫氯吡格雷片(波立維),每日1次。同時(shí)予改善腦代謝,調(diào)控血壓和血糖,維持水電解質(zhì)平衡及對(duì)癥支持治療等。連續(xù)治療14 d。

2.2 治療組

在對(duì)照組治療基礎(chǔ)上聯(lián)合電針治療。穴位取百會(huì)和大椎[10]?；颊呷?cè)臥位或坐位,常規(guī)皮膚消毒后采用平刺和斜刺,行針得氣后連接G6805-1型電針儀。設(shè)置斷續(xù)波,頻率和強(qiáng)度參數(shù)分別為2 Hz和1 mA,以患者耐受為度。專業(yè)針灸治療師根據(jù)患者病情辨證施治予不加電的體針治療,每次留針30 min,每日1次,周日停。連續(xù)治療14 d。

3 治療效果

3.1 觀察指標(biāo)

3.1.1 NIHSS

治療前后對(duì)患者意識(shí)、凝視、視野、運(yùn)動(dòng)、感覺、言語等神經(jīng)功能缺失情況進(jìn)行評(píng)估,總分42分。是目前最常用的評(píng)價(jià) ACI患者神經(jīng)功能缺損程度的量表,評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)客觀,可信度、能效性及預(yù)測(cè)價(jià)值較高。神經(jīng)功能缺失情況與得分呈負(fù)相關(guān),能有效觀察治療后的恢復(fù)情況。

3.1.2 簡(jiǎn)化 Fugl-Meyer運(yùn)動(dòng)功能評(píng)定法(simplified Fugl-Meyer Motor assessment, SFMA)

從 17個(gè)項(xiàng)目能較為全面詳細(xì)地反應(yīng)患者四肢的運(yùn)動(dòng)功能,總分100分。得分越高,患者運(yùn)動(dòng)功能狀況越好,對(duì)運(yùn)動(dòng)功能狀況改善評(píng)價(jià)的靈敏較高。

3.1.3 改良Barthel指數(shù)(modified Barthel index,MBI)

在治療前后對(duì)患者進(jìn)行評(píng)分,通過 10項(xiàng)內(nèi)容、5級(jí)評(píng)級(jí)判定患者日常生活活動(dòng)能力,總分100分。該評(píng)分對(duì)患者日常生活的獨(dú)立能力分級(jí)具有一定的敏感性。

3.1.4 血清 NLRP3和白介素-18(interleukin-18,IL-18)水平

采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)兩組患者在治療前后的NLRP3和IL-18濃度。兩組患者在治療前及治療后,于清晨空腹用特定試管抽取外周靜脈血 5 mL。室溫放置 2 h或 4 ℃過夜。再置于 2～8 ℃環(huán)境1 000 r/min離心15 min,取上層血清分裝于EP管中。按照武漢華美(NLRP3,批號(hào) G13012263)和聯(lián)碩(IL-18,批號(hào)201903)提供的試劑盒說明書進(jìn)行操作。

3.1.5 不良反應(yīng)

觀察治療過程中出現(xiàn)暈針、滯針、斷針、彎針、皮下血腫等不良反應(yīng)情況。

3.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有原始數(shù)據(jù)錄入Excel數(shù)據(jù)庫后采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料比較用卡方檢驗(yàn)。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較時(shí)采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),組內(nèi)比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn);不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料,比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.3 治療結(jié)果

3.3.1 兩組治療前后NIHSS、SFMA和MBI評(píng)分比較

治療后,兩組NIHSS、SFMA和MBI評(píng)分優(yōu)于治療前,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);治療組 NIHSS和 SFMA評(píng)分優(yōu)于對(duì)照組(P＜0.05);兩組 MBI評(píng)分比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。詳見表2。

表2 兩組治療前后NIHSS、SFMA和MBI評(píng)分比較 (±s,分)

表2 兩組治療前后NIHSS、SFMA和MBI評(píng)分比較 (±s,分)

注:與同組治療前比較1)P＜0.01;與對(duì)照組比較2)P＜0.05。

組別 例數(shù) NIHSS評(píng)分 SFMA評(píng)分 MBI評(píng)分治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后治療組 30 5.60±2.31 2.77±1.791)2) 74.13±19.22 87.07±15.121)2) 69.57±19.76 85.07±17.851)對(duì)照組 29 5.72±2.53 3.97±2.581) 73.90±16.31 80.38±15.061) 70.10±19.30 83.97±12.321)

3.3.2 兩組治療前后血清NLRP3和IL-18水平比較

治療后,兩組血清NLRP3和IL-18水平低于治療前(P＜0.01);治療組NLRP3和IL-18水平明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)。詳見表3。

表3 兩組治療前后血清NLRP3和IL-18水平比較 (±s)

表3 兩組治療前后血清NLRP3和IL-18水平比較 (±s)

注:與同組治療前比較1)P＜0.01;與對(duì)照組比較2)P＜0.05。

組別 例數(shù) NLRP3(ng/mL) IL-18(ng/L)治療前 治療后 治療前 治療后治療組 30 0.38±0.12 0.23±0.091)2) 41.89±14.49 26.58±6.771)2)對(duì)照組 29 0.38±0.12 0.30±0.121) 40.34±13.93 31.62±9.721)

3.4 安全性評(píng)估

1例患者在非首日電針治療時(shí)出現(xiàn)暈針反應(yīng),立即停止治療,予臥床休息后自行緩解,之后電針治療未見不適。余未見不良反應(yīng)。

4 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,前循環(huán)腦梗死(ACI)屬于“中風(fēng)”范疇,因人體內(nèi)“風(fēng)、火、痰、虛、瘀、氣”相互交織,陰陽失調(diào)、氣血逆亂,而致腦脈痹阻、神機(jī)失用,發(fā)為中風(fēng)。ACI后會(huì)產(chǎn)生內(nèi)源危險(xiǎn)信號(hào),刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)時(shí)會(huì)啟動(dòng)一系列炎癥反應(yīng),釋放出大量炎癥介質(zhì),在疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了重要的病理作用,影響后期的神經(jīng)功能修復(fù)[11]。NLRP3是目前研究較多的一種具有代表性的炎癥小體[12-14],能激活具有蛋白剪切活力的半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1, caspase-1),進(jìn)而活化IL-18和IL-1β,清除體內(nèi)危險(xiǎn)信號(hào)[15-17]。上述炎癥反應(yīng)同熟知免疫反應(yīng)一樣,具有雙重特性。一方面抵抗內(nèi)外源致病原,依賴 caspase-1的效應(yīng)分子Gasdermin-D(GSDMD),GSDMD的結(jié)構(gòu)域N端在細(xì)胞膜上聚合成一個(gè)中空的孔道,使細(xì)胞內(nèi)外離子可以自由進(jìn)出,打破內(nèi)外的離子平衡,促使細(xì)胞滲透性腫脹破裂,啟動(dòng)全身的免疫炎癥反應(yīng)清除致病原,破壞致病原依賴的環(huán)境[18]。另一方面,過度表達(dá)的炎癥反應(yīng),會(huì)釋放大量病理性的促炎因子,進(jìn)而募集更多免疫細(xì)胞至病灶,放大炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),加重ACI的病理損害。有報(bào)道指出,上述的炎癥反應(yīng)還存在于CNS小膠質(zhì)細(xì)胞中[19],參與了腦缺血的病理損傷[20]。

針灸治療缺血性卒中療效顯著,通過刺激腧穴,以疏通經(jīng)脈,調(diào)整臟腑功能,調(diào)和氣血陰陽,進(jìn)而激發(fā)自身抵抗病邪的正氣,使機(jī)體從病理向生理狀態(tài)轉(zhuǎn)變,具有簡(jiǎn)效廉便的特點(diǎn)。文獻(xiàn)表明,針刺可以通過抑制炎性反應(yīng)、減輕氧自由基損傷、減少細(xì)胞凋亡、減輕腦組織水腫、促進(jìn)側(cè)支循環(huán)生成及重建等機(jī)制改善 CI/R后的損傷[21-22]。督脈為“陽脈之海”,別行奇道,從會(huì)陰向后上方循于腰背正中,與手足三陽經(jīng)會(huì)于大椎,總督諸陽經(jīng),至項(xiàng)后風(fēng)府入顱絡(luò)腦?？梢哉{(diào)節(jié)全身陽經(jīng)氣血,通髓達(dá)腦,與CNS疾病密切相關(guān)。已有實(shí)驗(yàn)[23]發(fā)現(xiàn)針刺百會(huì)和大椎可顯著減少 CI/R后半暗帶區(qū)的神經(jīng)元損傷,促進(jìn)神經(jīng)再生,其機(jī)制可能與上調(diào)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)有關(guān)。另外,電針督脈還能通過促進(jìn)腦脊液的流動(dòng)改善梗死區(qū)域的微循環(huán)[24-25]。本課題組在前期的研究也發(fā)現(xiàn),海馬區(qū)域抑制信號(hào) Ras同源基因家族成員通路的傳導(dǎo)可被電針百會(huì)和大椎所阻遏,進(jìn)而減輕遠(yuǎn)隔區(qū)域二次損害,促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖[26-28]。此外,電針對(duì)梗死灶對(duì)側(cè)皮層生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43及微管相關(guān)蛋白2的陽性表達(dá)也有一定的良性干預(yù)作用,可以進(jìn)一步促進(jìn)缺血后遠(yuǎn)隔區(qū)域神經(jīng)重塑的發(fā)生。

本研究發(fā)現(xiàn),無論是治療組還是對(duì)照組,在治療前后NIHSS、SFMA和MBI評(píng)分的組內(nèi)差異都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示兩組的治療方案均能顯著改善患者的神經(jīng)功能缺損、運(yùn)動(dòng)功能障礙及日常生活活動(dòng)能力。治療后,兩組在改善患者NIHSS和SFMA評(píng)分方面有一定的差異,提示電針在改善神經(jīng)功能缺損、運(yùn)動(dòng)功能障礙方面具有一定的疊加治療效果。雖然本研究中治療組與對(duì)照組在治療后的 MBI評(píng)分上無顯著性差異,但這與其他研究結(jié)果具有一致性。ZHEN C等[29]證實(shí)了電針在提高NIHSS和FMA等神經(jīng)功能量表評(píng)分方面具有一定的優(yōu)越性,而在日常生活能力改善方面遠(yuǎn)期效果更為顯著[30]。提示電針在改善神經(jīng)功能缺損、運(yùn)動(dòng)功能障礙方面的療效優(yōu)于日常生活活動(dòng)能力,電針改善日常生活能力可能需要長(zhǎng)療程的累積效應(yīng)。

NLRP3炎癥小體主要由胞漿內(nèi)模式識(shí)別受體、接頭蛋白凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a card, ASC)和前體蛋白 pro-caspase-1共同組成的蛋白炎癥體復(fù)合物。在識(shí)別病原刺激后,招集下游ASC形成炎癥小體,幫助caspase-1自剪切激活。形成NLRP3/caspase-1級(jí)聯(lián)反應(yīng)通路,激活并釋放炎癥因子IL-18和IL-1β,介導(dǎo)機(jī)體內(nèi)炎癥損傷[31-32]。研究發(fā)現(xiàn),NLRP3在 CI/R中被廣泛激活后發(fā)揮重要的二次損害作用,釋放大量細(xì)胞因子、促進(jìn)神經(jīng)元凋亡[33-35]。而 NLRP3抑制劑在一定程度可減輕CI/R損傷[32],說明NLRP3炎癥體可能是CI/R后神經(jīng)修復(fù)困難的潛在靶點(diǎn)。本研究中,無論治療組還是對(duì)照組,血清NLRP3在治療后有顯著降低,治療組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明電針輔助治療對(duì)ACI患者神經(jīng)炎癥反應(yīng)的下調(diào)具有一定的干預(yù)作用。

綜上,本研究基于 NLRP3的活化探討電針對(duì)腦梗死炎癥反應(yīng)的干預(yù)作用。發(fā)現(xiàn)電針能降低治療組患者外周血NLRP3和IL-18的水平,并顯著改善神經(jīng)功能缺損、運(yùn)動(dòng)功能障礙。推測(cè)電針可能通過干預(yù)NLRP3相關(guān)的炎癥反應(yīng),改善神經(jīng)功能缺損、運(yùn)動(dòng)功能障礙,減輕ACI神經(jīng)損害,促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)。為ACI的發(fā)病提供了可能的機(jī)制研究,也為NLRP3作為CI/R后神經(jīng)修復(fù)困難的新靶點(diǎn)提供了一定的理論依據(jù)。本研究樣本量有限,未來還需要多中心、大樣本的臨床研究和基礎(chǔ)研究提供更可靠的理論依據(jù)。