郭旭旭 ，張國梅，鄭永豪

（1.山西大學 化學化工學院，山西 太原 030006；2.山西省化工研究所（有限公司），山西 晉中 030600；3.電子科技大學 光電科學與工程學院，四川 成都 611731）

0 引言

自2004年Xu等［1］研究者在純化單壁碳納米管過程中發(fā)現(xiàn)了碳量子點（CDs）以來，CDs作為一種新型［2］的熒光納米材料引起各領域研究者極大的關注。CDs是尺寸小于10 nm的具有熒光性質(zhì)的碳顆粒、為核殼復合結構、由碳核和表面的水溶性基團（-OH、-NH2和-COOH）組成，這使得CDs具有優(yōu)異的水溶性和表面易于進行功能化［3］。與其他熒光納米材料（金屬納米簇［4］、有機染料、半導體量子點等）相比，CDs具有低毒［5］、環(huán)保［6］、水溶性好［7］和生物相容性好等特性，使其在化學傳感［8］、生物傳感、光催化和生物成像等領域應用廣泛。近年來發(fā)現(xiàn)了多種合成 CDs的方法，熱解法［9］、水熱法［10］、微波輔助合成法、激光銷蝕法［11］、電弧放電法等。其中，水熱法是最常用到的合成方法，通常是將含有碳源的溶液在高溫高壓條件下一步合成CDs，此方法具有合成過程簡單［12］、成本較低、碳源來源豐富以及環(huán)境友好等優(yōu)點。CDs的原料來源廣泛且綠色環(huán)保，研究者將香菇［13］、西瓜皮［14］、蘆薈、木瓜和紅辣椒［15］等物質(zhì)作為碳源合成一系列不同性能的CDs。

維生素B12是一類含鈷元素的水溶性維生素，在機體內(nèi)的物質(zhì)代謝中起著重要作用，如：促進機體蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的合成；提高機體對葉酸的利用率；促進紅細胞的發(fā)育和成熟；促進機體神經(jīng)髓鞘的形成［16］等。高等動植物是不能自己合成維生素B12（VB12），且只存在于動物類的食物中，如魚、蛋、動物肝臟及肉類之中，奶制品中亦含少量。維生素B12缺乏或者攝入不足會出現(xiàn)一系列疾病，如：惡性貧血、精神憂郁［17］、幼子發(fā)育不良、脊髓變形等。此外，過量的攝入維生素B12也會產(chǎn)生副作用，如：哮喘、濕疹、蕁麻疹、面部浮腫等過敏性癥狀。因此找到一種簡單、響應速度快且高效的方法用于維生素B12含量的檢測至關重要。近年來常用于檢測維生素B12的方法有高效液相色譜法、原子吸收光譜法、比色法、化學發(fā)光、微生物法、電流分析法等。這些方法都有其自身的局限性，如：檢出限比較高（μmol/L）、耗時長、需要昂貴且復雜的儀器、樣品需要預處理等。因此迫切需要一種合成簡單、響應速度快、抗干擾能力強、選擇性高的方法用于對食品或生物樣品中維生素B12的檢測。

藏紅花別名西紅花，是一種多見的中藥材，本文以藏紅花為碳源，通過一步水熱法合成發(fā)藍光的熒光CDs，基于維生素B12對該CDs熒光有顯著猝滅作用。因此建立了一種快速、高選擇和高靈敏檢測VB12的方法。如圖1所示。

圖1 CDs的合成及對維生素B12的響應示意圖Fig.1 Schematic illustration of the synthesis of CDs and response to Vitamin B12

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

（1）試劑

藏紅花購買于拉薩益昌商貿(mào)有限公司；葡萄 糖 、乳 糖 、尿 素 、Cys、VB12、Vc、VB6、VB1、Na2HPO4、NaH2PO4、Mg2+、K+、Ca2+、Zn2+、Fe3+、Cu2+等均購買于Sigma Aldrich化學試劑公司均為分析純試劑；維生素B12滴眼液購買于黑龍江天龍藥業(yè)有限公司；維生素B12注射液購買于上海全宇生物科技動物藥業(yè)有限公司；水為高純水（導電率＞18 MΩ）；PBS緩沖溶液由Na2HPO4和NaH2PO4配制而成。

（2）儀器

透射電子顯微鏡TEM（JEM-2100，JEOL有限公司），熒光分光光度計（F-4500，日立公司），紅外光譜（Bruker，布魯克科技有限公司），紫外可見分光光度計（UV-265，島津公司），X射線電子能譜儀XPS（Kratos Axis Ulradld，Krstos公司），暗箱三用紫外線分析儀（ZE-7，嘉鵬科技有限公司）。

1.2 藏紅花CDs的合成

該藏紅花CDs通過參考之前文獻［18］中提到的一步水熱法來合成，首先將藏紅花粉碎成細小的粉末，稱取該粉末0.2 g溶于30 mL的高純水中，攪拌2 min，隨后將該溶液轉(zhuǎn)移至50 mL的不銹鋼高壓反應釜中，在電熱干燥箱中200℃下反應10 h，反應完后將該溶液靜置、冷卻至室溫，過濾掉大顆粒、再通過離心機（13 000 r·min-1）將濾液離心 10 min，然后將合成的CDs放在冰箱冷藏室中儲存，留得進一步表征和分析用。

1.3 CDs對VB12的檢測

首先將合成的該CDs溶液稀釋30倍，隨后將 10 μL 的 CDs稀釋液、500 μL 的高純水和500 μL的PBS緩沖溶液（pH=5）混合形成探針溶液（probe），在上述探針溶液中分別加入不同濃度的VB12，室溫下反應3 min后，在激發(fā)波長為360 nm下分別測其熒光強度。其次，在上述相同條件下，將不同濃度的葡萄糖、乳糖、尿素、Cys、Vc、VB6、VB1、Mg2+、K+、Ca2+、Zn2+、Fe3+、Cu2+等溶液分別加入探針溶液中，測其對CDs熒光強度的影響。

1.4 CDs對實際樣品中VB12的測定

VB12注射液為粉紅色澄清液體，主要用于VB12缺乏所致的貧血、生長遲緩、也可用于神經(jīng)系統(tǒng)病變輔助治療；VB12滴眼液是一種能夠很好地用于治療眼疲勞和干眼癥的滴眼液。為了評估該CDs的實用價值，在1.3相同的條件下測其不同含量的VB12注射液和VB12滴眼液對該CDs熒光強度的影響。

2 結果與討論

2.1 CDs的表征

圖2（a）為 CDs的TEM圖，可觀察得：它的形狀呈類球形狀，有較好的分散性，且從粒徑分布圖計算得平均粒徑為（4.1±0.3）nm。圖2（b）為純藏紅花（黑線）與CDs（紅線）的紫外可見吸收光譜，與純藏紅花的光譜圖相比，CDs在274 nm處有明顯的吸收峰出現(xiàn)，說明合成了CDs［19］。 插 圖表明：日光燈照射下 CDs 呈棕色，紫外燈（365 nm）照射下呈現(xiàn)藍光。圖2（c）可知該CDs的最佳激發(fā)和發(fā)射波長分別為360和458 nm。圖2（d）為純藏紅花（黑線）和CDs（紅線）的紅外光譜圖，CDs在3377 cm-1處的較強的吸收峰歸因于-OH與-NH的特征性伸縮振動、在2932 cm-1處的吸收峰為C-H的伸縮振動引起的、在1668 cm-1處較強的吸收為C=O的特征吸收峰，表明合成的CDs表面含有羧基、羥基、氨基等水溶性基團，且純藏紅花和CDs的紅外光譜圖較相似且存在微妙的差異，進一步說明了CDs的合成。圖2（e）為CDs的XPS全譜圖，表明CDs中含有C、N、O等元素。圖2（f）為C 1s的高分辨率XPS光譜圖，可知有C-C（284.97 eV）、C-O/C-N（286.35 eV）、C=O（288.06 eV）官能團的存在。

圖2 （a）CDs的TEM圖像；（b）純藏紅花和CDs的UV-vis吸收光譜圖。插圖：CDs在日光燈（左）和365 nm紫外燈（右）下的照片；（c）CDs的熒光光譜圖；（d）純藏紅花和CDs的紅外光譜圖；（e）CDs的XPS譜圖；（f）CDs的高分辨率C 1s譜圖Fig.2 (a)TEM images of the CDs;(b)UV-vis absorption spectra of the pure Saffron and CDs.Inset:the photographs of CDs under daylight(left)and 365 nm UV light(right);(c)Fluorescence spectra of the CDs;(d)The infrared(IR)spectra of the pure Saffron and CDs;(e)XPS survey spectrum of CDs;(f)High resolution C 1s specta of CDs

2.2 CDs對VB12的熒光檢測和選擇性研究

通過控制變量法，研究了pH和時間對實驗效果的影響。首先，將稀釋后的10 μL CDs溶液、500 μL的高純水和 500 μL的 PBS緩沖溶液形成探針溶液，加入20 μL的維生素B12溶液，記錄了不同的pH對熒光猝滅效果的影響，如圖3（a）可觀察得pH=5時，維生素B12對探針的響應效果最佳，這與維生素B12在pH=4.5～5.0弱酸條件下最穩(wěn)定、在強酸或者堿性溶液中易分解的事實相吻合。其次，將稀釋后的10 μL CDs溶液和1000 μL的高純水配成探針溶液，加入20 μL的維生素B12，記錄不同的響應時間對熒光猝滅效果的影響，如圖3（b）可得CDs和維生素B12最佳反應時間為3 min。

在最優(yōu)條件（pH=5、響應時間為3 min、激發(fā)波長設為360 nm）下，如圖3（c）可知，隨著VB12濃度逐漸遞增，體系的熒光強度逐漸降低，且在365 nm紫外燈照射下可觀察到藍光逐漸消失。圖 3（d）可知，VB12濃度在 0～90 μmol·L-1范圍內(nèi)，體系在458 nm處的F0/F與VB12的濃度之間有良好的線性關系，線性回歸方程為F0/F=0.048 C（μmol·L-1）+0.909，相關系數(shù)為 R2=0.995。檢出限（LOD）為312 nmol·L-1。表明合成的該CDs對VB12的檢測具有較高的靈敏度。

在相同的實驗條件下，在探針中分別加入尿素、半胱氨酸、葡萄糖、乳糖、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe3+、Cu2+、K+溶液 1000 μmol·L-1；VB1、VB6、Vc溶液 100 μmol·L-1時，如圖 3（e）可觀察到，體系熒光強度幾乎都沒有發(fā)生變化；隨后在上述溶液中分別再加入 100 μmol·L-1的VB12溶液時，體系熒光強度都有明顯的猝滅，猝滅程度（F0/F值）都在5左右?？梢娫揅Ds對VB12的檢測具有良好的選擇性和抗干擾性。在探針中分別加入尿素、半胱氨酸、葡萄糖、乳糖、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe3+、Cu2+、K+溶液1000 μmol·L-1；VB1、VB6、Vc、VB12溶液 100 μmol·L-1時，圖3（f）可觀察到，在365 nm紫外燈照射下，只有加入VB12時，體系的藍光消失，可以實現(xiàn)對VB12的定性判斷。

圖3 （a）pH對探針熒光強度的影響；（b）響應時間對體系熒光強度的影響；（c）不同濃度的VB12對CDs熒光強度的影響，插圖：365 nm紫外燈照射下，不同濃度的VB12（0，5，20，50，80 μmol·L-1）與體系作用后的圖片；（d）體系在458 nm處，F(xiàn)0/F和VB12濃度之間的線性關系（F0和F分別是不存在和存在VB12時體系的熒光強度）；（e）不同物質(zhì)對CDs檢測的選擇性和干擾性；（f）365 nm紫外燈照射下，不同物質(zhì)與體系作用后的圖片F(xiàn)ig.3 (a)Effect of pH value on fluorescence intensity of probe;(b)Effect of response time on fluorescence intensity of probe;(c)Effects of different concentrations of Vitamin B12on CDs,Inset:The pictures of different concentrations of VB12(0,5,20,50,80 μmol·L-1)interacted with the system under the irradiation of 365 nm UV lamp;(d)The linear relationship between F0/F and Vitamin B12concentration at 458 nm(F0and F are the fluorescence intensity of system in the absence and presence of VB12,respectively);(e)Selectivity and interference of different substances for CDs detection;(f)The pictures of different substances interacted with the system under the irradiation of 365 nm UV lamp

2.3 CDs檢測VB12機理的探討

如圖4（a），CDs的最佳激發(fā)波長為360 nm，且VB12在360 nm處有一個很強的吸收，可推知熒光猝滅機理：CDs的激發(fā)被VB12吸收所致的內(nèi)濾效應。同時進行了熒光衰變實驗，如圖4（b）所示，通過雙指數(shù)擬合，發(fā)現(xiàn)加入VB12時的熒光壽命從11.097 ns降低到7.821 ns，進一步說明VB12對CDs的猝滅屬于動態(tài)猝滅。

圖4 （a）VB12的UV-vis吸收光譜圖和CDs的最佳激發(fā)光譜圖；（b）體系的熒光壽命譜圖Fig.4 (a)UV-vis absorption spectrum of Vitamin B12and optimal excitation spectrum of CDs;(b)Fluorescence lifetime spectra of the system

2.4 實際樣品中VB12的檢測

將VB12注射液（0.5 mg/mL）和VB12滴眼液（0.2 mg/mL）稀釋10倍，向8個CDs溶液（2組）中分別加入10 μL的VB12注射液和VB12滴眼液，然后在上述兩組溶液中分別加入不同濃度的VB12標準物質(zhì)（0，10，20，40和80 μmol·L-1），并分別測定其上述溶液的熒光強度以及計算其熒光猝滅比例，根據(jù)其標準加入法求得VB12注射液和VB12滴眼液的濃度。將以上實驗分別重復3次，將其結果與注射液和滴眼液的已知濃度做對比，結果如表1，可知回收率較高，表明該方法用具有一定的實用性和普適性，可用于VB12的定量檢測。

表1 實際樣品中VB12的檢測Table 1 Determination of VB12in actual samples

3 結論

本文用一種簡單的一步水熱法合成了發(fā)藍光的CDs溶液，可對VB12進行熒光檢測，該方法還可以用于實際樣品（VB12注射液和VB12滴眼液）中VB12的測定。此外，在紫外燈照射下，可觀察到只有VB12使CDs溶液的藍光猝滅。因此，該探針可用于實際樣品中VB12的半定性和熒光定量檢測。