吳靜，曹明原,2，曾金國(guó), 謝傳奇，顧震，吳磊,2*，徐敢珍

（1.江西省科學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所，江西南昌 330096；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西南昌 330045；3.江西新世嘉農(nóng)業(yè)科技有限公司，江西宜春 336000）

何首烏（Polygonum multiflorumThunb.），又稱多花蓼、夜交藤，其葉也稱為首烏葉，為蓼科（Polygonaceae）何首烏屬（Fallopia Adans.）藤本植物[1]，生長(zhǎng)于山間林下，在我國(guó)河南、廣東、江西、廣西、四川以及貴州等地均有廣泛的種植，是民間的一種常用補(bǔ)益中藥。何首烏性甘、平；歸心、肝經(jīng)，具有養(yǎng)血安神、延年益壽、強(qiáng)筋健骨的功效[2]。現(xiàn)代藥理學(xué)表明，何首烏具有抗氧化、抗癌、烏發(fā)及神經(jīng)鎮(zhèn)定等活性，其對(duì)阿茲海默癥、失眠、糖尿病及心腦血管病均有一定的治療效果[3-7]。

何首烏含有豐富的化學(xué)成分，包括二苯乙烯類、黃酮類、酚類、萜類以及醌類等化學(xué)成分，這些成分與其生物活性有著密切的關(guān)系[8-10]。目前，有關(guān)何首烏塊根的化學(xué)成分及含量測(cè)定已有大量學(xué)者進(jìn)行了研究，尤其是對(duì)何首烏塊根中的二苯乙烯苷及蒽醌類含量的研究，其評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)與質(zhì)量控制體系已相當(dāng)完善。而何首烏的采后剩余部分如首烏葉中的化學(xué)成分分離及其含量測(cè)定，卻鮮有報(bào)道，同時(shí)也存在著研究不夠深入、缺乏相應(yīng)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)等問(wèn)題。王芳等[11]對(duì)貴州省何首烏不同部位的成分進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果在首烏葉中未檢測(cè)出二苯乙烯苷，同時(shí)蒽醌類化合物的含量也極低（僅有0.01%），表明何首烏葉的化學(xué)成分與塊根有較大差異。因此，進(jìn)行首烏葉有效成分的分離純化及質(zhì)量控制方法研究，對(duì)于完善該鑒定體系尤為重要。江西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)院曾對(duì)江西省種植區(qū)域內(nèi)的首烏葉中的總黃酮含量進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明首烏葉中總黃酮含量約為1%，含量較高，有進(jìn)一步研究的價(jià)值[12]。本實(shí)驗(yàn)從首烏葉中首次分離純化得到了楊梅苷、槲皮苷及阿福豆苷3種黃酮苷類化合物，楊梅苷與槲皮苷在抗氧化及抗炎等方面均有較強(qiáng)的活性[5]，具有成為首烏葉中質(zhì)量標(biāo)志物的潛力。本研究在化學(xué)成分分離的基礎(chǔ)上，建立HPLC法同時(shí)測(cè)定首烏葉中3個(gè)黃酮苷類成分含量的方法，以期為建立首烏葉質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)并完善其質(zhì)量控制體系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

RE52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、B-260恒溫水浴鍋，上海亞榮生化儀器廠；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；DLSB-10L/10低溫冷卻液循環(huán)泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；ME204E電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；Milli-Q? IQ Element超純水器，法國(guó)密里博公司；S-501高效液相色譜儀，德國(guó)賽卡姆公司；AV-400型核磁共振儀，瑞士Bruker公司。

1.2 試劑與材料

對(duì)照品：楊梅苷（純度95.9%）、槲皮苷（純度97.0%）、阿福豆苷（純度96.7%），均由本實(shí)驗(yàn)從何首烏葉中分離純化得到；甲醇、乙腈均為色譜純，德國(guó)Sigma公司；乙醇、乙酸乙酯，分析純，天津致遠(yuǎn)化學(xué)股份有限公司；CHP20/P120 MCI凝膠，日本三菱化學(xué)公司；水為超純水。

8批藥材由江西新世嘉農(nóng)業(yè)科技有限公司采收并提供，經(jīng)江西省科學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所鑒定均為何首烏葉，具體信息如表1所示。

表1 樣品信息

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 提取與分離

將何首烏葉徹底干燥后粉碎，取粉碎后的何首烏葉10 kg，料液比1∶20 （g∶mL）加入70%的乙醇超聲（400 W，25 min）重復(fù)提取2次，之后進(jìn)行抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，減壓濃縮后得到何首烏葉乙醇粗提物（1.745 kg），將粗提物加入適量水混合后，用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，之后經(jīng)過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、減壓濃縮后得到乙酸乙酯萃取部位浸膏（149.71 g）。乙酸乙酯部位經(jīng)MCI中高壓色譜柱（10%甲醇-100%甲醇梯度洗脫）得到5個(gè)部分，其中30%甲醇洗脫部分經(jīng)半制備高效液相色譜分離得到化合物1（27.91 mg，tR=18.07 min）、化合物2（32.47 mg，tR=20.61 min）和化合物3（9.05 mg，tR=24.39 min）。

1.3.2 HPLC色譜條件

色 譜 柱 為SHIMADZU Shimpack GIST C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-水（B），梯度洗脫程序（0～10 min，15%A；10～13 min，15%A → 25%A；13～ 35 min，25%A）；柱溫35 ℃；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)350 nm；進(jìn)樣量10 μL。

1.3.3 溶液制備

（1）混合對(duì)照品溶液的制備。楊梅苷、槲皮苷及阿福豆苷對(duì)照品均由本次實(shí)驗(yàn)分離得到（經(jīng)ESI-MS及NMR結(jié)構(gòu)鑒定，分別對(duì)應(yīng)化合物1、化合物2及化合物3），經(jīng)HPLC峰面積歸一化法得出楊梅苷、槲皮苷及阿福豆苷純度分別為95.9%、97.0%、96.7%。準(zhǔn)確稱量楊梅苷、槲皮苷、阿福豆苷對(duì)照品適量，加入甲醇配制成每1 mL分別含楊梅苷400 μg、槲皮苷200 μg和阿福豆苷200 μg的混合對(duì)照品溶液。

（2）供試品溶液的制備。將何首烏葉烘干，粉碎過(guò)篩后，準(zhǔn)確稱取干燥的何首烏葉粉末0.1 g，精密加入100%甲醇溶液10 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取25 min（功率400 W，頻率40 kHz），放冷，并用100%甲醇補(bǔ)足損失的量，搖勻后過(guò)0.45 μm微孔濾膜。取續(xù)濾液，即得供試品溶液[13]。

看到孩子眼中的熱愛(ài)，也看到孩子身上的天賦，振宇的爸爸一咬牙，在自己的工作室打造了一個(gè)小小的“實(shí)驗(yàn)室”，配備了各種設(shè)備儀器，方便振宇進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)，實(shí)現(xiàn)腦中的“奇思妙想”。在爸爸的大力支持和溫暖陪伴下，小振宇獲得了更多機(jī)會(huì)去接觸和探索科技世界。就這樣，一顆充滿無(wú)限可能性的種子漸漸發(fā)芽……

1.3.4 方法學(xué)考察

（1）專屬性實(shí)驗(yàn)。取“1.3.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液和供試品溶液，按“1.3.2”項(xiàng)下HPLC色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣分析。

（2）線性關(guān)系考察。精確量取混合對(duì)照品溶液適量，按一定比例稀釋并配制成6.25 μg/mL、12.50 μg/mL、25 .0 0μg/mL、50.00 μg/mL、80 .00 μg/mL、100 .00 μg/mL和200.00 μg/mL溶液，按照“1.3.2”的色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣分析測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（3）精密度實(shí)驗(yàn)。取“1.3.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按照“1.3.2”的色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣分析測(cè)定。

（4）重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。取同一批何首烏葉樣品（S1），按“1.3.3”項(xiàng)方法制備6份供試品溶液，并按照“1.3.2”的色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣分析測(cè)定。

（5）穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。取同一份供試品溶液，分別在0 h、3 h、6 h、9 h、12 h和24 h進(jìn)樣，按照“1.3.2”的色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣分析測(cè)定。

（6）加樣回收率實(shí)驗(yàn)。取同一批號(hào)已知含量樣品（S1）9份，準(zhǔn)確稱取每份0.1 g，分別精密加入濃度為400 μg/mL的楊梅苷對(duì)照品溶液0.25 mL，濃度為200 μg/mL的槲皮苷對(duì)照品溶液和阿福豆苷對(duì)照品溶液各0.5 mL，定容至10 mL，按照“1.3.2”的色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣分析測(cè)定，計(jì)算3個(gè)成分的平均回收率與RSD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：黃色粉末（甲醇），C21H20O12；1H-NMR（400 MHz, DMSO-d6）：δ 0.84 （3H，d，J=6.2 Hz，H-6”），3.17（1H，m，H-4”），3.40（1H，m，H-5”），3.57（1H，dd，J=9.2，3.0 Hz，H-3”），3.98（1H，brs，H-2”），5.20（1H，d，J=1.0 Hz，H-1”），6.20（1H，d，J=1.9 Hz，H-6），6.37（1H，d，J=1.9 Hz，H-8），6.88 （2H，s，H-2’，6’）；13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）：δ 17.99（C-6”），70.47（C-2”），70.84（C-3”），71.01（C-5”），71.72（C-4”），93.97（C-8），99.11（C-6），102.38（C-1”），104.49 （C-10），108.35（C-2’，6’），120.06（C-1’），134.72（C-3），136.90（C-4’），146.22（C-3’，5’），156.85（C-9），157.94（C-2），161.76（C-5），164.61（C-7），178.23（C-4）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物1為楊梅苷。

化合物2：黃色粉末（甲醇）；C21H19O11；1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）：δ 0.83 （3H，d，J=6.1 Hz，H-6”），3.17（1H，t，J=9.4 Hz，H-4”），3.40（1H，m，H-5”），3.53（1H，dd，J=9.1，3.3 Hz，H-3”），3.99（1H，brs，H-2”），5.26（1H，s，H-1”），6.22（1H，s，H-8），6.41（1H，s，H-6），6.86（1H，d，J=8.3 Hz，H-5’），7.25（1H，dd，J=8.3，2.1 Hz，H-6’），7.31（1H，d，J=2.1 Hz，H-2’）；13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）：δ 17.96（C-6”），70.04（C-3”），70.51（C-5”），70.80（C-2”），71.63（C-4”），94.08（C-8），99.14（C-6），102.28（C-1”），104.53（C-10），115.91（C-2’），116.10（C-5’），121.17 （C-1’），121.56 （C-6’），134.66（C-3），145.65（C-3’），148.89（C-4’），156.89（C-2），157.75（C-9），161.74（C-5），164.64（C-7），178.19（C-4）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物2為槲皮苷。

化合物3：黃色粉末（甲醇），C21H20O10；1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）：δ 0.78 （3H，d，J=6.0 Hz，H-6”），3.11（1H，t，J=9.2 Hz，H-4”），3.39（1H，m，H-5”），3.46（1H，dd，J=9.0，2.9 Hz，H-3”），3.98（1H，brs，H-2”），5.30（1H，s，H-1”），6.22（1H，s，H-6），6.42（1H，s，H-8），6.91（2H，d，J=8.7 Hz，H-3’，5’），7.77（2H，d，J=8.7 Hz，H-2’，6’）；13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）：δ 17.92（C-6”），70.52 （C-5”），70.77（C-4”），71.07（C-2”），71.55（C-3”），94.21（C-8），99.21（C-6），102.23（C-1”），104.52（C-10），115.84（C-3’，5’），120.95（C-1’），131.04（C-2’，6’），134.63（C-3），150.45（C-4’），156.95（C-2），157.66（C-9），161.72（C-5），164.82（C-7），178.14（C-4）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物3為阿福豆苷。

2.2 專屬性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)前期采用了DAD檢測(cè)器對(duì)這3個(gè)黃酮苷進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)其在波長(zhǎng)350 nm處吸收較好，故選擇波長(zhǎng)為350 nm。同時(shí)考察了甲醇-水、甲醇-0.1%乙酸、乙腈-水以及乙腈-0.1%乙酸等流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果表明添加乙酸的情況下，峰形無(wú)明顯變化；使用甲醇-水系統(tǒng)時(shí)，出峰時(shí)間較長(zhǎng)，若增大甲醇濃度則導(dǎo)致目標(biāo)峰與前面雜峰相連，分離度較低；使用乙腈-水系統(tǒng)時(shí)，出峰時(shí)間縮短且目標(biāo)峰周圍也無(wú)其他雜峰的干擾，峰的分辨率及分離度均較好，故選擇乙腈-水作為流動(dòng)相。

專屬性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，在上述選用的條件下，目標(biāo)峰與相鄰峰的分離度均大于1.5，表明各成分分離效果理想，且理論塔板數(shù)不低于3 000。

圖1 混合對(duì)照品和何首烏葉供試品色譜圖

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定結(jié)果

如表2所示，楊梅苷、槲皮苷和阿福豆苷分別在 25.00～ 400.00 μg/mL，6.25～ 200.00 μg/mL，6.25～200.00 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如表3所示，根據(jù)HPLC測(cè)得的楊梅苷、槲皮苷和阿福豆苷的峰面積，計(jì)算得出峰面積RSD分別為1.19%、0.96%、0.71%，表明該實(shí)驗(yàn)儀器精密度良好。

表3 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如表4所示，將HPLC測(cè)得的峰面積代入各成分標(biāo)準(zhǔn)曲線得到楊梅苷、槲皮苷和阿福豆苷的平均含量分別為9.447 mg/g、8.712 mg/g、5.160 mg/g，RSD分別為1.77%、1.02%、1.23%，表明本方法重復(fù)性良好。

表4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如表5所示，楊梅苷、槲皮苷和阿福豆苷峰面積的RSD分別為1.30%、1.31%、1.06%，表明供試品溶液中楊梅苷、槲皮苷和阿福豆苷在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如表6所示，楊梅苷、槲皮苷和阿福豆苷的加樣平均回收率分別為99.49%、97.29%、97.57%；RSD分別為1.26%、1.91%、1.88%，表明所建立的方法可行。

表6 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.8 樣品含量測(cè)定結(jié)果

不同采收期的樣品含量測(cè)定結(jié)果如表7所示，本次實(shí)驗(yàn)測(cè)得不同采收期的首烏葉中楊梅苷、槲皮苷及阿福豆苷含量分別為1.269～19.340 mg/g、1.068～16.840 mg/g、0.775～6.921 mg/g。不同采收期的首烏葉中的黃酮苷類含量差異較大，尤其是在清明節(jié)后（4月）采收的首烏葉中，其楊梅苷與槲皮苷含量相對(duì)較高，而6月份采收的首烏葉中楊梅苷、槲皮苷及阿福豆苷的含量均最低，且與其他月份差異明顯，這些差異可能和生長(zhǎng)期、日照時(shí)間及降雨量等因素有關(guān)。日照與降水會(huì)影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育與光合作用，從而影響其有機(jī)物及次生代謝產(chǎn)物等的生成與積累[15]。江西4月份氣溫及光照強(qiáng)度適中，且有一定的降雨量，可能更有利于黃酮類化合物的產(chǎn)生，而6月份日照強(qiáng)度高且多雨，這種高溫強(qiáng)光高濕的環(huán)境可能抑制了楊梅苷及槲皮苷等黃酮類次生代謝產(chǎn)物的生物合成及代謝通路，降低了該類產(chǎn)物的積累。8月份采收的何首烏葉中楊梅苷含量最高，槲皮苷和阿福豆苷含量相對(duì)較高，這可能與氣候、植物生長(zhǎng)環(huán)境等綜合因素影響有關(guān)。因此，建議在4月和8月進(jìn)行首烏葉的采收，以獲得更高黃酮含量的首烏葉。

表7 含量測(cè)定結(jié)果（單位：mg/g）

萹蓄和何首烏同屬蓼科植物，其楊梅苷含量為1.611～4.370 mg/g，槲皮苷含量為0.432～1.480 mg/g，均明顯低于首烏葉中的含量[16]。側(cè)柏葉中的黃酮類化合物為其主要成分，羅世恒等[17]采用HPLC法測(cè)定了不同采集期及不同產(chǎn)地側(cè)柏葉中楊梅苷和槲皮苷的含量，結(jié)果表明楊梅苷與槲皮苷的含量分別為0.587～1.420 mg/g和1.924～6.041 mg/g，也遠(yuǎn)低于其在首烏葉中的含量。這些研究均表明首烏葉中的黃酮類化合物含量較高，尤其是楊梅苷及槲皮苷的含量，同時(shí)楊梅苷與槲皮苷也有著較強(qiáng)的抗氧化及抗炎活性[5]。綜上，建議將楊梅苷與槲皮苷作為首烏葉質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分。

3 結(jié)論

本文考察了江西宜春地區(qū)不同月份的何首烏葉中楊梅苷、槲皮苷和阿福豆苷的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4月和8月楊梅苷、槲皮苷和阿福豆苷的含量相對(duì)較高，可集中進(jìn)行采收；此外，本實(shí)驗(yàn)首次從首烏葉中分離得到楊梅苷、槲皮苷及阿福豆苷3個(gè)黃酮苷，建立了HPLC法同時(shí)測(cè)定何首烏葉中楊梅苷、槲皮苷和阿福豆苷含量的方法，該方法操作簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性高、結(jié)果準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，可考慮用于首烏葉質(zhì)量檢測(cè)的方法。