左建宏， 黃佳璐， 謝卓熠

(南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所，湖南省衡陽市 421001)

新型冠狀病毒傳染病(corona virus disease 2019，COVID-19)是感染新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)，致肺部感染的一類傳染病[1-2]。該病于2019年暴發(fā)，造成了許多人員死亡和社會(huì)經(jīng)濟(jì)損失。為了應(yīng)對(duì)新型冠狀病毒傳染病疫情，人們迫切需要特效藥物和疫苗接種來預(yù)防或者治療新型冠狀病毒傳染病[3]。中國疫苗研發(fā)已經(jīng)站在了全球研發(fā)的第一梯隊(duì)。已經(jīng)批準(zhǔn)并生產(chǎn)的疫苗不但能夠完全供應(yīng)中國全部公民，還能供應(yīng)國外。中國實(shí)施有效的疫情防控和全民免費(fèi)接種疫苗的政策讓疫情得以控制。但是，隨著疫情在國外蔓延，以及許多國家出現(xiàn)新型冠狀病毒新變種。新型冠狀病毒傳染病疫情又有卷土重來的趨勢。

1 SARS-CoV-2

SARS-CoV-2與嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒、中東呼吸綜合征冠狀病毒同屬于β冠狀病毒屬，是一組RNA病毒，可導(dǎo)致致命的呼吸道感染[4]。SARS-CoV-2傳染性極強(qiáng)，不僅能夠通過動(dòng)物-人傳播，還能通過許多傳播媒介。SARS-CoV-2感染人后主要引起新型冠狀肺炎，導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)。

1.1 新型冠狀病毒結(jié)構(gòu)

SARS-CoV-2的基因組全長29 903 bp?；蚪M由14個(gè)開放閱讀框(open reading frames，ORF)組成，編碼27個(gè)蛋白質(zhì)。從5′端到3′端的第一個(gè)ORF區(qū)域包含ORF1a和ORF1b兩個(gè)區(qū)域，這兩個(gè)區(qū)域占整個(gè)基因組約70%，編碼14個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。后面基因組共編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白：編碼刺突糖蛋白(spike protein，S)、編碼包膜蛋白(envelope protein，E)、編碼膜蛋白(membrane protein，M)和編碼核衣殼蛋白(nucleocapsid protein，N)。在結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)中還存在著其他非結(jié)構(gòu)蛋白甚至未知蛋白。

S是SARS-CoV-2最主要的結(jié)構(gòu)蛋白之一，為同型三聚體Ⅰ類融合蛋白，以倒三角的形式凸起在SARS-CoV-2包膜表面，是SARS-CoV-2的最外端結(jié)構(gòu)。許多S蛋白凸起在電鏡下觀察猶如花冠，所以根據(jù)SARS-CoV-2的形態(tài)特點(diǎn)起名為“冠狀病毒”。S蛋白能夠與宿主細(xì)胞的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2受體結(jié)合并介導(dǎo)病毒融合與入侵，整個(gè)過程S蛋白經(jīng)過了結(jié)構(gòu)重排。S蛋白分成兩個(gè)功能不同的部分即S1亞基和S2亞基。S1包含受體結(jié)合域(receptor binding domain，RBD)，特異性地與宿主細(xì)胞受體結(jié)合，從而決定病毒的細(xì)胞性和致病性[5]。S1亞單位是SARS-CoV-2疫苗研發(fā)的首選抗原選擇區(qū)。由中國科學(xué)院微生物所與安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司生產(chǎn)的重組亞單位疫苗就是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)生產(chǎn)病毒S1上的RBD結(jié)構(gòu)域作為抗原；由陳薇院士帶領(lǐng)的團(tuán)隊(duì)與康希諾生物股份公司生產(chǎn)的腺病毒載體(adenovirus type-5 vectored，AD5)疫苗也是以S1上的RBD序列作為抗原[6-8]。S2是跨膜結(jié)構(gòu)，包含七肽重復(fù)區(qū)和融合肽，介導(dǎo)病毒和細(xì)胞膜的廣泛構(gòu)象重排的融合[9]。S2亞基單獨(dú)作為疫苗抗原比較少，可能與其位于S蛋白的近包膜端有關(guān)。

N是一種磷酸化蛋白，位于SARS-CoV-2病毒粒的核心部分，與RNA形成核衣殼結(jié)構(gòu)[10]。N蛋白比較大，抗原表位多，是N蛋白作為疫苗抗原的優(yōu)勢。但是N蛋白藏于核心，并不暴露在包膜外。機(jī)體產(chǎn)生的抗N抗體并不能特異性結(jié)合完整的SARS-CoV-2病毒粒。所以N蛋白作為疫苗抗原的研發(fā)次于S蛋白。一項(xiàng)S蛋白與N蛋白共同作為抗原的疫苗正在開發(fā)，N蛋白上的抗原表位可能成為S蛋白的補(bǔ)充抗原表位用來提高疫苗效果[11]。

E和M相對(duì)分子質(zhì)量小，通常很少作為疫苗抗原的選擇。M是SARS-CoV-2病毒包膜的基質(zhì)蛋白，通過與其他病毒蛋白的相互作用，在SARS-CoV-2的形態(tài)發(fā)生變化和組裝中起核心作用。E蛋白保守性較高，作為應(yīng)對(duì)SARS-CoV-2高突變的補(bǔ)充抗原或研發(fā)疫苗增強(qiáng)劑有著不錯(cuò)的前景。E蛋白能夠整合到宿主細(xì)胞形成離子通道，這可能有利于免疫系統(tǒng)識(shí)別并清除已經(jīng)被病毒入侵的細(xì)胞。Xia等[12]發(fā)現(xiàn)，E蛋白能夠在體外和體內(nèi)引起ARDS樣損傷。所以，在考慮以E蛋白為抗原設(shè)計(jì)疫苗時(shí)應(yīng)該注意如何提高E蛋白疫苗的安全性。

1.2 新型冠狀病毒的變異

新型冠狀病毒容易突變，以德爾塔、奧密克戎變異株為主[13]。其中德爾塔變異株S蛋白上顯示有7個(gè)突變(E156G、D614G、P681R、T19R、T478K、L482R、D950N)和1個(gè)缺失(del157/158)，在N蛋白上4個(gè)突變(R203M、D377Y、D63G、G215C)；M蛋白有1個(gè)突變(I82T)；E蛋白沒有。奧密克戎變異株在S蛋白上有27個(gè)突變(G142D、N211I、S371L、D614G、H655Y、N678K、P681H、N969K、Q954H、D796Y、T547K、L981F、N856K、A67V、G339D、T95I、Q493R、T478K、S477N、E484A、N501Y、Y505H、Q498R、S375F、S373P、N764K、G496S)和3個(gè)缺失(del67/70、del143/145、del212/212)；N蛋白上有3個(gè)突變(R203K、G204R、P13L)和1個(gè)缺失(del31/33)；M蛋白上有3個(gè)突變(A63T、Q19E、D3G)；E蛋白上有1個(gè)突變(T9I)。這些僅僅是傳染性強(qiáng)的SARS-CoV-2突變株。綜合其他SARS-CoV-2突變株，所有結(jié)構(gòu)蛋白中S蛋白上的突變位點(diǎn)最多，這可能造成S蛋白抗原表位改變，導(dǎo)致疫苗無效。其他結(jié)構(gòu)蛋白，如M蛋白和E蛋白具有高保守性，在應(yīng)對(duì)SARS-CoV-2變異株產(chǎn)生時(shí)，可作為一個(gè)補(bǔ)充抗原進(jìn)行疫苗加強(qiáng)針接種。

2 新型冠狀病毒疫苗

目前，SARS-CoV-2疫苗已經(jīng)開發(fā)了300多種，其中142種正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，195種也開展了臨床前研究。這些疫苗開發(fā)時(shí)間短、采用技術(shù)先進(jìn)，但是生產(chǎn)線的不足導(dǎo)致疫苗全球供應(yīng)仍然不足(特別是貧困國家)。并且一些已經(jīng)批準(zhǔn)生產(chǎn)的疫苗雖然通過了臨床試驗(yàn)，但是長期的潛在危險(xiǎn)性尚未可知。SARS-CoV-2疫苗可以分為滅活疫苗、減毒活疫苗、病毒載體疫苗、重組亞單位疫苗、核酸疫苗和納米疫苗。

滅活疫苗由于技術(shù)成熟，在SARS-CoV-2疫苗中是最先開發(fā)并且獲得生產(chǎn)批準(zhǔn)。該疫苗是用化學(xué)應(yīng)激或熱應(yīng)激制備的，在熱應(yīng)激或化學(xué)應(yīng)激過程中滅活疫苗可能會(huì)失去免疫原性，因此這些疫苗往往需要與佐劑混合。迄今為止，世界衛(wèi)生組織共記錄了32種SARS-CoV-2滅活疫苗，其中21種進(jìn)入了臨床試驗(yàn)。

減毒活疫苗是通過去除或減毒部分病毒而制成的疫苗。該疫苗具有適當(dāng)?shù)拿庖咴?，但需要較長時(shí)間才能構(gòu)建出合適的減毒毒株，且構(gòu)建的毒株隨時(shí)可能發(fā)生毒力逆轉(zhuǎn)。該疫苗技術(shù)也較為成熟，比較常見麻疹、甲型肝炎、凍干甲肝、凍干水痘、乙型腦炎、風(fēng)疹、腮腺炎、口服脊髓灰質(zhì)炎、口服狂犬病減毒活疫苗等。減毒活疫苗還是口服疫苗接種常用的疫苗類型。世界衛(wèi)生組織記錄在案的減毒活疫苗只有6種。在這6種疫苗中，有2種疫苗已進(jìn)入臨床試驗(yàn)。由于開發(fā)周期較長，減毒活疫苗并不是應(yīng)對(duì)COVID-19疫情突發(fā)的首選疫苗。滅活疫苗和減毒活疫苗是SARS-CoV-2全結(jié)構(gòu)疫苗，擁有多個(gè)表位，可能在宿主體內(nèi)誘導(dǎo)多種免疫應(yīng)答，同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生非中和抗體。非中和抗體對(duì)SARS-CoV-2沒有中和能力，甚至?xí)蓴_中和抗體中和SARS-CoV-2。

安全的病毒載體(腺病毒、HIV等)通過病毒載體進(jìn)入宿主體內(nèi)。病毒載體容易進(jìn)入宿主體內(nèi)，引起宿主較強(qiáng)的免疫反應(yīng)和交叉反應(yīng)。WHO記錄了72種基于病毒載體的疫苗。28種基于病毒載體的疫苗已進(jìn)入臨床試驗(yàn)。但基于病毒載體的疫苗需要考慮載體免疫可能對(duì)疫苗的效力(主要基于所選的載體)產(chǎn)生不良影響[14]。

重組亞單位疫苗是挑選某個(gè)蛋白或者蛋白的部分序列表達(dá)出蛋白作為疫苗抗原，從而可以剔除部分免疫效果較差的SARS-CoV-2抗原表位，提高SARS-CoV-2的抗原表位利用效率，需要與佐劑一起使用[15-17]。世界衛(wèi)生組織記錄了123種重組亞單位疫苗。48種疫苗已進(jìn)入臨床試驗(yàn)。

核酸疫苗是通過將基因整合到接種者自身細(xì)胞中，通過接種者細(xì)胞來表達(dá)抗原。根據(jù)核酸種類不同分為DNA疫苗和RNA疫苗。DNA疫苗是利用DNA質(zhì)粒作為載體，將其基因或片段編碼的免疫抗原傳遞給宿主細(xì)胞。這種疫苗可以有效地刺激機(jī)體產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答[18]。世界衛(wèi)生組織記錄了32種DNA疫苗正在研發(fā)，其中16種已經(jīng)納入臨床試驗(yàn)。RNA疫苗主要為mRNA疫苗，它刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的原理和DNA疫苗類似。只是mRNA無需整合進(jìn)入宿主細(xì)胞，安全性更高；DNA疫苗整合進(jìn)入宿主基因組，接種后宿主血清中的抗體存在更加長久。世界衛(wèi)生組織記錄了47種RNA疫苗正在研發(fā)，其中23種已經(jīng)納入臨床試驗(yàn)。

納米疫苗是近年來新興的一類疫苗，特別是在腫瘤疫苗研發(fā)中非常常見。納米疫苗是將抗原與納米粒子組裝或包被或包裹的一種納米遞送形式。根據(jù)疫苗需求，設(shè)計(jì)者通過不同功能的納米載體來實(shí)現(xiàn)納米遞送。

3 納米遞送載體

納米遞送載體主要是各種納米粒(nanoparticles，NPs)。根據(jù)抗原遞送需求，NPs可以作為囊狀包裹抗原達(dá)到抗原的保護(hù)，可以作為一個(gè)載體聚集抗原提高免疫原性。一些NPs還具有延緩釋放、防止抗原降解的功能，甚至一些NPs是一種高效的納米佐劑[19-20]。NPs有多糖NPs、多聚NPs、無機(jī)NPs、脂質(zhì)體NPs、蛋白質(zhì)NPs類型等[21]。不同功能NPs相互組合形成多功能復(fù)合體以達(dá)到疫苗接種的最大效率。一些納米遞送載體已經(jīng)在SARS-CoV-2疫苗研發(fā)中使用，并且產(chǎn)生了很好的效果。美國國家過敏癥和傳染病研究所研發(fā)的一種以脂質(zhì)納米粒為載體的mRNA疫苗已經(jīng)進(jìn)入了臨床試驗(yàn)(第四期，ID：NCT04878211)，還有其他許多SARS-CoV-2納米疫苗正在研發(fā)[22-26]。

4 仿生納米疫苗

仿生納米疫苗是納米疫苗發(fā)展的一種更具有優(yōu)勢、更加復(fù)雜的納米疫苗類型，是通過模仿病原體的功能、形狀或者行為研發(fā)的疫苗。仿生納米疫苗與腫瘤治療中的仿生給藥系統(tǒng)不同。在腫瘤治療中，仿生納米遞藥系統(tǒng)是制作細(xì)胞膜涂層來降低或消除免疫系統(tǒng)對(duì)納米疫苗的捕獲，通過模擬宿主自身抗原介導(dǎo)免疫耐受，從而達(dá)到提高藥物遞送效率的目的[27]。而傳染病中的仿生納米藥物遞送系統(tǒng)或仿生納米疫苗主要是模擬病原體增強(qiáng)宿主免疫系統(tǒng)功能。Zheng等[25]報(bào)告了一種針對(duì)新型冠狀病毒的仿生納米疫苗，擁有SARS-CoV-2的形狀、大小和部分功能。這種疫苗由模擬SARS-CoV-2遺傳物質(zhì)的poly(I:C)作為佐劑、作為病毒衣殼結(jié)構(gòu)的仿生肺表面活性劑脂質(zhì)體和SARS-CoV-2的RBD組成，并且該疫苗比常規(guī)的納米疫苗產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫保護(hù)[25]。

5 總結(jié)與展望

COVID-19疫情持續(xù)暴發(fā)?？茖W(xué)家們通過不斷努力，迅速解析了SARS-CoV-2的生物屬性，并且開發(fā)不同的疫苗來應(yīng)對(duì)疫情。然而，SARS-CoV-2不斷突變，由其變體引發(fā)的二次暴發(fā)在許多國家發(fā)生。納米疫苗具有多功能自由組合、可控性、安全性等特點(diǎn)，已經(jīng)被開發(fā)甚至已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)。在納米疫苗中，仿生納米疫苗根據(jù)SARS-CoV-2的生物屬性，模擬SARS-CoV-2的大小形狀、生物功能等特點(diǎn)似乎比常規(guī)的納米疫苗更能保護(hù)宿主抵抗SARS-CoV-2。

綜上所述，仿生納米疫苗在SARS-CoV-2疫苗研發(fā)中擁有良好的應(yīng)用前景。