王浩然 廖 軼 姚 嬌 趙德明 周向梅

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

丁酸鈉(sodium butyrate；NaB)呈白色、具有腐敗的臭味。與水混溶，易溶于有機(jī)溶劑，由于丁酸易揮發(fā)的性質(zhì)，在動(dòng)物飼料中添加丁酸鈉是最經(jīng)濟(jì)有效的方法[1]。機(jī)體可以從腸道菌群作用下發(fā)酵膳食纖維來(lái)產(chǎn)生丁酸。研究發(fā)現(xiàn)給幼齡反芻動(dòng)物飼喂丁酸鈉可以很好地促進(jìn)瘤胃乳頭的生長(zhǎng)，丁酸還能提供結(jié)腸上皮細(xì)胞能量，有助于組織的修復(fù)和發(fā)育[2]。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡方式之一，細(xì)胞凋亡是一種主動(dòng)的死亡過(guò)程，受一系列基因激活、表達(dá)和調(diào)控的影響，細(xì)胞凋亡參與機(jī)體內(nèi)細(xì)胞數(shù)量的調(diào)節(jié)，并清除體內(nèi)無(wú)功能、損傷、有害的細(xì)胞，在機(jī)體的穩(wěn)態(tài)和發(fā)育過(guò)程中起到重要的作用。細(xì)胞凋亡主要由三條通路引起，分別為線粒體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路和死亡受體通路[3]。

丁酸鈉處理的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型主要由炎性反應(yīng)、腫瘤以及營(yíng)養(yǎng)代謝組成。此類動(dòng)物模型對(duì)不同疾病的機(jī)制研究起到了重要的作用[4]。本文梳理了丁酸鈉影響細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制，比較了丁酸鈉在不同實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中的作用，討論了丁酸鈉在不同細(xì)胞系以及動(dòng)物模型中的作用差異，旨在為闡明丁酸鈉在疾病治療中的重要作用。

1 丁酸鈉對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

丁酸鈉作為一種組蛋白去乙?；?histone deacetylase,HDAC)抑制劑，具有調(diào)控細(xì)胞凋亡的能力?，F(xiàn)有的研究證明，丁酸可直接作用于凋亡通路或凋亡相關(guān)蛋白起到調(diào)節(jié)作用。

1.1 丁酸鈉激活死亡受體通路誘導(dǎo)凋亡

丁酸鈉通過(guò)增加腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體(TNF related apoptosis inducing ligand,TRAIL)的表達(dá)從而介導(dǎo)凋亡[5]。TRAIL是腫瘤壞死因子(TNF)家族中的成員，TRAIL能和死亡受體(death receptor 4,5, DR4、DR5)相結(jié)合誘導(dǎo)包括結(jié)腸癌細(xì)胞的死亡。丁酸可增強(qiáng)人結(jié)腸癌細(xì)胞(HT-29和HCT-116)對(duì)TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的靈敏度。丁酸鈉激活許多的轉(zhuǎn)錄基因都涉及到SP1位點(diǎn)[6]，例如丁酸鈉可以激活重組人半乳糖凝集素1基因(Galectin-1)、線粒體HMGCoA合成酶基因和p21Waf1基因啟動(dòng)子的Sp1位點(diǎn)。正常情況下HDAC會(huì)和DR5基因的轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)SP1結(jié)合，當(dāng)外源添加丁酸鈉時(shí)可以阻斷HADC與SP1的結(jié)合，SP1激活DR5的表達(dá)，DR5和TRAIL結(jié)合后活化caspase-8進(jìn)而激活caspase-3、7誘導(dǎo)凋亡的產(chǎn)生，當(dāng)然這種情況是DR5獨(dú)立發(fā)生的與DR4無(wú)關(guān)[7](圖1)。此外，丁酸鈉處理8個(gè)結(jié)腸癌細(xì)胞系后增強(qiáng)了其中的7個(gè)細(xì)胞系Fas依賴的凋亡。但丁酸鈉并不增加Fas受體的表達(dá)，對(duì)于TNF-α和IFN-γ聯(lián)合用藥介導(dǎo)的凋亡，丁酸鈉處理后會(huì)增強(qiáng)這種凋亡，但并不是調(diào)控FADD/Mort1適配子的水平而是增加它的敏感性，因此丁酸鈉作為一種毒性低、可以增強(qiáng)癌癥細(xì)胞內(nèi)Fas傳遞信號(hào)的藥物，可能具有治療意義。

1.2 丁酸鈉激活線粒體通路誘導(dǎo)凋亡

丁酸鈉可以通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這個(gè)機(jī)制可能與HDAC抑制劑會(huì)促進(jìn)凋亡蛋白的表達(dá)或減少抗凋亡蛋白的產(chǎn)生有關(guān)[8]。同時(shí)各種HDAC抑制劑能刺激活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生，而抗氧化劑治療會(huì)降低它們的抗癌活性。雖然ROS產(chǎn)生的最初來(lái)源仍不清楚，但氧化應(yīng)激可能在HDAC抑制劑誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞死亡中發(fā)揮重要作用，氧化應(yīng)激可能激活線粒體通路激活細(xì)胞凋亡[9]。

丁酸鈉可通過(guò)調(diào)節(jié)肝細(xì)胞中的miRNA-22進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。miRNA-22在肝癌細(xì)胞或其他癌細(xì)胞中均有下調(diào)，miRNA-22的下調(diào)對(duì)腫瘤的增殖、分化有一定的影響。SIRT1在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)量很高，SIRT1的表達(dá)可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的抗氧化劑(SOD)使細(xì)胞產(chǎn)生的ROS維持在一個(gè)平衡的水平[10]。丁酸鈉處理肝癌細(xì)胞后會(huì)上調(diào)miRNA-22的表達(dá)同時(shí)靶向抑制SIRT1，SIRT1的抑制會(huì)影響抗氧化劑SOD的下調(diào)從而產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)造成線粒體的損傷，Bcl-2含量下降激活內(nèi)源性凋亡通路，線粒體釋放細(xì)胞色素C引發(fā)下游caspase-9的表達(dá)最后活化caspase-3從而促進(jìn)凋亡的產(chǎn)生[11]。

丁酸鈉和派立福辛(perifosine，Per)聯(lián)用可誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡。Per就是烷基溶血磷脂的一種；烷基溶血磷脂是一類新型的抗腫瘤藥物，可靶向細(xì)胞膜誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而不影響正常細(xì)胞。Rahmani等人研究發(fā)現(xiàn)[12]丁酸鈉和Per聯(lián)用可以誘導(dǎo)U937、HL-60和jurkat白血病細(xì)胞的線粒體損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞色素C和凋亡因子的釋放、caspase-3/8的升高，顯著抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，此外Nab和Per聯(lián)合處理后還發(fā)現(xiàn)促凋亡蛋白Bax從胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)移到線粒體上，同時(shí)過(guò)表達(dá)Bcl-2會(huì)延緩Nab+Per所介導(dǎo)的凋亡。這意味著Nab和Per促進(jìn)U937細(xì)胞的凋亡是通過(guò)激活線粒體通路而發(fā)生的。以上這些現(xiàn)象的機(jī)制與信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)通路和AKT通路的失活、JNK的激活、神經(jīng)酰胺和活性氧(ROS)的增加有關(guān)，但JNK的激活并不起主導(dǎo)作用，同時(shí)神經(jīng)酰胺的產(chǎn)生需要ERK1和AKT通路的失活介導(dǎo)。

膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源物1(glioma-associated oncogene homolog,GiL1)是Gil家族中具有激活功能的主要轉(zhuǎn)錄因子，在多種腫瘤細(xì)胞中存在著Gil1的過(guò)表達(dá)，且GiL1的過(guò)表達(dá)可以顯著促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞(A549)的增殖并抑制細(xì)胞凋亡。通過(guò)體內(nèi)外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[13]丁酸鈉和多西他賽可以抑制Gil1的表達(dá)并上調(diào)BaX 、p21、Cyclin A、cleaved-caspase3表達(dá)，同時(shí)下調(diào)CDK1、CDK2、Bcl-2、Ki-67的表達(dá)，進(jìn)一步抑制下游的細(xì)胞凋亡，這種情況在丁酸鈉和多西他賽聯(lián)合處理時(shí)更加顯著。這提示丁酸鈉單獨(dú)用藥抑制癌細(xì)胞增殖、并促進(jìn)凋亡或提高多西他賽藥物的敏感度是治療肺腺癌的潛藏機(jī)制之一。雖然試驗(yàn)結(jié)果未能直接證明丁酸鈉激活線粒體通路,但是Bax作為促凋亡的主要蛋白,其機(jī)制就是改變線粒體膜通透性釋放細(xì)胞色素C，所以丁酸鈉促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞凋亡機(jī)制可能與線粒體通路有關(guān)，這為治療肺腺癌提供了新的思路。

MicroRNA(miRNA)可通過(guò)抑制mRNAs的翻譯并降解其活性成為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)，近年來(lái)有研究證明miR-139-5p的大量表達(dá)會(huì)影響腫瘤患者的預(yù)后效果，在膀胱癌細(xì)胞中的miR-139-5p表達(dá)量很低并且靶向調(diào)控Bmi-1可以起到抑制腫瘤的作用[14]。Bmi-1是PcG家族中的成員，在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤的侵襲、發(fā)展、預(yù)后有關(guān)[15]。丁酸鈉處理膀胱癌細(xì)胞(T24和5637細(xì)胞)后會(huì)上調(diào)miR-139-5p的表達(dá)量，進(jìn)而抑制下游Bmi-1的表達(dá)。Bmi-1的下調(diào)一方面可以抑制腫瘤細(xì)胞的遷移，另一方面還能造成線粒體膜的損傷產(chǎn)生過(guò)量的活性氧(ROS)，上調(diào)了caspase-3和PARP(凋亡標(biāo)志物)的表達(dá)，抑制了Bcl-2的活性從而促進(jìn)凋亡的產(chǎn)生；有趣的是，這種線粒體損傷同時(shí)也激活依賴AMPK- mTOR的自噬反應(yīng)，當(dāng)把這種自噬抑制后發(fā)現(xiàn)凋亡被抑制了；丁酸鈉產(chǎn)生通過(guò)破壞線粒體膜產(chǎn)生過(guò)多的ROS來(lái)誘導(dǎo)凋亡；同時(shí)膀胱癌細(xì)胞中丁酸鈉誘導(dǎo)的自噬抑制后會(huì)影響凋亡，這表明自噬也能調(diào)節(jié)凋亡[16]。此外丁酸鈉處理神經(jīng)瘤細(xì)胞后可以打開(kāi)細(xì)胞的線粒體通透性的暫態(tài)孔隙(MPTP)造成質(zhì)子泄露，造成線粒體膜電位損傷誘導(dǎo)了凋亡的產(chǎn)生[17]。

1.3 丁酸鈉激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡

丁酸鈉可通過(guò)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)廣泛存在于真核細(xì)胞當(dāng)中是合成和加工蛋白質(zhì)的主要場(chǎng)所，同時(shí)也是Ca2+貯存的主要場(chǎng)所，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路介導(dǎo)的凋亡主要是由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ER-stress)引起的，當(dāng)錯(cuò)誤折疊蛋白和未折疊蛋白過(guò)多積累時(shí)，細(xì)胞激活未折疊蛋白反應(yīng)(unfold protein reponse，UPR)可以誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下游的反應(yīng)[18]。雖然丁酸鈉對(duì)于調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的研究相對(duì)較少，但有研究用丁酸鈉處理慢粒白血病細(xì)胞株K562和阿霉素耐藥的K562后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡率顯著上升，進(jìn)一步研究中發(fā)現(xiàn)丁酸鈉處理后的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白BIP顯著增加，這提示NaB誘導(dǎo)的K562細(xì)胞凋亡可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)[19]。

2 影響丁酸鈉誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因素

2.1 細(xì)胞系影響丁酸誘導(dǎo)的凋亡

丁酸鈉作用于不同細(xì)胞系會(huì)產(chǎn)生不同的效果。例如Mandal的研究證明了丁酸鈉處理乳腺癌細(xì)胞后會(huì)下調(diào)Bcl-2的表達(dá)從而促進(jìn)乳腺細(xì)胞的凋亡。NaB處理感染牛結(jié)核分枝桿菌(M.bovis)的THP-1細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，Bcl-2的表達(dá)下調(diào)，從而誘導(dǎo)高水平的凋亡[20]。然而，丁酸鈉處理大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型細(xì)胞后可通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路，減輕MCAO后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[21]。LPS處理過(guò)的牛乳腺上皮細(xì)胞會(huì)誘導(dǎo)高水平的細(xì)胞凋亡，但使用NaB處理這類細(xì)胞后可以上調(diào)PI3K/AKT信號(hào)通路，降低caspase-3 等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)[22]。前文中所提到的Nab和per聯(lián)用處理白血病細(xì)胞會(huì)上調(diào)caspase-8、caspase-3和細(xì)胞色素C的表達(dá)量，但單獨(dú)使用Nab處理細(xì)胞后，細(xì)胞色素C的含量并沒(méi)有變化。這可能由于NaB并非直接影響白血病細(xì)胞釋放cytC，而是通過(guò)上調(diào)促凋亡蛋白Bak和Bid。這可能和之前的試驗(yàn)結(jié)論有所出入，這種現(xiàn)象的原因可能是試驗(yàn)過(guò)程中所用的細(xì)胞系不同，例如在做丁酸鈉影響人類肝癌細(xì)胞系HCC-T和HCC-M研究時(shí)，這種細(xì)胞系會(huì)產(chǎn)生大量的Bcl-2，可能會(huì)影響丁酸鈉處理后的結(jié)果，此外腫瘤細(xì)胞系和正常細(xì)胞系也有較大的差異，總結(jié)發(fā)現(xiàn)丁酸鈉處理腫瘤細(xì)胞系后往往會(huì)促進(jìn)凋亡的產(chǎn)生，但對(duì)于丁酸處理一些致病菌感染或機(jī)能缺陷的正常細(xì)胞系時(shí)，細(xì)胞凋亡的水平表現(xiàn)出較大差異。

2.2 丁酸鈉濃度影響丁酸鈉誘導(dǎo)的凋亡

Zhang等人[23]的研究中表示丁酸鹽在低劑量(2 mmol/L)時(shí)誘導(dǎo)HCT-116細(xì)胞自噬，在高劑量(5 mmol/L)時(shí)自噬水平相對(duì)較低，但高劑量處理過(guò)的細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白上調(diào)較大，誘導(dǎo)了高水平的細(xì)胞凋亡。使用高劑量的丁酸鈉處理乳腺癌細(xì)胞MCF-7后會(huì)誘導(dǎo)高水平的凋亡，而中劑量處理時(shí)凋亡的產(chǎn)生相對(duì)較小[24]。綜上可知，不同濃度的丁酸鈉處理后的細(xì)胞可能誘導(dǎo)不同的反應(yīng)。

即便等濃度丁酸鈉處理細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的準(zhǔn)確濃度也無(wú)法判定，這種現(xiàn)象可歸因于，線粒體通過(guò)β氧化可以快速的代謝丁酸。因此代謝丁酸速率快的細(xì)胞可能不太容易受到其誘導(dǎo)凋亡的影響，這解釋了依賴丁酸為主要能源的結(jié)腸細(xì)胞不會(huì)受到高濃度丁酸的影響。在進(jìn)行小鼠實(shí)驗(yàn)時(shí)往往將丁酸鈉的血漿濃度定在10 mmol/L，雖然有些實(shí)驗(yàn)證明口服給藥可以達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的血漿濃度，但都是通過(guò)灌胃的方法操作的，某些試驗(yàn)將丁酸鈉和食物混雜在一起給藥是無(wú)效的，因?yàn)閯?dòng)物采食過(guò)程中可能會(huì)忽略丁酸鈉顆粒造成同組動(dòng)物中丁酸鈉血漿濃度有很大差異，這都會(huì)影響最后凋亡的強(qiáng)弱。此外與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相比，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)往往需要更高濃度的丁酸鈉,這可能是與首過(guò)效應(yīng)(first pass effect)有關(guān)。所有口服藥物的吸收需要通過(guò)胃腸壁，然后進(jìn)入門(mén)靜脈，這種反應(yīng)造成藥物的代謝增強(qiáng)、吸收減少，治療效果下降。

3 丁酸鈉對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的影響

越來(lái)越多的研究表明丁酸鈉可以改變實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的生理狀態(tài)。有研究表明[25]丁酸鈉處理慢加急性肝衰竭的小鼠模型可降低小鼠血清中炎性因子HMGB1、TNF-α、IL-18均顯著下調(diào)，進(jìn)而對(duì)小鼠模型起到保護(hù)作用。此外丁酸鈉與小檗堿聯(lián)合應(yīng)用可對(duì)高脂飲食引起的C57BL/6J小鼠非酒精性脂肪性肝病起到緩解作用。提取自中藥的小檗堿長(zhǎng)期以來(lái)一直用于腹瀉的治療，近年來(lái)，也被用于臨床治療高脂血癥。丁酸鈉和小檗堿聯(lián)合應(yīng)用可激活肝臟AMP依賴的蛋白激酶通路：脂肪合成基因的表達(dá)明顯減少,而脂肪分解基因的表達(dá)明顯上調(diào),同時(shí)出現(xiàn)肝臟炎性因子表達(dá)減少。

丁酸鈉在慢性肺部疾病起到一定的積極作用。研究證明[20]丁酸鈉處理牛結(jié)核病小鼠模型后可顯著減少小鼠肺臟的炎性灶，增加IL-1β的分泌，進(jìn)而緩解牛分枝桿菌引起的感染。

丁酸鈉在大鼠心肌缺血性損傷模型中表現(xiàn)出積極影響。有研究發(fā)現(xiàn)[26]丁酸鈉降低心肌缺血大鼠梗死面積,對(duì)大鼠急性心肌缺血性損傷有保護(hù)作用。其具體機(jī)制為丁酸鈉能夠上調(diào)pkm2的表達(dá),增強(qiáng)其活性,增加ATP的含量。Pkm2在心肌能量代謝和腫瘤的研究方面起到重要的作用，這提示丁酸納對(duì)腫瘤動(dòng)物模型也具有調(diào)控作用。也有研究發(fā)現(xiàn)丁酸鈉處理黑色素瘤荷瘤的小鼠模型可以通過(guò)抑制腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的分化、增殖以及下調(diào)促瘤巨噬細(xì)胞因子而抑制小鼠腫瘤細(xì)胞的增長(zhǎng)[27]。綜上所述，丁酸鈉在多種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型上起到一定的干預(yù)作用，為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的發(fā)展提供理論依據(jù)。

4 總結(jié)和展望

丁酸鈉不僅具有改善腸道菌群穩(wěn)態(tài)、抗感染、抗氧化等生物學(xué)功能還是HDACi中的一種。丁酸鈉主要通過(guò)影響線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及死亡受體通路來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(圖2)。細(xì)胞凋亡在腫瘤等疾病的發(fā)生和發(fā)展具有重要作用；因此闡明丁酸鈉對(duì)細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制，對(duì)于腫瘤及相關(guān)疾病的治療與預(yù)防具有重要意義。丁酸鈉還可以通過(guò)調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物機(jī)體細(xì)胞因子的分泌及相關(guān)基因的表達(dá)影響疾病的發(fā)生和發(fā)展。當(dāng)然丁酸鈉的作用也遠(yuǎn)不止于此。未來(lái)的研究方向可以探究丁酸鈉作為輔助藥物提升抗腫瘤藥物效果的分子機(jī)制，以及構(gòu)建更多的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，為醫(yī)用丁酸鈉提供理論依據(jù)。