李建香 王君君 黃天馬 張子健 過(guò)偉峰

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院，南京 210022)(2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 210023)

隨著微生態(tài)學(xué)的發(fā)展，無(wú)菌動(dòng)物開始廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和藥學(xué)領(lǐng)域。制作公認(rèn)的無(wú)菌動(dòng)物模型是進(jìn)行各項(xiàng)研究的基礎(chǔ)。無(wú)菌動(dòng)物特別是無(wú)菌大鼠、小鼠的成功培育技術(shù)成為研究微生物與人類生命現(xiàn)象(健康、疾病)關(guān)系的關(guān)鍵技術(shù)[1-2]。由于無(wú)菌動(dòng)物具有早期生長(zhǎng)緩慢、性成熟晚、產(chǎn)仔量少且成活率高、壽命較長(zhǎng)、免疫系統(tǒng)發(fā)育不良、消化功能差和抗輻射能力強(qiáng)等特點(diǎn)，其在微生物寄生蟲學(xué)、免疫代謝學(xué)、營(yíng)養(yǎng)學(xué)、老年學(xué)、腫瘤學(xué)、消化學(xué)、神經(jīng)精神學(xué)、放射醫(yī)學(xué)、毒理和藥理學(xué)等研究中發(fā)揮舉足輕重的作用[3-5]。

嚴(yán)格的無(wú)菌動(dòng)物指在動(dòng)物體宿主內(nèi)外任何部位及生活環(huán)境中均檢測(cè)不出任何細(xì)菌、病毒、真菌及寄生蟲的動(dòng)物。廣義的無(wú)菌動(dòng)物還包括清除腸道中大部分菌群的動(dòng)物，又稱為偽無(wú)菌動(dòng)物。目前制作無(wú)菌鼠的方法主要有：剖腹取胎無(wú)菌飼養(yǎng)法制作無(wú)菌(germ-free, GF)鼠模型，抗生素雞尾酒法制作偽無(wú)菌(pseudo germ-free, PGF)鼠模型。本文對(duì)無(wú)菌鼠模型制作方法進(jìn)行歸納總結(jié)與評(píng)價(jià)，以期為科學(xué)研究和推廣應(yīng)用提供參考。

1 剖腹取胎無(wú)菌飼養(yǎng)法制作無(wú)菌鼠模型

通常認(rèn)為哺乳動(dòng)物在母體子宮內(nèi)處于相對(duì)無(wú)菌狀態(tài)。對(duì)無(wú)特定病原體(specific pathogen free, SPF)大鼠、小鼠進(jìn)行剖腹取胎凈化，采用無(wú)菌飼養(yǎng)方法培育于無(wú)菌隔離器，經(jīng)人工飼育建立無(wú)菌鼠群[6-11]。

1.1 判斷孕鼠分娩日期

母鼠達(dá)到體成熟進(jìn)行交配，通過(guò)陰道栓判斷母鼠受孕成功，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)或者以提前交配的同種鼠的孕產(chǎn)期為依據(jù)，推斷受孕母鼠的分娩日期。一般于見栓后20.5 d進(jìn)行剖宮取胎手術(shù)，剖得仔鼠成活率最高[12]。

1.2 進(jìn)行剖宮取胎手術(shù)

器材及物品進(jìn)行消毒與滅菌，通過(guò)頸椎脫臼法處死母鼠，充分消毒，按照無(wú)菌原則行剖腹產(chǎn)術(shù)。為避免污染仔鼠，在切取子宮前結(jié)扎兩側(cè)輸卵管及宮頸底部，完整分離子宮，避免損傷子宮囊。

1.3 隔離器中剖取仔鼠

將子宮囊充分消毒，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌隔離器內(nèi)。所有物品徹底滅菌并檢測(cè)合格后轉(zhuǎn)入隔離器，進(jìn)行無(wú)菌操作，剪開子宮壁，分離胎盤，剪斷臍帶，取出仔鼠，及時(shí)擦拭清理仔鼠口鼻異物，刺激仔鼠促其自主呼吸。

1.4 無(wú)菌環(huán)境飼養(yǎng)仔鼠

剖得仔鼠后采取人工灌胃哺乳法或者無(wú)菌代乳鼠喂養(yǎng)，按無(wú)菌操作程序進(jìn)行樣品接種前制備和接種。在無(wú)菌隔離器中給予仔鼠無(wú)菌飼料、水、墊料等。

1.5 培育監(jiān)測(cè)無(wú)菌鼠群

仔鼠生產(chǎn)和產(chǎn)后接觸的均為無(wú)菌環(huán)境，但母鼠體內(nèi)的微生物可能通過(guò)胎盤傳播給仔鼠，因此不建議將第一代仔鼠用于無(wú)菌實(shí)驗(yàn)。待此無(wú)菌新生鼠成年后，在無(wú)菌環(huán)境內(nèi)繁殖后代，建立無(wú)菌鼠群用于科學(xué)研究。飼養(yǎng)仔鼠過(guò)程中，每1～2周收集1 次糞便和墊料，監(jiān)測(cè)微生物變化，以實(shí)時(shí)檢測(cè)是否受到污染。

2 抗生素雞尾酒法制作偽無(wú)菌鼠模型

給予SPF級(jí)大鼠、小鼠抗生素混合物可清除90%腸道微生物，但其體質(zhì)量形態(tài)、生理功能、對(duì)全身系統(tǒng)的影響無(wú)顯著變化[13-15]?？股仉u尾酒法只是清除腸道大部分微生物，對(duì)口腔、皮膚、呼吸系統(tǒng)等微生物無(wú)影響，因此稱為偽無(wú)菌動(dòng)物。通過(guò)抗生素雞尾酒法獲得偽無(wú)菌鼠模型，是研究腸道菌群與宿主關(guān)系、腸道菌群與疾病關(guān)系的理想模型。

2.1 選擇抗生素混合物

抗生素的抗菌譜和使用劑量不同，對(duì)腸道菌群的作用也不相同。制作偽無(wú)菌鼠模型應(yīng)選擇廣譜抗生素聯(lián)合使用，以盡可能最大程度的清除大部分腸道微生物。目前常用的抗生素組合和劑量如下：鏈霉素(100 mg/kg)和新霉素(100 mg/kg)組合[16-21]，鏈霉素(200 mg/kg)、新霉素(200 mg/kg)和桿菌肽(200 mg/kg)[22-24]組合，新霉素(100 mg/kg)、萬(wàn)古霉素(50 mg/kg)和兩性霉素-B(1 mg/kg)[25]組合，頭孢曲松鈉(350 mg/kg)和慶大霉素(126 mg/kg)[26]組合，氨芐西林(1 g/L)、新霉素(1 g/L)和甲硝唑(0.5 g/L)[27]組合，頭孢羥氨芐(100 mg/kg)、土霉素(300 mg/kg)、紅霉素(300 mg/kg)[28]組合等。

2.2 合理飼養(yǎng)SPF級(jí)鼠

以無(wú)菌飼料和純凈水飼養(yǎng)SPF級(jí)大鼠、小鼠，紫外線每日消毒飼養(yǎng)環(huán)境和墊料。注意抗生素混合物給藥途徑和持續(xù)時(shí)間，一般采用灌胃喂養(yǎng)，每日1次或2次，也可讓大鼠、小鼠自由飲用含抗生素的純凈水。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求確定抗生素混合物喂養(yǎng)持續(xù)時(shí)間，少則3 d[28]，多則2周[25]，一般為5～7 d[1-2,26]?？股鼗旌衔飸?yīng)每日配制，防止藥效流失，影響造模成功率。

2.3 監(jiān)測(cè)鼠群腸道菌群

抗生素雞尾酒法制作偽無(wú)菌鼠模型的方法受到外界環(huán)境因素影響較多，因此檢測(cè)腸道菌群尤其重要。定期收集新鮮糞便樣本，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、熒光定量PCR技術(shù)、基因芯片技術(shù)或高通量測(cè)序等技術(shù)[29]實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、快速精確的進(jìn)行腸道菌群檢測(cè)，以確定偽無(wú)菌鼠是否造模成功。

3 制作方法評(píng)價(jià)與展望

無(wú)菌鼠模型制作技術(shù)可以推動(dòng)微生態(tài)學(xué)的發(fā)展，促進(jìn)疾病和微生物關(guān)系的研究深入發(fā)展。由于無(wú)菌鼠不攜帶任何生物體，基本排除生物因素對(duì)科學(xué)研究的干擾，可以明顯提高實(shí)驗(yàn)的敏感性、重復(fù)性，有利于探究生命活動(dòng)基本規(guī)律。隨著國(guó)內(nèi)微生物研究的發(fā)展，無(wú)菌鼠是未來(lái)必不可少的動(dòng)物模型之一。

無(wú)菌鼠適用于各種微生物學(xué)研究，尤其是研究藥物代謝、微生物寄生蟲、消化系統(tǒng)疾病、腫瘤的理想模型；按照嚴(yán)格的制作方法，制備成功率較高；在此基礎(chǔ)上植入某種特定微生物，可以建立悉生動(dòng)物模型。但實(shí)際應(yīng)用中尚存在以下問(wèn)題：目前國(guó)內(nèi)具有無(wú)菌鼠制備資質(zhì)的研究所或企業(yè)相對(duì)較少，制備周期長(zhǎng)，制備效率低；無(wú)菌鼠制備和飼養(yǎng)成本較高，導(dǎo)致價(jià)格昂貴，無(wú)法滿足實(shí)驗(yàn)的大量需求；無(wú)菌鼠需飼養(yǎng)于無(wú)菌隔離器中，要求具備無(wú)菌環(huán)境，導(dǎo)致供應(yīng)與應(yīng)用分離，一定程度限制其推廣，難以充分滿足研究需求。

偽無(wú)菌鼠在實(shí)驗(yàn)研究中可以部分代替無(wú)菌鼠，廣泛應(yīng)用于腸道微生物的研究；采用抗生素雞尾酒法制備，制備周期短，制備效率高，價(jià)格便宜，制作簡(jiǎn)便，對(duì)制備和飼養(yǎng)環(huán)境要求相對(duì)較低，可以滿足實(shí)驗(yàn)的大量需求。但抗生素雞尾酒法制作模型也存在一些問(wèn)題：目前主要適用于腸道微生物的研究，無(wú)法進(jìn)行皮膚菌群、口腔菌群、泌尿道菌群、生殖道菌群等研究；無(wú)法替代無(wú)菌鼠模型移植一種或多種菌種建立悉生動(dòng)物模型；業(yè)內(nèi)尚未形成統(tǒng)一的偽無(wú)菌鼠造模成功評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)；制備成功率相對(duì)較低，需進(jìn)行公認(rèn)的檢測(cè)后才能確定是否造模成功。

在應(yīng)用方面，根據(jù)實(shí)際情況不論是采用無(wú)菌動(dòng)物，偽無(wú)菌鼠或者悉生動(dòng)物模型，希望能夠推動(dòng)制備供應(yīng)平臺(tái)與應(yīng)用研究平臺(tái)分離，促成整體研究應(yīng)用模型，構(gòu)建無(wú)菌動(dòng)物規(guī)?；咝а芯繎?yīng)用體系[30-31]。