郭 磊 唐一鑫 魏 然 辛本凱 朱翠琳 張紀(jì)周

(1吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)教研室，長春 130021)(2.吉林大學(xué)白求恩第二臨床醫(yī)院 心血管外科，長春 130022)

心臟移植是針對終末期心力衰竭患者進(jìn)行的手術(shù)治療，患者術(shù)后盡管接受了適當(dāng)?shù)拿庖咭种苿┑闹委?，但仍會引發(fā)并發(fā)癥。當(dāng)受體免疫系統(tǒng)通過啟動免疫反應(yīng)對供體器官中的外來抗原作出反應(yīng)時，就會發(fā)生心臟移植排斥反應(yīng)(heart transplantation rejection, HTR)[1]。近年來，盡管圍手術(shù)期管理取得了進(jìn)展，但同種異體移植排斥仍然是心臟移植后常見的并發(fā)癥，可導(dǎo)致同種異體移植物功能障礙和抗體介導(dǎo)的免疫排斥反應(yīng)，并顯著損害患者的短期和長期預(yù)后[2]。

心臟移植動物模型是進(jìn)行移植免疫學(xué)研究的重要實(shí)驗(yàn)手段，小鼠心臟移植模型經(jīng)過半個世紀(jì)的發(fā)展，已經(jīng)形成了一系列完備的建立方法，其中以小鼠和大鼠的頸部和腹腔異位心臟移植模型最為常用[3-4]。本文就小鼠心臟移植后如何抑制其免疫排斥反應(yīng)作一綜述。

1 小鼠心臟移植動物模型

建立大鼠和小鼠的心臟移植模型是研究移植排斥反應(yīng)較為理想的選擇，其中，大鼠異位心臟移植模型所用實(shí)驗(yàn)動物的體型大，血管粗，容易建立成功，而小鼠體型小，建立小鼠異位心臟移植模型難度較大。但是由于近交系小鼠品種較多，實(shí)驗(yàn)成本較低，并有大量與之匹配的抗體和試劑，因此，小鼠心臟移植動物模型是研究移植免疫學(xué)常用的實(shí)驗(yàn)手段。目前，建立小鼠心臟移植模型主要有兩種方法：頸部異位心臟移植術(shù)和腹腔異位心臟移植術(shù)。這兩種建立方法各具特點(diǎn)，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選用。

1991年，Chen等[5]首次創(chuàng)建了小鼠頸部異位心臟移植模型，此模型通常使用20～30 g雄性BALB/c和C57BL/6小鼠進(jìn)行手術(shù)。該模型主要優(yōu)點(diǎn)有：小鼠頸部血管相對容易分離、手術(shù)創(chuàng)口小、感染率低、術(shù)后存活率高等。主要缺點(diǎn)有：小鼠頸部血管直徑細(xì)，對手術(shù)設(shè)備的要求較高，需要在至少30倍的手術(shù)顯微鏡下進(jìn)行，手術(shù)難度大[3-4,6]。

目前，小鼠腹腔異位心臟移植手術(shù)方法多借鑒大鼠Ono法，并加以改進(jìn)[7]。該模型主要優(yōu)點(diǎn)有：小鼠腹腔空間大，方便手術(shù)操作，小鼠腹主動脈與頸總動脈相比血管直徑粗，在25倍手術(shù)顯微鏡下就可完成。主要缺點(diǎn)有：開腹手術(shù)創(chuàng)口大，感染概率高，并且腹部血管粘連緊密，血管分離難度較大[3-4,8]。

以上兩種小鼠心臟移植模型的構(gòu)建方法，已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用，基本滿足心臟移植后排斥反應(yīng)和驗(yàn)證免疫抑制藥物療效等實(shí)驗(yàn)的需要。下面對抑制移植排斥反應(yīng)的不同方法進(jìn)行介紹。

2 抑制小鼠HTR的制劑

抑制小鼠HTR的制劑可以根據(jù)其作用免疫細(xì)胞的不同分為mTOR免疫抑制劑和阿司匹林、自組裝前藥納米顆粒、微小RNA-146a拮抗劑，下面分別介紹這些藥物對HTR的抑制作用。

2.1 mTOR免疫抑制劑

哺乳動物雷帕霉素靶標(biāo)(mammalian target of rapamycinm,mTOR)于1991年首次被鑒定為釀酒酵母中雷帕霉素的靶標(biāo)。mTOR在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞生長中起重要作用，mTOR抑制劑對T淋巴細(xì)胞增殖具有良好的抑制作用，是移植后抗排斥反應(yīng)常用的免疫抑制劑[9]。

mTOR抑制劑是器官移植受者的主要免疫抑制藥物。西羅莫司及其衍生物是常用的mTOR抑制劑。西羅莫司原名雷帕霉素，是一種天然大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，是吸水鏈霉菌的發(fā)酵產(chǎn)物。在細(xì)胞質(zhì)中，mTOR復(fù)合物可分為兩個結(jié)構(gòu)不同的分子復(fù)合物：mTORC1和mTORC2，雷帕霉素與FK506結(jié)合蛋白12(FK506 binding protein,FKBP12)形成復(fù)合物，然后與mTORC1結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯在G1期，抑制T淋巴細(xì)胞的增殖[10]。

Nakamura等[9]研究表明，通過給心臟移植的小鼠腹腔注射雷帕霉素(3 mg/kg，在術(shù)后第0、2、4和6天進(jìn)行)，結(jié)果顯示雷帕霉素治療導(dǎo)致骨髓來源的抑制性細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)的募集并增加誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的表達(dá)。免疫組織化學(xué)分析表明，雷帕霉素誘導(dǎo)表達(dá)iNOS的MDSCs遷移到同種異體移植血管內(nèi)的內(nèi)膜下空間，與未治療組相比，雷帕霉素治療顯著延長移植物存活時間。

2.2 阿司匹林

阿司匹林(乙酰水楊酸)是非甾體抗炎藥中最主要的成員，通過干擾環(huán)加氧酶II(cyclo-oxygenase II,COX II)治療炎癥、疼痛和發(fā)熱，并有效抑制前列腺素的合成。

已有研究報道阿司匹林通過不依賴COX的途徑作為樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)成熟和活化的抑制劑，抑制DCs的免疫刺激功能。此外，阿司匹林還抑制DCs產(chǎn)生細(xì)胞因子，使DCs處于免疫耐受狀態(tài)。即使存在刺激劑，阿司匹林處理的DCs的免疫抑制功能仍然保留[11-12]。大量臨床研究[13]表明，阿司匹林成功降低了心臟移植患者移植失敗的風(fēng)險，延長了移植的生存期。在同種異位心臟移植小鼠模型中，腹腔注射阿司匹林后，阿司匹林通過影響核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信號通路抑制DCs的成熟，并誘導(dǎo)效應(yīng)T細(xì)胞的免疫低反應(yīng)性，然后減弱心臟移植后的急性HTR?？梢杂行а娱L小鼠的同種異體移植物存活率。此外，阿司匹林與FK506協(xié)同可有效提高移植排斥反應(yīng)的治療效果，表示阿司匹林與現(xiàn)有T細(xì)胞免疫抑制劑聯(lián)合應(yīng)用可能是抑制HTR更好的治療方案[14]。

2.3 自組裝前藥納米顆粒

心臟移植后，為防止HTR，mTOR免疫抑制劑是最常用的治療手段，但傳統(tǒng)的免疫抑制劑具有半衰期短、利用度低和劑量限制性毒性等缺點(diǎn)[15]。這些缺點(diǎn)阻礙了移植物的長期存活。mTOR抑制劑PP242是一種新型的第二代三磷酸腺苷競爭性mTOR抑制劑，通過與三磷酸腺苷結(jié)合位點(diǎn)的相互作用有效抑制mTORC1/mTORC2的激活。為更好地抑制HTR，用二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)對mTOR抑制劑PP242進(jìn)行化學(xué)連接，使其能夠在水溶液中自組裝成納米顆粒(DHA-PP242 nanoparticle,DPNP)。通過全身給藥的DPNP能夠在外周免疫器官內(nèi)的巨噬細(xì)胞中積累，它能夠以不依賴巨噬細(xì)胞的方式抑制T細(xì)胞增殖，同時以依賴巨噬細(xì)胞的方式調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化。DPNP可有效抑制同種異體小鼠心臟移植模型HTR的發(fā)展并顯著延長移植物存活時間[16]。與FK506相比，DPNP廣泛用于臨床器官移植治療，可以誘導(dǎo)更長的移植物存活時間，DPNP可以作為心臟移植后HTR的治療選擇。

2.4 微小RNA-146a拮抗劑

微小RNA-146a(microRNA-146a,miRNA-146a)拮抗劑通過調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,tregs)功能，可以改善小鼠HTR。CD4+CD25+Tregs細(xì)胞特異性表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白3(forkhead box protein 3,Foxp3)，是一種具有免疫調(diào)節(jié)功能的特殊群體，可抑制自身抗原的過度激活，監(jiān)測淋巴細(xì)胞的擴(kuò)增，并有效抑制過度的免疫反應(yīng)[17]。在抑制HTR的治療中，Tregs療法已用于臨床試驗(yàn)，旨在減少或替代可能導(dǎo)致嚴(yán)重毒副作用的免疫抑制劑的使用[18]。miRNA是非編碼單鏈小RNA分子，通過抑制mRNA翻譯或促進(jìn)mRNA降解，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)。miRNA-146a在免疫細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)和功能中起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用，與常規(guī)CD4+T細(xì)胞相比，miRNA-146a在CD4+Tregs中高度表達(dá)，并控制Tregs的表達(dá)和功能[19]。在小鼠同種異位心臟移植模型的HTR中，miRNA-146a與CD4+Tregs的靶基因信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子-1(signal transducer and activator of transcription, STAT 1)結(jié)合，主要通過STAT1/干擾素(interferon, IFN)-γ信號通路參與調(diào)節(jié)Tregs細(xì)胞。使用miRNA-146a拮抗劑能夠降低miRNA-146a表達(dá)，同時協(xié)同應(yīng)用IFN-γ中和抗體可以抑制CD4+T細(xì)胞的增殖，減輕排斥過程，延長供體心臟的存活時間[20]。在HTR發(fā)生時，Tregs的自噬活性受到損害。自噬是降解細(xì)胞內(nèi)成分的過程，它介導(dǎo)細(xì)胞死亡、淋巴細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和增強(qiáng)Tregs細(xì)胞功能。而miRNA-146a下調(diào)可以誘導(dǎo)Tregs自噬的發(fā)生。miRNA-146a介導(dǎo)的Tregs自噬上調(diào)有效延長了同種異體移植物的存活并防止同種異體移植物損傷[21]。以上均表明，已miRNA-146a為代表的miRNAs在抑制心臟移植免疫排斥反應(yīng)方面具有重要作用。

3 小結(jié)

心臟移植后發(fā)生的HTR是不可避免的，小鼠心臟移植模型的制作一方面可以模擬HTR的發(fā)生，另一方面可以對能夠抑制HTR發(fā)生的制劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。目前能夠抑制HTR的制劑有mTOR免疫抑制劑、阿司匹林、自組裝前藥納米顆粒和miRNA-146a拮抗劑4類，其抑制機(jī)制不同，抑制效果不一，但是均有抑制HTR的效果。希望后續(xù)可以有更多的制劑或方法為小鼠心臟移植動物模型的建立提供免疫抑制治療新策略，從而提高動物模型建立的成功率。