韋巧革

（融水苗族自治縣疾病預(yù)防控制中心，廣西柳州，545300)

微生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果是判斷食品是否符合質(zhì)量要求與衛(wèi)生學(xué)要求一項(xiàng)重要標(biāo)準(zhǔn)，食品微生物學(xué)檢測(cè)指標(biāo)包含三項(xiàng)，即大腸菌群檢測(cè)、致病菌檢測(cè)、細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)等[1]。目前國(guó)內(nèi)外均以大腸菌群作為食品、水體污染常用指示菌，評(píng)價(jià)與判斷食品被糞便污染程度和有無(wú)腸道致病菌污染可能[2]。大腸菌群是一種處于37℃、24h 能發(fā)酵乳糖，產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，需氧和兼性的革蘭陰性無(wú)芽孢桿菌統(tǒng)稱(chēng)，該細(xì)菌多存在于溫血?jiǎng)游锛S便便中，人、畜糞便對(duì)外界環(huán)境污染是大腸菌群在自然界主要原因，對(duì)此，大腸菌群被國(guó)際公認(rèn)為檢測(cè)各種水質(zhì)、食品、醫(yī)藥在流行病學(xué)上安全性指示菌[3]。若所檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，則表示藥品、食品、水質(zhì)中存在該菌群，并被糞便污染。研究表明[4]，大腸菌群數(shù)量和受到污染程度呈正比，數(shù)量越多，受污染越為嚴(yán)重。我國(guó)目前主要以多管發(fā)酵法檢測(cè)大腸菌群，其是一種傳統(tǒng)檢測(cè)方式，準(zhǔn)確性、權(quán)威性無(wú)可置疑，但因費(fèi)時(shí)費(fèi)力和檢測(cè)費(fèi)用高現(xiàn)無(wú)法滿(mǎn)足人們對(duì)藥品、食品等監(jiān)測(cè)。對(duì)此，對(duì)于藥品、食品監(jiān)督急需一種快速、有效的大腸菌群檢測(cè)方式[5-6]。近些年來(lái)，世界各地針對(duì)大腸菌群檢測(cè)具有專(zhuān)門(mén)研究，文章現(xiàn)結(jié)合大量研究綜述大腸菌群快速檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)展，對(duì)其應(yīng)用前景展開(kāi)分析。

1 傳統(tǒng)檢測(cè)方式改進(jìn)技術(shù)

1.1 試劑盒法主要依據(jù)水質(zhì)、國(guó)家食品標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方式多管發(fā)酵方法研制而成。主要原理是將液體乳糖培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)固化加工后置于特制透明塑料盒中，組成試劑盒，該檢測(cè)方式具有操作簡(jiǎn)單快速、結(jié)果判定清晰準(zhǔn)確、成本低廉以及便于攜帶和保存等優(yōu)勢(shì)。趙娣偉[7]研究中針對(duì)生活飲水中大腸菌群利用試劑盒法檢測(cè)，結(jié)果顯示，其靈敏度在100%，特異度是98.18%，正確指數(shù)為98.18%。可見(jiàn)是一種科學(xué)、實(shí)用、可靠的檢測(cè)方式，適于水質(zhì)、食品大腸菌群的檢測(cè)。

1.2 快速測(cè)試片法該檢測(cè)原理是將適量乳糖、指示劑溴甲酚紫及革蘭氏陽(yáng)性菌抑菌劑吸附在一定面積無(wú)菌濾紙上，大腸菌群生長(zhǎng)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸使PH 值降低，溴甲酚紫指示劑從紫色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，在紙片上呈黃色反應(yīng)，并且在菌體中含有脫氫酶還原TTC 形成紅色不容性紅四氮唑，從而有效顯示出紅色斑點(diǎn)，若能滿(mǎn)足以上兩種特性作為陽(yáng)性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)[8]。樸相哲[9]研究中對(duì)比快速測(cè)試片法和GB 法檢測(cè)在生鮮豬肉中大腸菌群結(jié)果，結(jié)果表示前者更利于在生鮮豬肉中對(duì)大腸菌群計(jì)數(shù)的統(tǒng)計(jì)，且有效縮短了其檢測(cè)流程。

2 分子生物學(xué)技術(shù)

2.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（PCR）PCR 以它的微量、重復(fù)性好、快捷等特點(diǎn)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中得到廣泛使用。主要是利用耐熱DNA聚合酶作用，通過(guò)變性、延伸、復(fù)性循環(huán)操作在體外迅速將DNA模板擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)倍的一種克隆技術(shù)[10]。雖其存在較高敏感性和特異性，但因食物組分中存在多種酶抑制劑，從而影響到PCR法檢出率，且PCR 法無(wú)法區(qū)分活菌和死菌，故較難對(duì)大腸菌群定量分析。

2.2 基因芯片技術(shù)基因芯片技術(shù)是近些年出現(xiàn)的一種新型技術(shù)，具有較強(qiáng)交叉性，為目前當(dāng)今研究熱點(diǎn)，是將已經(jīng)設(shè)計(jì)的基因片段或寡核肝酸依據(jù)一定循序緊密排列在芯片上，熒光標(biāo)記分子經(jīng)PCR 擴(kuò)增方式進(jìn)入到微生物樣品DNA，且和芯片上寡核苷酸點(diǎn)雜交，最后經(jīng)熒光波長(zhǎng)掃描儀利用計(jì)算機(jī)軟件分析得到樣品含量。祝儒剛[11]學(xué)者使用基因芯片技術(shù)對(duì)大腸埃希氏菌進(jìn)行檢測(cè)，靈敏度達(dá)2pg，并表示所制備的基因芯片檢測(cè)實(shí)際肉及肉制品樣品準(zhǔn)確率高于傳統(tǒng)培養(yǎng)法，能夠作為食源性致病菌檢測(cè)理想手段。賀晨[12]將該技術(shù)和PCR 技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，多種PCR 擴(kuò)增，制備芯片，將擴(kuò)增產(chǎn)物和含有探針基因芯片雜交，結(jié)果表明其對(duì)大腸桿菌特異性檢測(cè)靈敏度達(dá)2x10-3ng。因該技術(shù)存在靈敏度高、快捷、操作方便等特點(diǎn)逐漸成為熱門(mén)研究領(lǐng)域。

1.3 原位雜交法（ISH）主要原理是人工合成大腸菌群DNA 或RNA 序列互補(bǔ)的探針，隨后和大腸菌群行原位雜交，進(jìn)而檢出相對(duì)應(yīng)大腸菌群，該方式目前用于含大腸菌群濃度低的飲用水檢驗(yàn)，最多用熒光標(biāo)記探針來(lái)進(jìn)行熒光原位雜交。有關(guān)研究表示[13]，原位雜交技術(shù)具備簡(jiǎn)便、操作快速、安全、穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)，且可進(jìn)行定量分析，但其操作步驟繁瑣，技術(shù)繁雜從而難以規(guī)?；茝V。王建龍[14]研究中通過(guò)熒光標(biāo)記探針取代同位素探針熒光原位雜交技術(shù)（FISH），并表示FISH 技術(shù)可以用于飲用水中大腸菌群的檢測(cè)，且在較短時(shí)間內(nèi)（6～8h）給出定量分析。

3 免疫學(xué)技術(shù)

3.1 酶聯(lián)免疫吸附法(ELIsA)酶聯(lián)免疫吸附法是1971年ENCVEIL 等建立在免疫酶基礎(chǔ)上的一種新型免疫測(cè)定技術(shù)，是目前較為常用的一種檢測(cè)手段。并有研究表示[15]其具有快速、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，但抗原和抗體濃度與反應(yīng)液以及抗體特異性可產(chǎn)生影響。若污染物較嚴(yán)重且進(jìn)行檢測(cè)，ELISA 法存在嚴(yán)重缺陷，因其受到其他存在細(xì)菌影響而降低方法特異性。主要原理是利用酶標(biāo)記抗體或酶標(biāo)記抗原進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，酶和底物產(chǎn)生深淺不一顏色反應(yīng)[16]。測(cè)定時(shí)酶標(biāo)記在抗體分子上形成酶標(biāo)抗體，在大腸菌群和酶標(biāo)反應(yīng)形成復(fù)合物之后，底物被酶催化，進(jìn)而生成有色產(chǎn)物，其中，產(chǎn)物的量和樣本待檢驗(yàn)質(zhì)的含量存在直接關(guān)系，故依據(jù)呈色深淺進(jìn)行定量分析，其適于所有食品大腸菌群的檢測(cè)[17]。

3.2 免疫磁珠技術(shù)（IMB）免疫磁珠技術(shù)以磁珠作為抗體載體，通過(guò)抗體抗原結(jié)合磁力作用下發(fā)生力學(xué)移動(dòng)，進(jìn)而達(dá)到分離特異性抗原目的。國(guó)外一學(xué)者使用改法從患者糞便中分離出多注山梨醇陽(yáng)性O(shè)157:H7 大腸桿菌，表示該方式敏感度高，特異性好，且操作復(fù)雜，但不具備廣泛使用能力。

4 小結(jié)

以往針對(duì)大腸菌群檢測(cè)方式實(shí)驗(yàn)量大，步驟雜，且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，以及靈敏度差等缺點(diǎn)，而近些年發(fā)展的大腸菌群快速檢測(cè)方式包含PCR 法、酶聯(lián)免疫吸附法等，有效解決了上述問(wèn)題，但檢測(cè)特異性、敏感性及操作上存在多種問(wèn)題，故還未有一種真正達(dá)到成本低、靈敏度好、準(zhǔn)確性高等檢測(cè)方式，故仍需不斷科學(xué)研究，尋找一種適宜的方式。