覃柳群 羅世強(qiáng) 嚴(yán)提珍

1.柳州市婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳科 廣西 柳州 545001

2.柳州市出生缺陷預(yù)防與重點(diǎn)實(shí)驗室 廣西 柳州 545001

3.柳州市婦幼保健院生殖與遺傳研究所 廣西 柳州 545001

α-地中海貧血（以下簡稱α-地貧）是我國南方地區(qū)最常見的單基因遺傳病之一，中國長江以南各省區(qū)多見，尤以廣西、廣東和海南三省最為嚴(yán)重。廣西和廣東兩省的發(fā)病率分別高達(dá)14.95%、8.53%[1]。此病主要是由于α珠蛋白基因缺失所引起的典型基因缺失遺傳病，最常見的類型是α-地中海貧血和β地中海貧血，其臨床表現(xiàn)和分型與目的基因的缺失直接相關(guān)，臨床暫無有效的治療方法，篩選出合理的實(shí)驗室診斷技術(shù)對該病的預(yù)防具有重要的意義。本文就目前應(yīng)用于α-地中海貧血的標(biāo)本種類及多種實(shí)驗室分子診斷技術(shù)作一綜述。

1 樣本采集、運(yùn)送及保存

不同的抗凝劑對PCR擴(kuò)增的影響是不同的，例如肝素抗凝的血液標(biāo)本經(jīng)DNA提取后仍會影響PCR的擴(kuò)增效率。血液的新鮮程度也會影響DNA提取的質(zhì)量。目前用于地貧檢測的標(biāo)本極大多數(shù)都為EDTA抗凝全血，標(biāo)本需要保存于4攝氏度冰箱，在運(yùn)送過程中也需格外注意，不得顛簸、倒放及高熱以防滲漏、溶血等造成交叉污染。駱明勇等[2]發(fā)現(xiàn)將150份干血斑標(biāo)本存放6、9個月后依然能夠穩(wěn)定地進(jìn)行地貧基因檢測。該方法為地貧基因檢測提供了一種方便的標(biāo)本采集方式，特別適用于標(biāo)本采集困難的檢測對象。另外，現(xiàn)在不少單位已在新生兒中采用干血斑進(jìn)行血紅蛋白地貧篩查，不用再次采集標(biāo)本，該方法將在地貧標(biāo)本轉(zhuǎn)診網(wǎng)絡(luò)建設(shè)中發(fā)揮重要的作用。

1.1 缺口PCR技術(shù)（Gap-PCR）

缺口PCR的原理是進(jìn)行2對或者3對引物的設(shè)計，也就是在缺失區(qū)域的外側(cè)，在與缺失位點(diǎn)臨近的地方進(jìn)行1對引物的設(shè)計，在缺失區(qū)域里面進(jìn)行1對引物的設(shè)計。在正常人和雜合子中處于缺失區(qū)域中的引物能擴(kuò)增片段，同時如果是缺失純合子，則不能擴(kuò)增。通過缺口PCR方法的應(yīng)用，可以將三種缺失型地中海貧血準(zhǔn)確檢測出來[3]。缺失序列、設(shè)計引物兩側(cè)翼序列互補(bǔ)，原本正常情況下處在斷裂點(diǎn)兩側(cè)翼相距遙遠(yuǎn)的引物由于基因缺失突變變得臨近，因而實(shí)現(xiàn)一定長度片段的擴(kuò)增；缺失區(qū)域有另外一對引物，當(dāng)處于雜合子情況或完全正常情況下，才能夠完成正常等位基因的擴(kuò)增。這一方法依據(jù)擴(kuò)增片段大小能實(shí)現(xiàn)正常雜合子、純合子個體的準(zhǔn)確區(qū)分[4]。

1.2 反向點(diǎn)雜交法（PCR-RDB）

反向點(diǎn)雜交法（PCR-RDB）其原理是將擴(kuò)增的DNA與固定在尼龍扎帶上的突變特異性探針雜交。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和探針通過分子雜交反應(yīng)及顯色反應(yīng)，觀察檢測膜條上各位點(diǎn)信號的有無，判斷該探針是否與PCR產(chǎn)物雜交，從而確定待檢樣品的基因型[5]。α-地貧分為缺失型和非缺失型，目前主要用PCR結(jié)合反向點(diǎn)雜交（RDB）法檢測3種α點(diǎn)突變(αCSα、αQSα、αWSα)[6]。

1.3 多重連接依賴式探針擴(kuò)增技術(shù)（MLPA）

MLPA 是一種多重連接依賴式探針擴(kuò)增技術(shù)。基本原理是把目的基因復(fù)制到依賴探針上，再用一對通用引物擴(kuò)增捕獲到的目的片段，通過對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析得出目的片段異常的結(jié)果。此技術(shù)操作簡單，24小時內(nèi)可出結(jié)果，自動化程度高，有相應(yīng)的數(shù)據(jù)分析程序。Liu等[7]應(yīng)用覆蓋α-珠蛋白基因的MLPA探針對118例標(biāo)本進(jìn)行檢測，不僅準(zhǔn)確地檢測出單一缺失，如：-α3.7/αα、-α4.2/αα、--SEA/αα 等，還可以檢測出復(fù)合缺失如-α4.2/--SEA等，特異性和敏感性達(dá)100%。郝穎等[8]89對夫婦雙方或一方為α地貧基因攜帶者的家系中的胎兒樣本,同時用Gap-PCR技術(shù)和MLPA技術(shù)進(jìn)行檢測α珠蛋白基因的缺失。結(jié)果88份胎兒樣本的MLPA檢測結(jié)果和Gap-PCR檢測結(jié)果完全一致；1份胎兒樣本（絨毛組織）經(jīng)Gap-PCR檢測未能確診，后結(jié)合MLPA檢測確診為-SEA/αα。

1.4 多色探針熒光PCR熔解曲線法

多色探針熒光PCR熔解曲線法，主要利用改良分子探針對PCR產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時分析的突變檢測技術(shù)。分別計算出各個樣本、校準(zhǔn)品的 ΔCt 值（目的基因減去參比基因的Ct值差），再將待測樣本的ΔCt減去正常對照樣本△Ct得ΔΔCt 計算 2-ΔΔCt即可得到待測樣本，相對于校準(zhǔn)品目的基因的相對拷貝數(shù)。這種目的基因相對定量模式，無需制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，可靈敏地檢測出基因拷貝數(shù)的差異。嚴(yán)提珍等[9]采用 PCR-熒光探針法對303例臨床樣本進(jìn)行α珠蛋白基因拷貝數(shù)定量檢測，檢測結(jié)果與 Gap-PC R法結(jié)果比較分析，結(jié)果表明兩種方法結(jié)果完全一致的有 301例，不吻合的有2例，符合率為 99.34%。這2例經(jīng)MLPA技術(shù)復(fù)核，發(fā)現(xiàn)檢測結(jié)果與Gap-PC R法結(jié)果一致，且該方法整個檢測過程都在封閉的PCR管中進(jìn)行，PCR和熔解分析僅需一個程序完成，與目前的RDB法和測序法相比，具有明顯的高通量和操作簡便的優(yōu)勢，同時又大大降低了PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染的機(jī)會。

1.5 基因芯片技術(shù)

基因芯片雜交法是在PCR擴(kuò)增的基礎(chǔ)上，應(yīng)用熒光標(biāo)記法將大量的寡核苷酸片段或 DNA片段有序排列在固相載體上，稱之為基因芯片或DNA陣列，同時提取待檢測樣品DNA，與芯片雜交，然后掃描芯片的熒光強(qiáng)度，應(yīng)用生物信息學(xué)分析結(jié)果，最后得到樣品中基因序列和表達(dá)水平或突變的相關(guān)信息。該技術(shù)能快速、準(zhǔn)確地從分子水平診斷疾病。王沙燕等[10]和黃培堅[11]都利用基因芯片技術(shù)進(jìn)行α-地貧基因檢測，他們認(rèn)為基因芯片法具有快速、高效、自動化程度高且簡便等優(yōu)點(diǎn)，但由于該技術(shù)所需設(shè)備和耗材昂貴，限制其在臨床推廣應(yīng)用。

1.6 DNA測序

DNA測序技術(shù)能夠直接準(zhǔn)確的對基因突變的位置和性質(zhì)進(jìn)行判斷，是檢測未知地中海貧血基因突變的金標(biāo)準(zhǔn)。Sanger法是最常用的第一代測序技術(shù)，該技術(shù)為定性實(shí)驗，不能對大片段的基因缺失進(jìn)行檢測，且費(fèi)時費(fèi)力費(fèi)用高，隨著DNA測序技術(shù)的進(jìn)步，出現(xiàn)了高通量測序技術(shù)，又稱下一代測序技術(shù)，它一次能并行對數(shù)以百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定，對所有類型的地中血進(jìn)行檢測。譚梅等[12]用高通量測序技術(shù)在206例受檢新生兒中篩查出地中海貧血基因突變的有22例，其中 α-地中海貧血11例，β-地中海貧血11例，新發(fā)5例。宋春林等[13]用高通量測序?qū)?368例樣本中一共檢出了523例（38.2%），共25種地中海貧血基因突變，常規(guī)基因檢測陰性而高通量測序陽性結(jié)果經(jīng)Sanger測序結(jié)果一致。他們認(rèn)為高通量測序在地貧檢測上值得推廣。但是DNA序列測定法操作繁瑣，所需儀器設(shè)備昂貴，極大地限制了其在臨床診斷中的應(yīng)用。

2 總結(jié)

目前地貧基因診斷主要采用EDTA抗凝靜脈全血，采血量大，不利于對新生兒的采集；采血管的轉(zhuǎn)運(yùn)也存在低溫轉(zhuǎn)運(yùn)不便及容易破管等許多問題。干血斑是通過采集適量的血液，足跟血、末梢血均可，滴在濾紙片上并干燥而成，具有需要標(biāo)本量少、便于運(yùn)輸,保存等優(yōu)點(diǎn)，非常適合血液標(biāo)本采集和轉(zhuǎn)運(yùn).

實(shí)驗室診斷的總標(biāo)準(zhǔn)是成本低、效率高和方便簡單，同時需保證疾病診斷準(zhǔn)確性，避免出現(xiàn)漏診和誤診現(xiàn)象。實(shí)驗室分子診斷技術(shù)中各自有自身優(yōu)劣勢，因此，充分了解每種技術(shù)的應(yīng)用范圍及局限性,結(jié)合各自實(shí)驗室的具體情況，尋找到準(zhǔn)確、高效、經(jīng)濟(jì)的診斷方案，對于各高發(fā)地區(qū)預(yù)防中重型地中海貧血患兒的出生及提高 新生人口素質(zhì)具有積極且深遠(yuǎn)的意義。