馬占飛，李 楊，王亞博，姜國均

(河北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,河北保定 071000)

蚯蚓(earthworm;)俗稱地龍、曲蟮，目前世界上的蚯蚓超過了3 000種，中國有記錄的蚯蚓達到了9科28屬306種(含亞種)。蚯蚓棲息在土壤之中，經(jīng)常暴露在含有多種微生物及病原體的環(huán)境中，并不斷受到污染物的侵擾，蚯蚓之所以在惡劣的環(huán)境中可以生活良好，得益于它自身強大的免疫系統(tǒng)，包括細胞免疫系統(tǒng)、體液免疫系統(tǒng)和蚯蚓抗菌肽[1]。

抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)最早被發(fā)現(xiàn)于20世紀80年代，瑞典科學家Boman用細菌刺激天蠶(Hyalophoracecropia)后，首次發(fā)現(xiàn)了AMPs-天蠶素(cecropins)。AMPs抗菌譜廣，毒副作用小，對環(huán)境幾乎沒有危害，是替代抗生素比較理想的藥物。本文對國內(nèi)外文獻進行整理分析，對蚯蚓AMPs的分類、作用機理和應用進行綜述，為蚯蚓附加值產(chǎn)品的開發(fā)和產(chǎn)業(yè)化提供理論依據(jù)。

1 蚯蚓抗菌肽的分類

1.1 富含脯氨酸的抗菌肽

動物機體在免疫刺激下會產(chǎn)生各種AMPs，其中一類AMPs的脯氨酸含量較高，我們通常把這類AMPs稱為富含脯氨酸的抗菌肽(proline-rich antimicrobial peptides，PrAMPs)[2]。PrAMPs廣泛存在于各種昆蟲以及哺乳動物體內(nèi)，脯氨酸的大量存在會影響AMPs的結構、功能以及抗菌作用。例如，Cho J H等[3]從蚯蚓(Lumbricusrubellus)中分離表征的Lumbricin Ⅰ。Lumbricin Ⅰ的脯氨酸占比為15%，高含量的脯氨酸造成了Lumbricin Ⅰ肽鏈的側鏈環(huán)化回到主鏈酰胺位置，這是脯氨酸賦予肽鏈獨特的結構。此外，Li W L等[4]從蚯蚓(Pheretimaguillelmi)皮膚分泌物中分離出一種新的類蚓蛋白酶AMPs，命名為Lumbricin-PG，成熟的Lumbricin-PG含有59個氨基酸，脯氨酸含有9個(脯氨酸占比15%)，它與來自Lumbricusrubellus的Lumbricin Ⅰ具有66%的同源性。Wang X等[5]也從蚯蚓(Pheretimatschiliensis)的cDNA末端快速擴增，獲得了一種假定AMPs(命名為PP-1)的cDNA，PP-1不僅含有高量的脯氨酸，且其與 Lumbricin Ⅰ和高度保守的N端部分有77.6%的氨基酸同源性。

經(jīng)查閱文獻進行總結后發(fā)現(xiàn)富含脯氨酸的蚯蚓AMPs，都為Lumbricin的同系物，并且這些AMPs并不都是來自同一種蚯蚓，這些AMPs的脯氨酸含量都在10%～15%之間。此外高含量的脯氨酸可能會對AMPs的表達產(chǎn)生影響，Bodó K等[6]研究發(fā)現(xiàn)了2種富含脯氨酸的蚯蚓AMPs，命名為Lumbr和LuRP，這2種AMPs與Lumbricin Ⅰ有較高的同源性，并且他們發(fā)現(xiàn)在蚯蚓個體發(fā)育過程中，Lumbr與LuRP的的表達在胚胎中持續(xù)增加，這與Cho J H等[3]發(fā)現(xiàn)的結論類似。所以富含脯氨酸的AMPs的表達可能會隨著個體的成熟與否來變化。

1.2 富含芳香族氨基酸的抗菌肽

大多數(shù)AMPs攜帶陽離子，也有一小部分呈中性。而細菌膜上的脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)成負電性，AMPs通過與細菌膜上的LPS相結合，破壞膜結構的完整性，從而達到抑菌的效果。Azuma E等[7]研究發(fā)現(xiàn)，通過同時引入正電荷(+9～+10)的芳香族氨基酸殘基可提高典型AMPs F5W-magainin 2的治療指數(shù)，加入正電荷+9的芳香族氨基酸殘基后能夠增強F5W-magainin 2的抗菌活性，這可能是由于芳香族氨基酸攜帶陽離子，而富含芳香族氨基酸的AMPs與細菌膜上LPS的結合能力也因為芳香族氨基酸的原因大大提高，最終使得AMPs廣譜抗菌活性大大提高。加入正電荷+10的芳香族氨基酸殘基后可以降低F5W-magainin 2的細胞毒性。Ghosh S[8]經(jīng)研究也發(fā)現(xiàn)了帶正電荷的氨基酸在維持AMPs結構功能穩(wěn)定性方面發(fā)揮作用?？傊?，正電荷數(shù)量的增加為AMPs帶來了正向收益。

Milochau A等[9]在蚯蚓(Eiseniafetidaandrei)體腔液中分離出來表觀分子質量分別為40 ku與45 ku的兩種蛋白，命名為Fetidins，它們不僅具有溶血，凝血的功能，而且還具有光譜的抗菌活性，它們均可抑制巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、以及螺旋體(Spirochete)的生長。Dhainaut A等[10]用大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)接種蚯蚓(Nereisdiversicolorterrestris)，采取蚯蚓體腔液后采用凝膠過濾和離子交換色譜兩種方法純化后，得到分子質量為10 ku的抗菌蛋白MP(Ⅱ)，該蛋白由2個相同的亞基組成，富含芳香族氨基酸，半胱氨酸含量較低。存在于蚯蚓體腔的G1粒細胞內(nèi)，未免疫的蚯蚓體內(nèi)的抗菌活性非常低，但是大腸埃希氏菌與銅綠假單胞菌可以激發(fā)鈣蛋白的抗菌活性，其于鎘蛋白有高度的相似性。

1.3 其他蚯蚓抗菌肽

另外，還有一些被分離出來具有廣譜抗菌活性的AMPs。孫振鈞等[11]經(jīng)過硫酸銨沉淀、超濾和陽離子分離，在蚯蚓(Eiseniafotida)體內(nèi)分離出一種分子質量約為20 ku的抗菌蛋白EABP-1，EABP-1具有廣譜的抗菌活性，包括革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌。他們在分離EABP-1的步驟上增加了快速反應液相色譜(FPLC)分析法，在Eiseniafotida體內(nèi)分離純化出2種分子質量分別為0.535 ku與0.519 ku的AMPs，命名為F-1和F-2，它們對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌及真菌都有一定的抑制作用[12]。

王莊等[13]通過電擊蚯蚓，然后采用超濾濃縮脫鹽、陽離子交換分離以及凝膠過濾層析方法，純化得到3 ku～30 ku的AMPs，分別有H1、H3兩個蛋白濃度較高的峰值，其分子質量分別在5.856 ku～7.823 ku和14.40 ku～20.00 ku。其中H1對枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、金黃色葡萄球菌、巴氏桿菌(Pasteurella)、大腸埃希氏菌有明顯的抑菌效果,H2對巴氏桿菌(Pasteurella)、大腸埃希氏菌和枯草芽孢桿菌也有明顯的抑菌效果,H1的抑菌活性比H2高。

這些分離純化出來的蚯蚓AMPs還需要進行更深入的研究，例如它們的二級結構、抑菌機制以及使用劑量等問題需要進一步解決。

2 抗菌肽的作用機制

AMPs具有廣泛的抗菌活性，它的作用機制大體上可以分為在細胞膜發(fā)揮作用與在細胞膜內(nèi)發(fā)揮作用兩種，其中作用于細胞膜的機制包括桶狀模型、環(huán)孔模型、地毯模型和類似洗滌劑的模型[14]；作用于細胞內(nèi)的機制包括抗菌肽抑制DNA的合成，抑制蛋白質的合成[15]、抑制細胞壁的形成[16]、抑制酶活性[17]、影響細胞分裂[17]等。此外，還會有一些特殊的作用機制，不同AMPs的作用機制并不相同。

2.1 在細胞膜發(fā)揮作用

目前，人們對α-螺旋肽的研究比較深入，此類結構的AMPs發(fā)揮作用大多都是通過與膜上的LPS相結合或者競爭與LPS結合的二價陽離子(Ca2+/Mg2+)，改變或者是破壞膜結構，導致膜的完整性發(fā)生變化。在桶狀模型中，肽分子疏水區(qū)與磷脂分子結合朝向膜內(nèi)，親水區(qū)朝向膜外形成桶狀管道[18]。在環(huán)形孔蟲洞模型中，AMPs疏水區(qū)與磷脂分子結合后，誘導膜向內(nèi)彎曲形成孔[18]，最后，在地毯模型中，AMPs大量分布在膜表面上，形成地毯樣，肽分子的疏水區(qū)與膜上的磷脂分子結合，親水區(qū)朝向外部，大量的肽分子分布在膜表面，當肽分子的數(shù)量達到一定程度，就會使膜遭到破壞[18]。最后，AMPs會聚集在膜的表面，當增加到一定濃度之后，AMPs就會像洗滌劑一樣，將膜分解成小塊[20]。例如來自于天蠶蛹中分離的天蠶素，在高濃度時，天蠶素會采用類似地毯和類似洗滌劑模型，分裂掉細菌細胞膜。

2.2 在細胞內(nèi)發(fā)揮作用

關于AMPs對細菌的作用機制，主要集中在AMPs對細菌細胞膜的作用，但是，隨著人們對AMPs的深入研究后發(fā)現(xiàn)，AMPs對細菌的作用不僅僅局限在細胞膜，它們也會進入細胞內(nèi)發(fā)揮作用[20]。AMPs進入細胞后，抑制細菌DNA、蛋白質合成，破壞蛋白質的結構功能，或者影響酶的活性，使得細胞代謝紊亂，導致細胞死亡。PrAMPs是一類特殊的陽離子AMPs，具有穿透細菌細胞膜、殺死細胞而不引起膜透性的能力[21]。Ho Y H等使用大腸埃希氏菌蛋白質組微陣列系統(tǒng)地鑒定了3種細胞內(nèi)靶向AMP的蛋白質靶標：細菌素7(Bac7)，pleurocidin和dermaseptin(P-Der)的雜交體，乳鐵蛋白B(LfcinB)，以及富含脯氨酸的精氨酸肽(PR-39)，研究發(fā)現(xiàn)，Bac7靶向嘌呤代謝和組氨酸激酶，LfcinB攻擊轉錄相關活性和幾種細胞碳水化合物的生物合成過程，P-Der影響小分子的幾種分解代謝過程，PR-39優(yōu)先識別參與RNA和葉酸的蛋白質代謝相關的細胞過程。此外，Bac7和LfcinB均靶向嘌呤代謝，而LfcinB和PR-39均靶向脂多糖生物合成[22]。

因為AMPs的作用機制受到氨基酸序列、帶電量、兩親性、物質結構的影響[23]，這也說明AMPs對細菌的作用機制是多種多樣的，不同的AMPs對細菌的作用也是不盡相同的。

2.3 其他作用機制

AMPs除了通過細胞膜或者是進入細胞內(nèi)達到滅菌的效果，都是AMPs自身發(fā)揮作用。AMPs也可以通過調(diào)控免疫通路，激活免疫系統(tǒng)的運行，從而也可以達到殺滅細菌的作用。酚氧化酶原(Pro-po)激活系統(tǒng)就是無脊椎動物典型的自身免疫通路。對細菌抗原的識別后，蛋白酶開始水解無活性的Pro-po，進而切割成有活性的酚氧化酶(PO)，PO催化單酚的O-羥基化(O-hydroxylation)以及雙酚氧化為醌，隨后非酶聚合為黑色素，黑色素及其前體具有細胞毒性和抗菌特性，參與吞噬作用/調(diào)理作用、包裹/結節(jié)形成、脫顆粒和傷口愈合多種機體活動。例如在蚯蚓體內(nèi)發(fā)揮積極免疫作用的CCF-1，有報道指出CCF-1有類似于人TNF-α的溶解作用，在溶血、細菌和腫瘤溶解中發(fā)揮作用，最重要的是CCF-1會通過識別酵母和革蘭氏陰性菌的細胞壁成分參與Pro-po系統(tǒng)的激活[24]。

3 蚯蚓抗菌肽的應用

抗生素的濫用引起抗生素的耐藥性，導致多種耐藥菌的出現(xiàn)，對人類、動物以及環(huán)境造成巨大的危害，特別是多種耐藥菌的出現(xiàn)，使得尋找新的替抗產(chǎn)品勢在必行。AMPs作為一種來自于生物的蛋白材料，由于其獨特的非特異性膜破裂機制，已經(jīng)被發(fā)展稱為強有力的候選分子[25]。而蚯蚓作為自然界豐富存在的生物，簡單易得，所以大力發(fā)展蚯蚓的AMPs具有很廣闊的前景。

3.1 在蔬菜種植中的應用

蚯蚓體內(nèi)含有多種抗菌的活性成分，其中AMPs作為一類具有廣譜高效滅菌的多肽分子，在蚯蚓的免疫防御中占有不可取代的地位。王東升等[26]研究蚓酶多肽對黃瓜的影響，發(fā)現(xiàn)使用蚓酶多肽的黃瓜不僅生長速度快，而且品質與營養(yǎng)價值也高于對照組，同時還使用蚓酶多肽使用在番茄上，發(fā)現(xiàn)番茄從抗病能力、產(chǎn)量和品質上都有所提高。

3.2 在養(yǎng)雞生產(chǎn)中的應用

李娟等[27]研究蚯蚓提取物對伊莎雪佛黑雞育成期生產(chǎn)性能及免疫功能的影響,發(fā)現(xiàn)在飲水中添加蚯蚓提取物對伊莎雪佛黑雞血清補體C3、白細胞介素-1(IL-1)、白細胞介素-6(IL-6)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、腫瘤壞死因子(TNF-α)均有顯著影響,說明飲水中添加蚯蚓提取物可以增強雞的體液免疫水平。

3.3 治療小鼠帕金森等疾病

Kim D H等[28]在蚯蚓中分離的Lumbricin(NH2-RNRRWCIDQQA)在小鼠的神經(jīng)干細胞中(MNSCs)顯著提高細胞增殖(提高12%)，并通過蛋白酶體蛋白質降解而不是轉錄調(diào)節(jié)降低p27(Kip1)的蛋白質表達。而且Lumbricusin抑制了6-OHDA 誘導的MNSCs凋亡，并且還在小鼠帕金森病(PD)模型中顯示出神經(jīng)保護作用。因此，Lumbricusin可能被開發(fā)為治療PD的潛在治療劑。此外，Seo M等[29]基于Lumbricusin的氨基酸序列新合成了9聚體的Lumbricusin類似物，并通過使用BV-2小膠質細胞分析了其對LPS免疫反應的影響。發(fā)現(xiàn)其中一種Lumbricusin類似物Lumbricusin Analogue 5(LumA5)顯著降低了由LPS和酶(COX-2、iNOS)、細胞因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)和信號轉導因子(AKT、MAPKs,NF-κB)在體外和體內(nèi)引發(fā)的炎癥反應。此外，LumA5 不僅減弱了SH-SY5Y細胞中小膠質細胞介導的神經(jīng)毒性，而且減弱了LPS刺激的神經(jīng)炎癥小鼠模型中的炎癥反應。

4 小結與展望

目前，抗生素所帶來耐藥性細菌的數(shù)量還在持續(xù)增加，受到自然界的啟發(fā)，人們發(fā)現(xiàn)AMPs具有優(yōu)于傳統(tǒng)抗生素的獨特優(yōu)勢[30]。AMPs作為比較理想的替代抗生素產(chǎn)品，具有廣譜的抗菌活性，能提高炎癥、腫瘤、病毒病等多種疾病的治療效果，具有很廣闊的應用前景。但AMPs廣泛應用于臨床還不太現(xiàn)實，主要原因是AMPs固有的局限性，包括其自身穩(wěn)定性、對細胞毒性和生物利用度等原因[31]，并且AMPs的提取過程復雜、成本較高，現(xiàn)有技術還不能大規(guī)模的提取生產(chǎn)，所以深入地研究AMPs的分泌機制及其提取技術有十分重要的理論和現(xiàn)實意義。