李 敏，李 立，李文卉，賈萬忠,2*，閆鴻斌*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730046；2.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州 225009)

棘球蚴(包蟲)病是一種世界流行的危害嚴(yán)重的人獸共患病，對(duì)人群健康、畜牧業(yè)生產(chǎn)和社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來較大影響[1]。在我國(guó)，包蟲病廣泛分布在青海、西藏、四川、新疆等西部地區(qū)。細(xì)粒棘球絳蟲(Echinococcusgranulosus,Eg)和多房棘球絳蟲(E.multilocularis,Em)是棘球?qū)僦形：ψ顕?yán)重的2種棘球絳蟲，也是我國(guó)主要流行的2個(gè)種[2]。棘球絳蟲成蟲寄生于犬、狐和狼等犬科動(dòng)物的小腸，成熟的孕卵節(jié)片會(huì)脫落，隨著糞便排出體外后釋放出蟲卵，每個(gè)孕卵節(jié)片里一般有200個(gè)～800個(gè)蟲卵，是引起人和動(dòng)物棘球蚴病的傳染源[3]。有些犬的腸道中會(huì)寄生成千上萬條棘球絳蟲，每條成蟲都會(huì)通過有性生殖產(chǎn)生大量的蟲卵，并不斷地通過糞便排出體外。蟲卵在外界環(huán)境中能夠長(zhǎng)期存活，對(duì)化學(xué)藥物亦有較強(qiáng)的抵抗力，繼而長(zhǎng)期污染土壤、飼料、牧草和飲水[1]。隨著我國(guó)城鎮(zhèn)化和老齡化的發(fā)展，伴侶動(dòng)物的飼養(yǎng)量持續(xù)上升，由此導(dǎo)致我國(guó)城市中每年出現(xiàn)大量流浪犬，流浪犬成為城市中包蟲病傳播的嚴(yán)重隱患[4]。因此，及時(shí)、準(zhǔn)確檢測(cè)終末宿主棘球絳蟲感染情況，從而采取措施以減少和消除蟲卵對(duì)環(huán)境的污染，對(duì)防控和凈化棘球蚴病具有重要意義。目前，檢測(cè)棘球絳蟲的方法包括病原學(xué)檢測(cè)、糞抗原和糞 DNA方法等。

1 病原學(xué)檢測(cè)方法

傳統(tǒng)的病原學(xué)檢測(cè)主要是借助顯微鏡觀察寄生蟲形態(tài)等特征進(jìn)行種屬的鑒定。國(guó)際上普遍采用“氫溴酸檳榔堿瀉下法”和“剖檢法”檢查犬科動(dòng)物糞便樣本。瀉下法在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中不易推廣，一方面該方法具有高危險(xiǎn)性，且耗時(shí)耗力，另一方面氫溴酸檳榔堿對(duì)犬科動(dòng)物具有強(qiáng)烈的副作用，檳榔堿在大多數(shù)國(guó)家已不再用作犬的驅(qū)蟲劑[5]。此外，該技術(shù)敏感性較低，用于診斷細(xì)粒棘球絳蟲時(shí)敏感性僅為38%，診斷多房棘球絳蟲時(shí)敏感性僅為21%[6-7]。剖檢法陽性預(yù)期值可達(dá)到100%，是棘球絳蟲感染檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。該方法能夠?qū)λ械哪c蠕蟲進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析，并確定它們的發(fā)育階段。但是此方法適用于24 h內(nèi)采集的新鮮樣品，而且需要將犬處死，在實(shí)際工作中很難推廣應(yīng)用，只適合抽檢和評(píng)價(jià)其他檢測(cè)方法[8]。其他方法還包括腸黏膜刮取技術(shù)、容器振蕩沉淀法、直接計(jì)數(shù)法等，以上方法雖然特異性高，但是棘球?qū)俜N內(nèi)及帶科絳蟲卵形態(tài)相似，無法鑒別，還存在感染操作者和污染環(huán)境的風(fēng)險(xiǎn)。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，這些方法已逐漸被取代。

2 糞抗原ELISA檢測(cè)方法

2.1 常規(guī)ELISA

由于寄生于犬科動(dòng)物小腸內(nèi)的蟲體，其代謝物、分泌物、脫落的節(jié)片或者蟲卵等抗原隨著糞便排出體外，糞抗原-ELISA檢測(cè)法就是通過抗原-抗體的特異結(jié)合，對(duì)感染進(jìn)行檢測(cè)的方法[9]。該方法具有對(duì)被檢動(dòng)物無傷害、檢測(cè)材料易獲取、檢出率高和操作者不易被感染的優(yōu)點(diǎn)，感染動(dòng)物驅(qū)蟲治療后仍能進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測(cè)[4,10]。在過去使用較多的檢測(cè)抗原包括成蟲蟲體抗原、原頭節(jié)蟲體抗原及其分泌物抗原、成蟲表膜抗原等，但這些都屬于棘球絳蟲的粗抗原，獲取這些檢測(cè)抗原繁瑣耗時(shí)，而以此研制成的試劑盒特異性和穩(wěn)定性較差，易與犬腸道內(nèi)其他常見寄生蟲發(fā)生交叉反應(yīng)，因此，特異性重組抗原篩選鑒定是研發(fā)犬糞抗原診斷方法的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[5,11]。

細(xì)粒棘球絳蟲抗原B(EgAgB8/3)在成蟲階段大量表達(dá)，而且屬于蟲體分泌抗原，隨著感染犬的糞便排出而易于檢測(cè)，試驗(yàn)證實(shí)EgAgB8/3可作為Eg感染犬糞抗原檢測(cè)的理想靶分子[12]。陳潔等[6]通過制備抗EgAgB8/3重組蛋白的多克隆抗體，建立了雙抗體夾心ELISA，其敏感性和特異性分別為85.0%和95.7%，但是會(huì)與犬復(fù)孔絳蟲(Dipylidiumcaninum)發(fā)生交叉反應(yīng)。張瑞妮等[13]為了克服交叉反應(yīng)，應(yīng)用具有融合標(biāo)簽自剪功能的表達(dá)載體PTWIN1對(duì)EgAgB8/3進(jìn)行了表達(dá)純化，為后續(xù)研究中EgAgB8/3的單克隆抗體的快速制備奠定了重要的基礎(chǔ)。Morel N等[14]嘗試針對(duì)成蟲分泌物制備單克隆抗體，盡管所建立的ELISA總體非常好，但仍然會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)。使用多克隆抗體作為捕獲抗體(產(chǎn)生最大敏感性)、單克隆抗體作為檢測(cè)抗體(產(chǎn)生最強(qiáng)特異性)可以提高糞抗原ELISA的敏感性和特異性，確保試劑盒的穩(wěn)定性[5]。劉原源等[10]在細(xì)粒棘球絳蟲中得到一個(gè)新的基因命名為EdiagA864，通過制備該蛋白的單克隆抗體和多克隆抗體所建立的糞抗原雙抗體夾心ELISA，特異性較強(qiáng)、敏感性較高、重復(fù)性較好，與犬賈第蟲(Giardiacanis)和犬蛔蟲(Toxocaracanis)樣品均無交叉反應(yīng)。使用表面糖蛋白/聚糖可能比用粗分泌抗原免疫制備單克隆或多克隆抗體更有效[5]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，由于蟲體表膜的分子組分不斷更新，用以逃避宿主的免疫攻擊，因此蟲體表膜抗原是診斷抗原的研究熱點(diǎn)。吐爾遜等[15]首次以成蟲表膜蛋白作為標(biāo)志物，建立的雙抗體夾心ELISA法可檢測(cè)到感染后13 d后的細(xì)粒棘球絳蟲，該方法具有敏感性高和特異性強(qiáng)，不與多頭帶絳蟲和泡狀帶絳蟲發(fā)生交叉反應(yīng)；并且該表膜抗原不屬于階段特異性抗原。Java L M等[16]基于抗細(xì)粒棘球絳蟲可溶性膜抗原的多克隆抗體，開發(fā)出的ELISA的敏感性為96.1%、特異性為98.2%，與其他寄生蟲無交叉反應(yīng)，是迄今為止特異性和敏感性最高的試劑盒。吳小霞等[17]以多房棘球絳蟲成蟲可溶性抗原免疫新西蘭兔得到的多克隆抗體作為檢測(cè)抗體，單克隆抗體作為包被抗體研制的試劑盒，靈敏性較好，可在犬感染72 h～6 d后檢測(cè)到多房棘球絳蟲糞抗原。李雙男[18]通過收集細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴感染犬后不同時(shí)間的犬糞，利用蛋白質(zhì)組學(xué)、生物信息學(xué)等方法初步篩選了大量特異性診斷靶標(biāo)分子，有待進(jìn)一步驗(yàn)證，以期尋求更好的棘球絳蟲糞抗原檢測(cè)靶抗原。

2.2 斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Dot-ELISA)是一種檢測(cè)抗原或抗體的固相診斷方法，廣泛用于人和動(dòng)物感染性疾病的診斷[19]。Dot-ELISA和常規(guī)ELISA的反應(yīng)原理基本一致，差別在于反應(yīng)發(fā)生的固相載體不同。Dot-ELISA采用硝酸纖維素膜作為固相載體，ELISA采用聚丙乙烯板作為反應(yīng)載體，因此Dot-ELISA除常規(guī)ELISA快速、特異的優(yōu)點(diǎn)外，還有可常溫保存、不需要儀器、可肉眼直接觀察結(jié)果等特點(diǎn)，方便了操作者對(duì)陽性樣品的判斷，操作簡(jiǎn)單，加上良好的工作性能，極易推廣到基層檢疫工作中[20]。

高珺珊等[21]針對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲EdiagA864抗原制備的多克隆抗體和單克隆抗體建立的Dot-ELISA，具有較強(qiáng)的特異性和敏感性，與犬蛔蟲和賈第蟲陽性糞便無交叉反應(yīng)，可用于臨床檢測(cè)。

2.3 金標(biāo)試紙條

免疫膠體金快速診斷技術(shù)是將層析分析技術(shù)、膠體金標(biāo)記技術(shù)和免疫檢測(cè)技術(shù)有機(jī)的結(jié)合到一起，以膠體金自身顯色結(jié)合抗原抗體特異性反應(yīng)而達(dá)到檢測(cè)目標(biāo)的免疫標(biāo)記技術(shù)[8]。與常規(guī)ELISA和Dot-ELISA相比，免疫膠體金不需要按照常規(guī)方法進(jìn)行封閉、一抗二抗的孵育、底物顯色這些耗時(shí)而繁瑣的步驟，無需專業(yè)人員操作，也不需要特定的儲(chǔ)存條件。隨著抗體技術(shù)的成熟，免疫膠體金技術(shù)逐漸得到了完善和發(fā)展，已被廣泛應(yīng)用。高珺珊等[20]以標(biāo)記純化的抗EdiagA864單克隆抗體制備金標(biāo)抗體，檢測(cè)線包被抗EdiagA864多克隆抗體，質(zhì)控線包被羊抗鼠抗體制備了細(xì)粒棘球絳蟲檢測(cè)膠體金試紙條，該試紙條具有良好的穩(wěn)定性和特異性、無交叉反應(yīng)、重復(fù)性好，可用于犬細(xì)粒棘球絳蟲的臨床檢測(cè)及大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查。

隨著該技術(shù)的不斷發(fā)展，糞抗原檢測(cè)方法也在不斷完善中。首先，通過篩選一些特異性重組抗原，來代替之前的粗抗原，并使用混合檢測(cè)方法可顯著提高特異性和敏感性[10]。再者，由于表膜蛋白量大、易提取，因此蟲體表膜抗原也有希望成為棘球絳蟲檢測(cè)的理想抗原之一。近幾年，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展和應(yīng)用，依賴于蛋白質(zhì)組學(xué)的分子標(biāo)記也逐漸引入到寄生蟲病的診斷研究中，將有助于利用棘球絳蟲的生物學(xué)特性尋找診斷抗原[1,22]。常規(guī)ELISA、Dot-ELISA和膠體金試紙條法各有優(yōu)勢(shì)，通過對(duì)已在國(guó)內(nèi)上市使用的基于夾心ELISA、間接ELISA等技術(shù)開發(fā)的試劑盒評(píng)估，表明還需要進(jìn)一步完善這些試劑盒的性能[23]。其中，常規(guī)ELISA和Dot-ELISA都涉及多個(gè)操作步驟。在野外或者田間工作時(shí)，膠體金技術(shù)是一種簡(jiǎn)便易行的粗篩方法，其質(zhì)控問題很難量化，但隨著半定量膠體金試紙條的出現(xiàn)將克服量化的問題。另外，敏感性不高也是金標(biāo)技術(shù)存在的主要問題。

3 糞DNA檢測(cè)方法

由于感染棘球絳蟲的糞便中含有蟲卵或蟲體組織及碎片等，用糞便即可提取到寄生蟲的核酸，糞DNA-PCR檢測(cè)逐漸受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的青睞[23]。近年來，已有多種糞DNA-PCR應(yīng)用于棘球絳蟲感染終末宿主的檢測(cè)，包括常規(guī)PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)等。

任何一種方法，選擇適宜的分子靶標(biāo)是關(guān)鍵。為了獲得理想的靈敏度，靶標(biāo)DNA必須是片段較短、多拷貝或者是重復(fù)的序列。而線粒體在真核生物中大量存在，特異性強(qiáng)，具有較高的種間多態(tài)性[24]。通過對(duì)絳蟲線粒體基因組序列的比較分析，發(fā)現(xiàn)線粒體NADH脫氫酶基因(nad)序列的種間序列差異大于細(xì)胞色素氧化酶基因(cox)序列，表明線粒體nad進(jìn)化較快，差異更大；12個(gè)線粒體基因編碼的基因中cox1基因最為保守，而nad5變異率最大，種間變異達(dá)到42.7%，nad4、atp6(ATP酶亞基6基因)、nad6基因進(jìn)化較快，因此糞DNA-PCR診斷方法主要以nad基因序列為靶標(biāo)[24-25]。

3.1 常規(guī)PCR

基于細(xì)粒棘球絳蟲G1基因型的HaeⅢ重復(fù)序列和nad1建立的兩種PCR已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于流行病學(xué)調(diào)查[2,26]。最新開發(fā)的基于線粒體nad6基因檢測(cè)犬感染細(xì)粒棘球絳蟲的糞DNA-PCR，靈敏度和特異性都很高，而且在感染后的第13天就可檢測(cè)出，該方法可用于犬感染細(xì)粒棘球絳蟲的早期診斷[23]。

3.2 其他PCR

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，常規(guī)的PCR已經(jīng)不能滿足于不同的需求，多種PCR，如實(shí)時(shí)熒光定量PCR、多重PCR(multiplex PCR)、套式PCR(Nested PCR)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-RFLP)等被逐漸開發(fā)和應(yīng)用[23]。

3.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 與常規(guī)PCR相比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR的優(yōu)勢(shì)在于高敏感性和高特異性，可對(duì)樣本中的DNA進(jìn)行定量評(píng)估[5,27]。Knapp等基于線粒體rrnL基因(核糖體RNA大亞基，16S)開發(fā)了一種qPCR方法，可檢測(cè)和定量評(píng)估狐貍糞便中釋放的多房棘球絳蟲DNA[28]。?ines等比較了3種不同的qPCR，并與多重PCR相比，qPCR的敏感性顯著提高[29]。Maksimov P等以細(xì)粒棘球絳蟲(G1-G3)和馬棘球絳蟲(G4)cox1基因、奧氏棘球絳蟲(G5)nad5和加拿大棘球絳蟲(G6-8，G10)cox3基因開發(fā)了一種可以從糞便中鑒定和區(qū)分這些種/基因型的qPCR[30]。Isaksson等針對(duì)多房棘球絳蟲nad1基因和rrnS基因(核糖體RNA小亞基)設(shè)計(jì)了一種半自動(dòng)磁捕獲探針DNA提取方法和實(shí)時(shí)水解探針聚合酶鏈反應(yīng)測(cè)定法(MC-PCR)，用于檢測(cè)赤狐糞便樣本中的多房棘球絳蟲DNA，該方法具有超過88%的敏感性和99.9%特異性[30]。這項(xiàng)研究描述了一種從狐貍糞便中富集和提取多房棘球絳蟲DNA的新方法，即富集多房棘球絳蟲的DNA，以最大限度地減少由于糞便中的抑制物質(zhì)的存在而對(duì)敏感性造成的影響。Riahi以線粒體rrnL(核糖體RNA大亞基)基因和nad4基因建立了一種qPCR來評(píng)估終末宿主中細(xì)粒棘球絳蟲的荷蟲量，在感染后第2～4周未檢測(cè)到qPCR信號(hào)，表明犬糞便中未排出蟲卵，從感染后第5周開始，觀察到反應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度增加，在第7周達(dá)到最大值，這與已知的犬腸道細(xì)粒棘球絳蟲的發(fā)育階段一致[28]。

3.2.2 多重PCR Trachsel D等[29]針對(duì)nad1、cox1、rrnS的部分基因序列設(shè)計(jì)引物，建立的多重PCR可以檢測(cè)到單個(gè)絳蟲卵，可鑒別檢測(cè)細(xì)粒棘球絳蟲、多房棘球絳蟲和絳蟲屬其他絳蟲的混合感染。Liu C N等[30]根據(jù)nad1、nad5和cox1基因的序列設(shè)計(jì)細(xì)粒棘球絳蟲、多房棘球絳蟲和石渠棘球絳蟲的特異性引物建立了多重PCR，能夠檢測(cè)從犬糞便樣本中提取的蟲體DNA，特異性為100%，敏感性較好，可檢測(cè)到感染后第17天的多房棘球絳蟲和第26天的細(xì)粒棘球絳蟲[31]。針對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲atp6、多房棘球絳nad1和加拿大棘球絳蟲rrnL所建立的多重PCR，在快速診斷和大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查方面具有優(yōu)勢(shì)，是一種很有前景的臨床檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查監(jiān)測(cè)工具。雖然多重PCR可以實(shí)現(xiàn)多基因同時(shí)檢測(cè)，但由于多對(duì)引物之間的干擾，導(dǎo)致檢測(cè)的敏感性下降[32]。

3.2.3 套式PCR Dinkel、Casulli和岳進(jìn)巧等以rrnS為靶標(biāo)序列建立了可用于檢測(cè)棘球絳蟲的套式PCR。由于套式PCR方法需要經(jīng)過兩次擴(kuò)增，因此，與常規(guī)PCR相比，其特異性和敏感性都顯著提高[32-34]。

3.2.4 PCR-RFLP 為了從帶有絳蟲卵的犬糞便樣品中鑒定和區(qū)分細(xì)粒棘球絳蟲，Hidalgo A等提出了聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和多態(tài)性限制性片段(RFLP)組合的策略，針對(duì)rrnS設(shè)計(jì)一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后用特定的核酸內(nèi)切酶對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行切割，再通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，該方法特異性和敏感性都較好，易于識(shí)別細(xì)粒棘球絳蟲的感染，是一種進(jìn)行犬棘球絳蟲感染流行病學(xué)調(diào)查的有效方法[35]。

3.2.5 新型PCR 微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)技術(shù)屬于第3代PCR技術(shù)，是基于油包水乳化微滴技術(shù)的單分子目標(biāo)基因PCR擴(kuò)增絕對(duì)定量技術(shù)[36]。該技術(shù)既能對(duì)病原體定性，又能對(duì)病原體DNA或RNA序列進(jìn)行絕對(duì)定量(敏感性和準(zhǔn)確性比qPCR高)，已廣泛應(yīng)用于病毒性疾病、細(xì)菌性疾病、寄生蟲病等多個(gè)領(lǐng)域[36]。Bago F等針對(duì)多房棘球絳蟲rrnS開發(fā)了ddPCR，并結(jié)合磁捕獲提取法對(duì)狐貍糞便的核酸進(jìn)行提取，靈敏度為90.51%，與qPCR相比靈敏度顯著提高[37]。ddPCR作為診斷不同犬科種群中多房棘球絳蟲流行率以及個(gè)體動(dòng)物感染強(qiáng)度的高通量方法顯示出很強(qiáng)的潛力，為棘球絳蟲在野生犬科動(dòng)物中的分布情況提供有價(jià)值的流行病學(xué)數(shù)據(jù)，有望成為常規(guī)PCR或宏觀方法的替代方法[37]。

3.3 LAMP

常規(guī)PCR或熒光定量PCR等都需要依賴相對(duì)復(fù)雜昂貴的PCR儀或熒光定量PCR儀，只適用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，不適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)[20]。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)作為一種新興的技術(shù)，不需要借助昂貴復(fù)雜的儀器設(shè)備和電泳分析過程，可快速的診斷/鑒定病原體，在寄生蟲領(lǐng)域表現(xiàn)出理想的靈敏度和特異性，其發(fā)展前景廣闊。其檢測(cè)過程只需要把處理好的樣本和LAMP相關(guān)試劑一起65 ℃水浴，1 h后就能通過肉眼觀察結(jié)果。

陳璐等[38]以nad2基因設(shè)計(jì)引物建立了LAMP方法并與普通PCR進(jìn)行了比較，靈敏度比普通PCR高出103倍，特異性較好，能夠同時(shí)鑒別多房棘球絳蟲和細(xì)粒棘球絳蟲感染，而且與其他寄生蟲無交叉反應(yīng)[22]。徐祥珍等[39]以細(xì)粒棘球絳蟲rrnS基因建立的LAMP方法敏感性和特異性都較好。倪興維[22]以線粒體nad5基因?yàn)榘袠?biāo)分子，分別建立了可用于檢測(cè)細(xì)粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲終末宿主感染的LAMP方法，特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，與犬科動(dòng)物其他常見絳蟲之間均無交叉反應(yīng)。該LAMP方法在多房棘球絳蟲感染后第12天即可檢出，在細(xì)粒棘球絳蟲感染后第22天即可檢出，均比PCR方法靈敏，可用于棘球絳蟲感染犬早期診斷[22]。張艷艷等[40]針對(duì)cox2基因建立的LAMP診斷技術(shù)，具有良好的特異性，靈敏度是常規(guī)PCR的103倍，對(duì)犬糞中細(xì)粒棘球絳蟲DNA檢測(cè)結(jié)果顯示，LAMP、常規(guī)PCR和糞抗原ELISA檢測(cè)結(jié)果相同。Avila H J等[41]針對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲廣義種cox1開發(fā)了一種新的LAMP檢測(cè)方法LAMP EGSL，用于在終末宿主同時(shí)檢測(cè)細(xì)粒棘球絳蟲、奧氏棘球絳蟲和加拿大棘球絳蟲，顯示出較高的靈敏性(10 fg～100 fg DNA)，且與宿主或其他蠕蟲DNA無交叉反應(yīng)。LAMP EGSL是棘球絳蟲終末宿主犬診斷的潛在工具，可用于終末宿主的分子流行病學(xué)調(diào)查研究。

3.4 RAA

LAMP技術(shù)也存在一些缺點(diǎn)，一方面對(duì)引物要求較高，理想引物的篩選耗時(shí)耗力；另一方面LAMP所獲得的產(chǎn)物是一些大小不等的片段，無法進(jìn)行克隆和測(cè)序驗(yàn)證，僅能用于判斷是否存在目的基因，且LAMP反應(yīng)的高靈敏性極易受到氣溶膠污染而產(chǎn)生假陽性結(jié)果[42]。相對(duì)于LAMP法，重組酶介導(dǎo)鏈替換核酸擴(kuò)增技術(shù)(recombinase-aided isothermal amplification assay/recombinase polymerase amplification assay,RAA/RPA)擴(kuò)增反應(yīng)僅需1對(duì)引物，且所需時(shí)間短，更能滿足快速簡(jiǎn)便的需求。周鴻讓等[42-43]分別以多房棘球絳蟲和細(xì)粒棘球絳蟲線粒體基因序列作為靶標(biāo)所建立的RAA方法可在40 min內(nèi)分別擴(kuò)增多房棘球絳蟲和細(xì)粒棘球絳蟲目的基因片段。該方法簡(jiǎn)便快捷，對(duì)儀器設(shè)備要求較低，37 ℃恒溫條件下可完成反應(yīng)。由于不受復(fù)雜儀器使用的制約，適合大量樣品快速檢測(cè)，特別是在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中顯示出較大優(yōu)越性[43-44]。周鴻讓等[44]又建立了一種同時(shí)檢測(cè)細(xì)粒棘球絳蟲(G1)和多房棘球絳蟲的多重核酸等溫?cái)U(kuò)增方法，可在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增兩種棘球絳蟲的基因組DNA，敏感性和特異性均較好，無交叉反應(yīng)，且檢測(cè)結(jié)果與PCR一致。張學(xué)勇等[45]基于RAA建立了一種能夠檢測(cè)出模擬犬糞樣本和現(xiàn)場(chǎng)狐貍糞便樣本中的陽性樣品(不能擴(kuò)增出其他大部分絳蟲)，其結(jié)果與單一PCR檢測(cè)結(jié)果完全一致。

綜上所述，使用糞DNA-PCR檢測(cè)方法主要有兩個(gè)關(guān)鍵因素，一是取決于提取的DNA的質(zhì)量和糞便樣本中抑制劑的去除；二是分子診斷方法的開發(fā)和改進(jìn)。首先，為了提高檢測(cè)方法的便捷性新技術(shù)不斷得到應(yīng)用，如LAMP、RPA/RAA等，其檢測(cè)不需要昂貴的儀器，而且在較短時(shí)間內(nèi)，就可以得到結(jié)果并且直接通過肉眼觀察結(jié)果，可對(duì)野外流行病學(xué)調(diào)查提供便捷；其次，為了提高檢測(cè)通量，采取在同一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增多種棘球絳蟲策略；為了提高檢測(cè)結(jié)果的可靠性，多采取不同種糞DNA-PCR檢測(cè)方法相結(jié)合，發(fā)揮每種方法的優(yōu)點(diǎn)，如開發(fā)出一種多重套式PCR分析靶向線粒體cox1基因，區(qū)分狐貍糞便中的多房棘球絳蟲和石渠棘球絳蟲，并與PCR-RFLP進(jìn)行了比較，多重套式PCR顯示出比PCR-RFLP更高的效率。

4 小結(jié)與展望

Jercic M I等[46]比較了阿根廷、智利、秘魯和烏拉圭等國(guó)家參考實(shí)驗(yàn)室犬糞便細(xì)粒棘球絳蟲的PCR和ELISA的檢測(cè)性能，結(jié)果均表明這兩種技術(shù)性能較差，敏感性和特異性較低。就針對(duì)目前的現(xiàn)狀而言，棘球絳蟲感染終末宿主糞便的檢測(cè)方法仍存在一系列問題：評(píng)價(jià)檢測(cè)方法時(shí)糞便樣品數(shù)量是否足夠多，否則結(jié)果具有一定的偶然性；荷蟲量小于50條～100條的低感染可能會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果，而且目前定量檢測(cè)方法不夠成熟；糞抗原ELISA和糞DNA-PCR的結(jié)果之間符合率較低；目前大部分檢查方法都需要繁瑣的步驟或者昂貴的儀器或者專業(yè)人員的操作，不利于在臨床上應(yīng)用。因此，不僅要對(duì)檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步的試驗(yàn)優(yōu)化和現(xiàn)場(chǎng)評(píng)價(jià)，還需要開發(fā)更加敏感、特異、簡(jiǎn)單快捷的檢測(cè)方法。截止目前，在實(shí)際工作中，對(duì)犬進(jìn)行大規(guī)模檢測(cè)最實(shí)用、成本最低的策略是使用糞抗原ELISA對(duì)所有樣品進(jìn)行初步檢測(cè)，然后結(jié)合使用糞DNA-PCR等進(jìn)行補(bǔ)充，確認(rèn)檢測(cè)結(jié)果。

隨著基因組學(xué)、蛋白組學(xué)等多組學(xué)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，為篩選理想的診斷分子靶標(biāo)提供了可能。同時(shí)，也要綜合考慮棘球絳蟲本身的發(fā)育特點(diǎn)，即蟲卵、孕節(jié)、成蟲期的生物學(xué)特性，從而尋找突破口。隨著免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，檢測(cè)技術(shù)必將會(huì)日趨完善，新技術(shù)也會(huì)如雨后春筍涌現(xiàn)。這些檢測(cè)方法的不斷涌現(xiàn)，對(duì)最終解決終末宿主棘球絳蟲感染的診斷有重要的指導(dǎo)意義。