劉棟輝,郭夢(mèng)嬌,張 昊,譚惠惠,靳逸昆,張小榮,吳艷濤

(揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009)

副雞禽桿菌(Avibacteriumparagallinarum，Apg)最早于20世紀(jì)30年代被報(bào)道，之前被稱為副雞嗜血桿菌，2005年Blaclall P J將其重新命名為副雞禽桿菌[1]。感染副雞禽桿菌會(huì)引起一種雞的急性上呼吸道疾病——傳染性鼻炎(Infectious coryza,IC)。一般情況下該病的潛伏期較短、發(fā)病急且傳染性強(qiáng)，病死率低。但與其他病原如支原體、傳染性支氣管炎病毒、腺病毒等發(fā)生混合感染時(shí)，病死率會(huì)顯著升高[2-3]，給養(yǎng)殖場(chǎng)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。

1 副雞禽桿菌的病原特性

1.1 病原簡(jiǎn)介

副雞禽桿菌為革蘭氏陰性短桿菌，無(wú)鞭毛，其毒力菌株常常存在莢膜結(jié)構(gòu)。該菌為兼性厭氧菌，液體環(huán)境培養(yǎng)時(shí)無(wú)需補(bǔ)充CO2，但在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)需提供厭氧環(huán)境或體積分?jǐn)?shù)為3%～10%的CO2。其生長(zhǎng)繁殖速度較慢，營(yíng)養(yǎng)需求較高，在普通培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)，體外培養(yǎng)時(shí)一般需要添加V因子，但也存在非V因子依賴的副雞禽桿菌菌株[4]。固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)24 h形成針尖大、圓形、灰白色半透明的菌落。在血瓊脂上與金黃色葡萄球菌交叉劃線培養(yǎng)，可以觀察到“衛(wèi)星現(xiàn)象”。在臨床分離細(xì)菌時(shí)需要注意，副雞禽桿菌對(duì)外界環(huán)境抵抗力不強(qiáng)，因此現(xiàn)場(chǎng)采集的病料要盡快進(jìn)行細(xì)菌分離，否則可能無(wú)法分離到活菌。

1.2 分型方法

最初Page采用玻板凝集方法將副雞禽桿菌分為A、B、C 3個(gè)血清型。后有研究表明，通過血凝抑制試驗(yàn)(hemagglutination inhibition,HI)進(jìn)行副雞禽桿菌的Page分型更為有效[5]。雖然也出現(xiàn)部分分離株無(wú)法分型的情況，但Page分型方案仍是目前應(yīng)用最廣的副雞禽桿菌血清學(xué)分型方案。Kume等進(jìn)一步通過血凝抑制試驗(yàn)將副雞禽桿菌分出Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 共3個(gè)血清群9種血清型，并將其與Page方案對(duì)應(yīng)，劃分出A1、A2、A3、A4、B1、C1、C2、C3和C4共9個(gè)血清型，但由于其過程繁瑣、試驗(yàn)條件較苛刻，所以應(yīng)用范圍較窄[6]。在對(duì)微生物的研究中，基于DNA的分子生物學(xué)分型方法更為便捷。一些研究也對(duì)副雞禽桿菌的基因分型方法進(jìn)行了探索，Sakamoto R等[7]提出以副雞禽桿菌的hmtp210基因的高變區(qū)為靶標(biāo)，使用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RPLP)和多重PCR(multiplex PCR,mPCR)方法來(lái)進(jìn)行分型，但這兩種方法在之后的研究中被證明并不可靠，不能用來(lái)代替Page或Kume分型方案[8]。之后Tan D H等[9]通過分析副雞禽桿菌hmtp210基因序列和血清型之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，使用hmtp210基因的部分序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析,可以用來(lái)區(qū)分A、B、C 3種血清型，該研究為開發(fā)與副雞禽桿菌血清學(xué)分型相對(duì)應(yīng)的分子分型方法提供了新方案。

1.3 鑒別診斷

在診斷傳染性鼻炎時(shí)，除了進(jìn)行病原菌的分離培養(yǎng)及生化特性鑒定外，目前廣泛使用陳小玲等[10]建立的PCR鑒定方法(HPG2-PCR)進(jìn)行診斷。錢琳娜等[11]開發(fā)了針對(duì)雞毒支原體(Mycoplasmagallisepticum，MG)、滑液囊支原體(Mycoplasmasynovium，MS)和副雞禽桿菌的三重PCR，通過測(cè)試表明,其建立的三重PCR診斷技術(shù)具有良好的特異性和較高的靈敏性，可用于臨床上對(duì)這幾種常見的雞呼吸道疾病的鑒別診斷。Clothier K等[12]在HPG2-PCR的基礎(chǔ)上，開發(fā)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR)方法用于樣品的快速檢測(cè)，該方法靈敏度高、特異性好，最低檢出率為10 CFU/mL。梅晨等[13]原核表達(dá)了副雞禽桿菌的血凝素蛋白HMTP210中保守的P9片段，并以該蛋白為抗原開發(fā)了一種間接ELISA檢測(cè)方法，該方法可以檢測(cè)出3個(gè)血清型的副雞禽桿菌的陽(yáng)性雞血清，并且在測(cè)試中與其他禽病的病原體抗血清無(wú)交叉反應(yīng)。

1.4 毒力因子

1.4.1 血凝素蛋白 血凝素蛋白是副雞禽桿菌重要的一種免疫保護(hù)性抗原，相應(yīng)的血凝抑制抗體水平也被作為評(píng)價(jià)傳染性鼻炎疫苗免疫保護(hù)效果的重要指標(biāo)。有研究認(rèn)為外膜蛋白HagA是副雞禽桿菌的血凝素蛋白[14]。但進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，雖然重組HagA蛋白表現(xiàn)出血凝活性，但并不存在血清特異性，不同血清型菌株間的HagA蛋白編碼基因同源性在95%以上。使用相應(yīng)的單克隆抗體或全菌多克隆抗體也不能使該蛋白出現(xiàn)血凝抑制，且對(duì)致病菌株的免疫保護(hù)效果中等[15]。因此認(rèn)為HagA蛋白可能只是一種副雞禽桿菌的普遍抗原，并不是主要誘導(dǎo)產(chǎn)生血凝素抑制抗體的血凝素蛋白，而其表現(xiàn)出的血凝性可能是由于該蛋白具有與細(xì)菌黏附定植有關(guān)的功能而與紅細(xì)胞產(chǎn)生的交叉反應(yīng)。而HMTP210蛋白已被證實(shí)是副雞禽桿菌的血凝素蛋白，該蛋白是與細(xì)菌的生物被膜形成和黏附宿主細(xì)胞有關(guān)的一種黏附素，主要以三聚體形式存在。缺失了hmtp210基因的副雞禽桿菌菌株失去了血凝活性且不能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生血凝抑制抗體[16]。不同血清型的HMTP210中間部位存在一段高變區(qū)，而上、下游序列高度同源，這提示該蛋白的高變區(qū)可能與菌株的血清特異性相關(guān)。

1.4.2 內(nèi)源性質(zhì)粒 質(zhì)粒是獨(dú)立于細(xì)菌基因組之外的攜帶遺傳信息的環(huán)狀DNA分子，可以攜帶耐藥基因或其他功能元件，使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性等，是影響細(xì)菌毒力的重要因素。2007年，Hsu Y M等[17]從副雞禽桿菌分離株中鑒定了一種耐藥性相關(guān)質(zhì)粒pYMH5。該質(zhì)粒攜帶sulⅡ、strA、mbeCy、aphAⅠ4個(gè)耐藥基因。質(zhì)粒上還可能攜帶著某些特殊基因，對(duì)菌株的生長(zhǎng)特性或者毒力產(chǎn)生影響。Terry T D等[18]在當(dāng)?shù)胤蛛x株中發(fā)現(xiàn)一種大小為6.29 kb質(zhì)粒p250。該質(zhì)粒上有一個(gè)細(xì)菌素產(chǎn)生位點(diǎn)，且與流感嗜血桿菌的相關(guān)基因高度同源。Hsu Y M等[17]還檢測(cè)到另一種質(zhì)粒pA14，該質(zhì)?？梢跃幋aMglA蛋白和RNase Ⅱ，推測(cè)與副雞禽桿菌的毒力有關(guān)。

1.4.3 其他毒力因子 隨著研究的深入，副雞禽桿菌的其他毒力因子被不斷鑒定和分析，如莢膜、菌毛蛋白、脂多糖、RTX(repeats-in-toxins)毒素等。副雞禽桿菌強(qiáng)毒株均具有莢膜，但在傳代過程中會(huì)失去莢膜形成能力，從而導(dǎo)致菌株毒力降低，不能引起傳染性鼻炎特征性癥狀。Liu C C等[19]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)lfA重組蛋白作為傳染性鼻炎的亞單位疫苗對(duì)相應(yīng)野生型菌株有一定的保護(hù)作用，研究中構(gòu)建的菌毛蛋白編碼基因flfA缺失株的毒力也顯著低于野生型。Küng E等[20]報(bào)道了一種在副雞禽桿菌中常見的RTX毒素AvxA，該種毒素蛋白會(huì)導(dǎo)致宿主細(xì)胞和組織發(fā)生損傷，并破壞機(jī)體的防御功能[21]，該毒素可能與副雞禽桿菌定植呼吸道后引起的機(jī)體損傷有關(guān)。

2 流行情況

傳染性鼻炎一年四季都可發(fā)生，季節(jié)更替時(shí)多發(fā)。以育成雞和產(chǎn)蛋雞發(fā)病較多，此外還有關(guān)于野雞和鵪鶉等感染發(fā)病的報(bào)道。該病目前在中國(guó)、美國(guó)、墨西哥以及南非等世界各地均有報(bào)道[22-23]，近年來(lái)，我國(guó)多個(gè)地區(qū)的發(fā)病率也呈上升趨勢(shì)。龔玉梅等[24]的報(bào)道顯示，在2012年-2017年6年間從我國(guó)各地送檢病料中分離的45株副雞禽桿菌中，主要流行的副雞禽桿菌為B血清型，有30株分離株；其次為A血清型，有15株分離株；未檢測(cè)到C血清型。冀笑明等[25]在2018年-2019年對(duì)山東、河南、河北及江蘇等地的發(fā)病雞群進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定中，共分離得到87株副雞禽桿菌。其中包括血清A型20株、血清B型57株、血清C型10株，這表明副雞禽桿菌在我國(guó)的暴發(fā)和流行愈發(fā)嚴(yán)重，且A、B、C 3種血清型的副雞禽桿菌在我國(guó)均有流行，B血清型與之前的流行情況類似，依然是國(guó)內(nèi)主要流行株。趙怡等[26]的調(diào)查結(jié)果顯示，2019年在其從各地分離到副雞禽桿菌的15組病料中，10組為A型菌感染，5組為C型。綜合來(lái)看，目前我國(guó)副雞禽桿菌流行態(tài)勢(shì)較之前有了一些變化，雖然我國(guó)目前仍然是3種血清型均有流行，但之前一直占主導(dǎo)地位的B血清型的發(fā)病率有所下降，而C血清型的發(fā)病率則在逐漸升高。

3 副雞禽桿菌病的防控方法

3.1 藥物治療

當(dāng)養(yǎng)殖場(chǎng)暴發(fā)傳染性鼻炎時(shí)，可使用抗菌藥物進(jìn)行治療。針對(duì)傳染性鼻炎治療效果較好的有磺胺類、四環(huán)素類以及鏈霉素等氨基糖苷類藥物，但是目前病菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性目前比較常見。因此在臨床治療時(shí)，需要對(duì)分離株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，從而確定最佳用藥方案。此外，需要注意藥物的用法用量及給藥時(shí)間：產(chǎn)蛋期不可使用磺胺類藥物[27]?？蛇m當(dāng)延長(zhǎng)藥物治療時(shí)間，以防傳染性鼻炎未被完全治愈，反復(fù)發(fā)作；同時(shí)為了避免病菌在治療過程中短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生耐藥性，可進(jìn)行穿梭用藥、輪換用藥等。

3.2 疫苗研究

3.2.1 滅活苗 疫苗防控是目前防控傳染性鼻炎的一種重要手段，常用的有二價(jià)苗和三價(jià)苗[28-29]。由于不同血清型之間交叉保護(hù)效果較差，并且我國(guó)3種血清型均流行，因此目前多應(yīng)用A、B、C 3個(gè)血清型的三價(jià)滅活疫苗進(jìn)行免疫[30]。如Gong等研制出副雞禽桿菌的油乳劑三價(jià)滅活疫苗，在兩次免疫后9個(gè)月，對(duì) A、B、C 3型副雞禽桿菌攻毒的保護(hù)率仍然不低于80%[31]。此外，也可聯(lián)合其他病原體制備多聯(lián)苗，如副雞禽桿菌二價(jià)或三價(jià)和雞毒支原體的二聯(lián)油乳劑滅活苗等。但副雞禽桿菌全菌滅活疫苗一方面培養(yǎng)成本較高，另一方面革蘭氏陰性菌中脂多糖、莢膜等菌體蛋白會(huì)引起機(jī)體副作用，加上滅活苗注射量較大，會(huì)進(jìn)一步加重疫苗的副作用[32]。

3.2.2 基因工程疫苗 基因工程疫苗的開發(fā)需要探究病原體的免疫保護(hù)抗原和毒力因子等，目前研究的主要有弱毒苗和亞單位疫苗。如Wang Y P等[16]構(gòu)建了hmtp210基因缺失株，并驗(yàn)證缺失株的毒力相比于野生型明顯降低。Tu T Y等[33]構(gòu)建了副雞禽桿菌莢膜形成相關(guān)基因hctA基因缺失株，并驗(yàn)證缺失株的毒力較野生型減弱。這些基因缺失株將來(lái)可以作為傳染性鼻炎的弱毒苗候選株。亞單位疫苗也是副雞禽桿菌基因工程疫苗研究的重點(diǎn)，Noro T等[34]表達(dá)的重組血凝素蛋白對(duì)同源菌株可產(chǎn)生100%的保護(hù)率。Sakamoto R等[35]將A型和C型副雞禽桿菌的HMTP210的高變區(qū)進(jìn)行融合表達(dá)，用該融合肽制備的疫苗接種35日齡SPF雞。攻毒結(jié)果顯示免疫雞不表現(xiàn)臨床癥狀，且接種部位無(wú)腫脹等不良反應(yīng)。趙成全等[36]根據(jù)副雞禽桿菌外膜蛋白GcbG研制的亞單位疫苗的保護(hù)率優(yōu)于全菌滅活疫苗，可達(dá)90%。Mei C等[37]發(fā)現(xiàn)副雞禽桿菌的外膜囊泡可為同種血清型提供較好的保護(hù)性，但對(duì)不同血清型交叉保護(hù)性較弱。這提示外膜囊泡可作為一種潛在的新型替代疫苗。

4 小結(jié)

副雞禽桿菌感染雞會(huì)引起傳染性鼻炎，對(duì)雞的生產(chǎn)性能會(huì)造成較大影響，如引起育成雞生長(zhǎng)不良、產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋下降等，若與其他病原如支原體、傳染性支氣管炎病毒等混合感染會(huì)造成更大的損失。近年來(lái)傳染性鼻炎發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，提高飼養(yǎng)管理水平、做好生物安全措施，再加上合理的疫苗接種是目前應(yīng)對(duì)傳染性鼻炎較為有效的防控手段，但仍需進(jìn)一步探究副雞禽桿菌的致病機(jī)制以及新型防控措施。