孫新城，許素月，李俠穎，趙成鑫,，胡旭陽(yáng)，胡金強(qiáng)高 輝,2,3，楊德良，白艷紅,2,3*，張曉根

(1.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州 450001；2.河南省冷鏈?zhǔn)称焚|(zhì)量安全與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450001；3.食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州 450001；4.長(zhǎng)安大學(xué)經(jīng)濟(jì)與管理學(xué)院，陜西西安710064)

隨著人們生活水平的提高，對(duì)于動(dòng)物蛋白的需求量也越來(lái)越大，使得畜牧行業(yè)開始向產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模轉(zhuǎn)型，發(fā)展過(guò)程中細(xì)菌性疾病的防治成了必須要解決的問(wèn)題[1]?？咕幬锸腔瘜W(xué)合成的一種抗菌類藥物，在畜牧生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)于細(xì)菌性疾病具有較好的預(yù)防和治療效果。然而抗菌藥物在畜牧養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)性且大批量的使用也逐漸的產(chǎn)生了很多問(wèn)題，例如細(xì)菌的耐藥性、腸道菌群破壞和抗菌藥物殘留等問(wèn)題，對(duì)養(yǎng)殖行業(yè)造成一定損失的同時(shí)，也嚴(yán)重威脅了人類的身體健康[2]。由于逐年累積的使用抗菌藥物，部分細(xì)菌產(chǎn)生了變異，原來(lái)的抗菌藥物不能再繼續(xù)發(fā)揮抑制細(xì)菌的作用，養(yǎng)殖業(yè)在面對(duì)新的變異細(xì)菌時(shí)不得不承受嚴(yán)重?fù)p失[3]。在動(dòng)物生長(zhǎng)的過(guò)程中如果添加抗菌藥物實(shí)現(xiàn)抗病力提高或促進(jìn)發(fā)育等目的，會(huì)極大的擾亂動(dòng)物本身的免疫調(diào)節(jié)能力，停止抗菌藥物的使用會(huì)對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)造成嚴(yán)重影響，并且對(duì)于后代繁衍以及養(yǎng)殖環(huán)境中的菌群平衡都有一定的影響[4]。通常情況下抗菌藥物在動(dòng)物體內(nèi)需要一定的時(shí)間才能夠完全代謝，如果時(shí)間不夠會(huì)使得抗菌藥物在肉類等農(nóng)產(chǎn)品中殘留，最終人類在食用之后對(duì)身體健康也會(huì)產(chǎn)生影響，抗菌藥物殘留是人們關(guān)注的食品安全健康問(wèn)題之一。

在抗菌藥物濫用問(wèn)題的背景下，噬菌體作為一種特異且安全的抑菌劑開始被研發(fā)人員所關(guān)注。噬菌體自身的基因組較小，但是在宿主菌中卻能產(chǎn)生較大的影響[5]。較小的基因組會(huì)使得研究應(yīng)用的時(shí)間大大縮短，操作過(guò)程更加簡(jiǎn)易，研發(fā)成本也會(huì)相應(yīng)降低。噬菌體本身來(lái)自于自然界，只是對(duì)特定的菌群產(chǎn)生反應(yīng)，對(duì)原本的生態(tài)菌群不會(huì)產(chǎn)生不利影響，是一種環(huán)境友好型的生物抗菌劑，十分迎合當(dāng)代人提倡的綠色無(wú)公害要求。另外，噬菌體會(huì)隨著細(xì)菌的突變自身也發(fā)生進(jìn)化，是一個(gè)自發(fā)且符合生態(tài)環(huán)境要求的過(guò)程，不會(huì)產(chǎn)生耐藥性等問(wèn)題[6]。噬菌體超強(qiáng)的特異性肯定了其安全性，不會(huì)在肉、蛋、奶等畜牧產(chǎn)品中殘留，即使人體食用，對(duì)腸道內(nèi)原本的益生菌也無(wú)侵染效果，所以噬菌體在畜牧養(yǎng)殖行業(yè)中應(yīng)用具有較大價(jià)值。

1 噬菌體概述

隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，對(duì)噬菌體的認(rèn)識(shí)越來(lái)越深入，有人把能夠侵襲真菌、藻類、細(xì)菌以及放線菌等微生物的病毒都稱為噬菌體。噬菌體廣泛存在于自然界的各種環(huán)境中，幾乎有細(xì)菌群落的地方就有噬菌體的存在，有數(shù)據(jù)估計(jì)地球上有1031個(gè)噬菌體[7]。噬菌體種類多種多樣，并且特異性極高，對(duì)于某一種或一類微生物有效，但是對(duì)于非目標(biāo)靶向的其他細(xì)菌或者人類是無(wú)毒且具有極高的安全性。噬菌體的分類方法也是多種多樣的，根據(jù)噬菌體侵染宿主時(shí)的表現(xiàn)分為偽溶原性、溶原性、裂解性和慢性感染4種類型[8]。噬菌體的核酸主要有DNA和RNA兩種，根據(jù)核酸的類型又可以分為單鏈RNA(ssRNA)、單鏈DNA(ssDNA)、雙鏈RNA(dsRNA)和雙鏈DNA(dsDNA)4種類型。另外，國(guó)際病毒命名委員會(huì)(ICNV)對(duì)噬菌體進(jìn)行了更加細(xì)致的分類，在15個(gè)科中大多數(shù)都是有尾噬菌體，根據(jù)尾部的結(jié)構(gòu)更深一步進(jìn)行了區(qū)分，其中短尾噬菌體占14%，長(zhǎng)尾噬菌體科占61%，肌尾噬菌體科占25%[9]。噬菌體的種類多種多樣并且長(zhǎng)度變化很大，目前發(fā)現(xiàn)的最短噬菌體24 nm，最長(zhǎng)的噬菌體200 nm，T4噬菌體是目前已知的最大的噬菌體。噬菌體的組成較為簡(jiǎn)單，幾乎都是由蛋白質(zhì)外殼和遺傳物質(zhì)核酸組成[10]。噬菌體的增殖包括吸附、侵入、生物合成、裝配和釋放五個(gè)階段，整個(gè)過(guò)程完全依賴宿主提供必需的物質(zhì)[11]。吸附是噬菌體侵染宿主的第一步，主要依靠蛋白外殼與宿主細(xì)胞外部蛋白特異性結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)，一旦特異性蛋白損壞宿主菌就具有了抵抗噬菌體的能力。侵入是通過(guò)噬菌體尾部釋放特定的溶菌酶將宿主菌的外膜破壞，然后噬菌體將遺傳物質(zhì)核酸注入到宿主菌的過(guò)程。生物合成是進(jìn)入到宿主菌的核酸通過(guò)宿主體內(nèi)的各種物質(zhì)合成自身的mRNA，然后進(jìn)一步合成早期的蛋白質(zhì)[12]。等噬菌體的各部件合成后就會(huì)進(jìn)行下一步裝配，將各種蛋白質(zhì)按照一定程序組裝在一起，大體分為4個(gè)階段：頭部裝配、尾部裝配、頭部與尾部裝配、長(zhǎng)尾絲裝配[13]。最終組裝好的噬菌體通過(guò)釋放內(nèi)溶素等物質(zhì)將宿主菌的細(xì)胞膜裂解，從而將子代噬菌體釋放出來(lái)。

2 噬菌體在畜禽幼齡期的應(yīng)用

幼齡培育是養(yǎng)殖行業(yè)中的重要環(huán)節(jié)，然而環(huán)境中的感染性細(xì)菌無(wú)處不在，主要的細(xì)菌為大腸埃希氏菌、沙門氏菌、空腸彎曲菌、金黃色葡萄球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌。一旦感染了細(xì)菌性疾病很容易造成幼齡期的動(dòng)物大量死亡，對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)造成較大損失。目前，研發(fā)人員已經(jīng)分別從養(yǎng)殖過(guò)程的各種環(huán)境中分離出多種多樣的噬菌體，采用不同的防治方法去對(duì)抗細(xì)菌性疾病，且在不同動(dòng)物的應(yīng)用過(guò)程中取得了較好的效果。

雛雞由于本身免疫系統(tǒng)不夠完全很容易被感染，感染后容易造成生長(zhǎng)遲緩，嚴(yán)重的會(huì)引起大量死亡，研發(fā)人員嘗試使用單一噬菌體或者混合噬菌體的方式對(duì)其進(jìn)行防治。劉功成[14]曾在1日齡的三黃雞日糧中添加了噬菌體，結(jié)果表明單一噬菌體能夠有效提升雛雞的成活率。Kim J H等[15]也是從1日齡的肉仔雞開始投喂含有混合噬菌體的飼料，飼養(yǎng)35 d后發(fā)現(xiàn)投喂了混合噬菌體的肉仔雞發(fā)育更好，并且有效抑制了致病菌的感染。曹忠贊等[16]使用噬菌體制劑對(duì)感染了沙門氏菌的雛雞進(jìn)行治療，結(jié)果表明在雛雞的肝和盲腸中致病菌的數(shù)量顯著減少，最終雛雞的肝和盲腸都恢復(fù)到了正常水平，由此可知在防治雛雞感染沙門氏菌時(shí)噬菌體有良好的抑菌效果。Kaikabo A A等[17]也曾采用殼聚糖包被噬菌體的方式對(duì)幼齡雞進(jìn)行治療，使得幼雞的死亡率降低了40%，并且發(fā)現(xiàn)殼聚糖包被使用噬菌體的方法能夠有效提升噬菌體在幼雞體內(nèi)的存活率。

在仔豬培育的初期，如果受到致病細(xì)菌的感染，會(huì)導(dǎo)致腹瀉、生長(zhǎng)受阻以及成活率降低等眾多不良現(xiàn)象，目前研究者已經(jīng)試驗(yàn)了多種噬菌體療法，并取得了較好成果。曾永娣等[18]曾經(jīng)嘗試給斷奶的仔豬飼料中添加噬菌體，并使用添加抗菌藥物的飼料作為對(duì)照，最后發(fā)現(xiàn)飼料中添加噬菌體的仔豬增重更多，并且腹瀉率大大降低，相比于添加抗菌藥物，噬菌體能夠有效提升仔豬腸道中益生菌的活性。Seo B J等[19]的研究表明，當(dāng)給28日齡的仔豬飼料中添加噬菌體雞尾酒后，仔豬受沙門氏菌感染的風(fēng)險(xiǎn)降低，并且仔豬本身的腸道益生菌活性并未受到影響。Cha S B等[20]給斷奶的仔豬投喂含有1 g/kg噬菌體的飼料，持續(xù)投喂1周后再用腸毒性大腸埃希氏菌進(jìn)行攻擊，最終發(fā)現(xiàn)投喂噬菌體的仔豬抵抗力有效加強(qiáng)，被腸毒性大腸埃希氏菌感染的幾率下降了約60%。

3 噬菌體在畜禽成長(zhǎng)過(guò)程中的應(yīng)用

在畜禽的成長(zhǎng)過(guò)程中如果被致病菌感染，對(duì)于動(dòng)物的后期發(fā)育以及后期繁殖都會(huì)造成很大的影響，極大的提升了養(yǎng)殖成本。研究人員從動(dòng)物的生存環(huán)境中篩選出具有特異性治療的有益噬菌體，致力于解決各種致病菌的生物防治。

豬在生長(zhǎng)過(guò)程被致病菌感染會(huì)對(duì)腸道菌群影響很大，對(duì)于飼料中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)難以吸收，產(chǎn)肉率會(huì)大大降低。Yan L等[21]曾在豬的生長(zhǎng)過(guò)程中持續(xù)飼喂了6周的噬菌體，最終檢測(cè)發(fā)現(xiàn)豬糞便中沙門氏菌的含量下降很多，并且對(duì)于飼料中的干物質(zhì)和氮源的吸收效果增強(qiáng)。另外Saez A C等[22]采用了微囊包裹噬菌體雞尾酒的方法放在飼料中對(duì)生長(zhǎng)豬進(jìn)行投喂，并且與灌喂的方法進(jìn)行了對(duì)比，數(shù)據(jù)顯示微囊包裹的方法效果更好，噬菌體雞尾酒有效的降低了生長(zhǎng)豬腸道中的沙門氏菌數(shù)量。

對(duì)于牛和羊等產(chǎn)奶類動(dòng)物，在養(yǎng)殖過(guò)程中極易被金黃色葡萄球菌等致病菌感染導(dǎo)致乳腺炎的發(fā)生，抗菌藥物并不能治療被生物膜包裹的致病菌，噬菌體卻能夠穿過(guò)生物膜并可以專一性的治療，是較為理想的治療方法。在奶山羊生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程中金黃色葡萄球菌會(huì)引起乳腺炎，Mishra A K等[23]曾經(jīng)分離出溶菌性噬菌體對(duì)奶山羊中的耐藥性金黃色葡萄球菌進(jìn)行了治療，結(jié)果表明在30 ℃和40 ℃時(shí)噬菌體穩(wěn)定并且裂解效果極好。冀亞路等[24]從污水中分離出一種裂解金黃色葡萄球菌的噬菌體，該噬菌體具有較強(qiáng)的殺菌能力，并且具有較寬的宿主譜(64%)，可以用于治療患有乳腺炎的奶牛。Varla-Oritz D F等[25]從患有隱形乳房炎癥的奶牛牛乳中篩選出裂解性噬菌體，數(shù)據(jù)顯示牛乳中的36株金黃色葡萄球菌種大多數(shù)都對(duì)抗菌藥物具有耐藥性，而經(jīng)噬菌體裂解后被殺死的幾率是百分百。

4 噬菌體在肉制品加工中的應(yīng)用

人們生活品質(zhì)的不斷提升，對(duì)肉、蛋、奶等食品的需求量越來(lái)越大，在大規(guī)模生產(chǎn)這些食品的同時(shí)預(yù)防食源性致病菌的問(wèn)題也日益嚴(yán)重，近年來(lái)報(bào)道的大腸埃希氏菌、沙門氏菌、李斯特菌等致病菌污染的事件造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)對(duì)食用者的安全也存在威脅[26]。研究人員嘗試著從養(yǎng)殖過(guò)程，肉制品生產(chǎn)過(guò)程、保藏運(yùn)輸和銷售等不同時(shí)期利用噬菌體進(jìn)行生物防治，取得了較為理想的效果。

牛肉因?yàn)槠涓叩鞍椎椭镜奶攸c(diǎn)被人們廣泛食用，然而被沙門氏菌等致病菌污染的牛肉被食用后，會(huì)將感染食用人群，因此預(yù)防牛肉感染成為了必須要解決的食品安全問(wèn)題。David等曾嘗試用噬菌體雞尾酒達(dá)到給牛肉滅菌的效果，結(jié)果顯示噬菌體雞尾酒的效果優(yōu)于單一噬菌體，并且在4 ℃的環(huán)境中儲(chǔ)存6 d后仍然有很好的滅菌效果[27]。聶若男等[28]篩選出一株裂解性噬菌體，將該噬菌體用于牛肉中鼠傷寒沙門氏菌的防治，在4 ℃和25 ℃兩種條件下進(jìn)行了抑菌測(cè)試，在兩種溫度下牛肉中鼠傷寒沙門氏菌的感染率均降低，表明篩選的噬菌體對(duì)牛肉中鼠傷寒沙門氏菌具有良好的抑菌效果。

中國(guó)作為一個(gè)肉制品消費(fèi)大國(guó)，除了牛肉外對(duì)于其他生鮮類的肉制品也是需求量巨大。在生鮮肉的抑菌防治過(guò)程中，生鮮肉與噬菌體的接觸面積對(duì)于抑菌效果的影響較大，接觸面積越小效果越理想。Sharma C S等[29]使用切碎的火雞肉和整塊的火雞肉做了對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)整塊火雞肉的噬菌體抑菌效果要明顯優(yōu)于切碎的火雞肉，分析原因是切碎后表面積增大使得細(xì)菌與噬菌體的接觸幾率降低。但是Yeh Y等的試驗(yàn)結(jié)果也證明了噬菌體對(duì)于碎肉有抑菌效果，他們將碎肉與噬菌體和致病菌混合揉滾2 h后放于4 ℃的環(huán)境中冷藏，數(shù)據(jù)表明顯著抑菌的時(shí)間可持續(xù)6 h[30]。另外，在一些即食食品中噬菌體同樣有較好的殺菌效果。Chang Y等[31]曾使用噬菌體產(chǎn)生的內(nèi)溶素用于火腿樣品，數(shù)據(jù)顯示在15 min內(nèi)的抑菌效果較好。

在我國(guó)蛋制品也是餐桌上不可缺少的元素，然而如果雞、鴨、鵝等動(dòng)物在養(yǎng)殖過(guò)程被致病菌感染，很可能會(huì)對(duì)蛋的產(chǎn)量以及蛋的品質(zhì)有所影響。研究人員曾經(jīng)篩選出一株裂解能力強(qiáng)并且噬菌譜較廣的噬菌體，經(jīng)試驗(yàn)證明對(duì)于蛋黃和蛋白中感染的多重耐藥沙門氏菌具有較好的抑制效果[32]。如果鴨在養(yǎng)殖過(guò)程中受到沙門氏菌的感染，在鴨肉被感染的同時(shí)產(chǎn)出的鴨蛋也會(huì)受到污染，會(huì)給養(yǎng)鴨業(yè)造成巨大的損失。有學(xué)者曾經(jīng)從鴨場(chǎng)中分離出1株噬菌譜較廣的噬菌體，試驗(yàn)表明該噬菌體在3 h可以保持較強(qiáng)的噬菌體裂解能力[33]。

5 展望

在對(duì)畜牧養(yǎng)殖行業(yè)生態(tài)環(huán)保且安全可靠的高標(biāo)準(zhǔn)要求下，噬菌體治療不產(chǎn)生耐藥性、特異性強(qiáng)、來(lái)源廣泛、綠色環(huán)保、研發(fā)容易等等優(yōu)勢(shì)會(huì)越來(lái)越顯著，相信在研究人員的共同努力下，噬菌體制劑會(huì)不斷研發(fā)用于各種致病菌的生物防治。但是噬菌體制劑研發(fā)過(guò)程也需要解決一些問(wèn)題，首先用于噬菌體制劑研發(fā)的噬菌體要有較好的穩(wěn)定，不會(huì)產(chǎn)生毒素等其他不良物質(zhì)；其次噬菌體制劑使用的噬菌體最好具有較廣的噬菌譜，能夠同時(shí)抑制多種致病菌；再者噬菌體的給藥方式要不斷優(yōu)化，對(duì)于某些致病菌來(lái)說(shuō)口服噬菌體的給藥方式并不是特別合適；最后噬菌體的給藥劑量也需要不斷探索。相信在科學(xué)技術(shù)飛快發(fā)展以及研究水平不斷提高的背景下，噬菌體目前面臨的問(wèn)題都會(huì)被解決，在不久的將來(lái)，噬菌體能夠成為一種綠色、安全且高效的生物防治試劑，噬菌體制劑的應(yīng)用必將對(duì)畜牧養(yǎng)殖行業(yè)產(chǎn)生正向且積極的影響，對(duì)人類的健康也意義深遠(yuǎn)。