李丹陽，張乃文，關(guān)天東，姜 寧

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，遼寧沈陽 110866)

布氏錐蟲(Trypanosomabrucei)屬于真核單細(xì)胞原生寄生生物，分為布氏錐蟲岡比亞種(T.bruceigambiense)、布氏錐蟲羅德西亞亞種(T.bruceirhodesiense)以及布氏錐蟲指名亞種(T.bruceibrucei)，前2種主要感染人類，引起人的非洲睡眠病；第3種主要感染動物，引起動物的那加納病。布氏錐蟲屬于錐體科錐體屬，傳播媒介是采采蠅，屬舌蠅屬。采采蠅通過叮咬吸食體內(nèi)有布氏錐蟲的人類和動物，將錐蟲傳遞給新的宿主[1]。感染非洲錐蟲后，患者大部分都會出現(xiàn)嗜睡、昏迷的癥狀。癥狀通常分為兩個階段：第一階段為血液淋巴期，在此期間錐蟲寄生繁殖于患者的血液和淋巴液等處，引起血管、淋巴管的周圍炎癥，患者出現(xiàn)精神疲憊、體溫升高、肌肉疼痛、淋巴結(jié)腫大以及貧血等臨床癥狀；第二階段為腦膜炎期，此時布氏錐蟲已入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)?；颊邔霈F(xiàn)一些神經(jīng)癥狀，比如頭暈頭痛、昏沉欲睡、四肢痙攣等等。如不及時的進行救助和治療，患者將持續(xù)嗜睡昏迷，最終導(dǎo)致身體衰竭，最終死亡[2]。但現(xiàn)有藥物都具有很強的副作用，具有腎毒性和神經(jīng)毒性等，因此尋找新型藥物靶標(biāo)迫在眉睫。

蛋白質(zhì)翻譯后修飾(post-translational modifications,PTMs)作為布氏錐蟲各項功能的重要調(diào)節(jié)步驟，在其生活史中不可或缺。研究布氏錐蟲蛋白質(zhì)PTMs的種類、對蟲體的調(diào)控機制以及修飾的關(guān)鍵位點，可以此為突破口，推進以布氏錐蟲為病原的人畜共患疾病的藥物靶點研究和藥物研制，對現(xiàn)有的抗錐蟲藥物具有十分重要的意義。

1 布氏錐蟲的蛋白質(zhì)翻譯后修飾

許多寄生原蟲擁有復(fù)雜的生活史，在其生活史中，通過相關(guān)的基因表達(dá)調(diào)控，從而改變形態(tài)學(xué)和生理學(xué)的特征。在動基體寄生蟲中，尤其是錐蟲，缺乏轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，主要依賴多順反子進行轉(zhuǎn)錄，所以導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄能力有很大程度的受限，但可以通過蛋白質(zhì)翻譯和翻譯后修飾進行相關(guān)的調(diào)節(jié)[3]。翻譯后修飾發(fā)生于蛋白質(zhì)生物合成的較后步驟，是指在蛋白質(zhì)合成后所發(fā)生的共價的、由酶驅(qū)動的蛋白質(zhì)修飾?，F(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)有300多個不同種的PTMs，包括磷酸化、乙?；⒓谆?、泛素化和泛素樣修飾等。PTMs對于生物體有著廣泛的功能，增加其蛋白質(zhì)組的復(fù)雜性，改變相關(guān)蛋白質(zhì)的定位，促進或阻止蛋白質(zhì)之間的相互作用，激活或失活相關(guān)蛋白質(zhì)，同時還可對相關(guān)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進行細(xì)微地調(diào)整。許多PTMs是可逆的反應(yīng)，可根據(jù)生物體的細(xì)胞周期階段和定位進行調(diào)節(jié)，發(fā)生于蛋白質(zhì)生命周期的任何時刻，這些PTMs的動態(tài)調(diào)節(jié)是由專門的酶催化。在布氏錐蟲中，基因表達(dá)的調(diào)節(jié)元件RNA結(jié)合蛋白均經(jīng)歷了廣泛的PTMs。布氏錐蟲與伊氏錐蟲親緣關(guān)系很近，這兩種錐蟲在基因組上非常相似，均缺乏存在于多順反子單位中的RNA聚合酶Ⅱ啟動子和基因[4]，但形態(tài)和生活史卻截然不同，它們之間的差異主要在于各自的蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)以及PTMs的動態(tài)變化的不同[5]。修飾之后的蛋白質(zhì)在各個細(xì)胞器中分布廣泛，參與了錐蟲的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、翻譯、RNA處理、轉(zhuǎn)運和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換等重要的生物學(xué)過程。

1.1 布氏錐蟲常見的蛋白質(zhì)修飾

1.1.1 磷酸化修飾 蛋白質(zhì)磷酸化對于細(xì)胞功能是一個主要的調(diào)節(jié)機制，通過無凝膠、基于磷酸肽富集的蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析發(fā)現(xiàn)大量布氏錐蟲的磷酸化位點，包括在血流型(bloodstream form,BSF)布氏錐蟲細(xì)胞質(zhì)蛋白一小部分的絲氨酸、蘇氨酸以及酪氨酸的磷酸化位點?；?52個特異的磷酸肽和1024個磷酸化位點，識別了491種磷酸蛋白質(zhì)。真核生物的蛋白質(zhì)激酶催化的磷酸化反應(yīng)，在真核細(xì)胞中是最需要研究的翻譯后修飾，因為磷酸化調(diào)節(jié)幾乎存在于所有的細(xì)胞過程。在這491種蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)絲氨酸和蘇氨酸殘基都發(fā)生磷酸化，但基因組中缺乏保守的酪氨酸激酶，可是存在一些磷酸化的酪氨酸殘基[6]。在182種蛋白質(zhì)激酶種，布氏錐蟲的激酶補體比其他細(xì)胞或寄生蟲多了一倍以上，表明可逆的蛋白質(zhì)磷酸化所產(chǎn)生的細(xì)胞信號已經(jīng)演變成了一種精密且主導(dǎo)的成分[7]。

酪氨酸磷酸化在生物體中是一個相對富集的翻譯后修飾，但其缺乏酪氨酸激酶。應(yīng)用磷酸酪氨酸特異性蛋白質(zhì)組學(xué)方法從原環(huán)型(procyclic form,PCF)布氏錐蟲全細(xì)胞提取物中鑒定了 34 種含磷酸酪氨酸的蛋白質(zhì)，用抗磷酸酪氨酸抗體的免疫熒光顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)，有細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)(基體和鞭毛)和寄生蟲核仁相關(guān)的酪氨酸磷酸化蛋白濃度的存在。也證實了酪氨酸磷酸化蛋白的這種定位支持信號分子的功能受其在布氏錐蟲中的精確定位的觀點。同時通過免疫熒光顯微鏡對布氏錐蟲兩個生命周期階段酪氨酸磷酸化蛋白定位進行研究，發(fā)現(xiàn)攜帶這種翻譯后修飾的蛋白質(zhì)都集中于細(xì)胞骨架上，特別是軸絲和鞭毛基體。之前也有一項對綠藻萊茵衣藻的研究表明，酪氨酸磷酸化的糖原合酶激酶3(glycogen synthase 3 kinase,GSK3)活性形式在鞭毛中富集[8]。萊茵衣藻 GSK3 的 RNA 干擾導(dǎo)致細(xì)胞沒有鞭毛，這表明 GSK3 在鞭毛的組成和維持中發(fā)揮作用，并且酪氨酸磷酸化蛋白與鞭毛和基體相關(guān)[9]。

Urbaniak MD通過BSF和PCF布氏錐蟲的全局定量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究，使用每個生命周期階段的細(xì)胞培養(yǎng)中氨基酸穩(wěn)定同位素標(biāo)記，識別了9314個以前未識別的磷酸化位點，發(fā)現(xiàn)磷酸化的變化與蛋白質(zhì)豐度的變化呈負(fù)相關(guān)，磷酸化化學(xué)計量在生命周期階段之間保持不變。蛋白質(zhì)豐度主要保持不變，但磷酸化化學(xué)計量變化顯著，同一蛋白質(zhì)上的不同磷酸化位點顯示出廣泛變化。這些數(shù)據(jù)表明，差異磷酸化廣泛存在于PCF和BSF之間，并且對蛋白質(zhì)組的變化具有顯著的復(fù)雜性。布氏錐蟲生命周期階段之間蛋白質(zhì)磷酸化狀態(tài)的變化也為蛋白質(zhì)組的差異表達(dá)增加了顯著的復(fù)雜性[10]。

1.1.2 乙?；揎?賴氨酸乙?；前l(fā)生在該殘基的Nε-氨基鏈上添加一個乙?；鶊F，消除了其正電荷。在Ariely的試驗中，通過免疫印跡和蛋白質(zhì)沉淀等方法，分析BSF和PCF布氏錐蟲中不同的乙酰化特征。研究發(fā)現(xiàn)，與主要能量來源是糖酵解的血流型布氏錐蟲比起來，糖酵解酶在昆蟲中發(fā)育并利用氧化磷酸化來獲得能量的PCF布氏錐蟲的乙酰化程度更高[11]。

試驗還研究了乙?；欠裾{(diào)節(jié)布氏錐蟲果糖-1,6-二磷酸醛縮酶，發(fā)現(xiàn)在沒有葡萄糖的情況下培養(yǎng)的PCF寄生蟲中醛縮酶活性降低，并通過體外去乙酰作用部分恢復(fù)；在富含葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的PCF蛋白提取物的乙?；瘜?dǎo)致醛縮酶活性降低。此外，與在葡萄糖存在下培養(yǎng)的那些蟲體相比，沒有葡萄糖的情況下培養(yǎng)的PCF中的醛縮酶乙酰化水平更高。為了進一步證實乙?；淖饔?，在重組布氏錐蟲醛縮酶的催化位點附近，賴氨酸殘基被谷氨酰胺取代。這些谷氨酰胺，尤其是K157，作為醛縮酶活性的關(guān)鍵性殘基，抑制了醛縮酶的活性，改變了靜電表面電位，降低了底物的結(jié)合能力并改變了酶的催化結(jié)構(gòu)。試驗證實了乙?；谡{(diào)節(jié)布氏錐蟲糖酵解途徑中的酶活性中的作用，以及對寄生蟲代謝的重要性[11]。

組蛋白乙酰化和H2A變體似乎存在于幾乎所有含有組蛋白的生物體中，并且在調(diào)節(jié)RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄方面具有高度保守的作用。Kraus等研究通過定量質(zhì)譜法發(fā)現(xiàn)，布氏錐蟲蛋白轉(zhuǎn)錄起始位點-核小體高度乙?；瑫rH4和H2A.Z被HAT2和HAT1乙?；?。HAT2的消耗導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄起始位點相關(guān)H4乙?；浇档?，影響了H2A.Z沉積和轉(zhuǎn)錄起始位點。相比之下，HAT1的消耗導(dǎo)致H2A.Z和H2B.V乙?；浇档?，對H2A.Z沉積的影響很小，但使得轉(zhuǎn)錄水平有很大降低[12]，表明H4或H2A.Z乙酰化修飾在H2A.Z沉積和RNA轉(zhuǎn)錄起到不同作用。

1.1.3 泛素化修飾 翻譯后修飾還包括泛素化以及泛素樣修飾物[13]，泛素樣修飾物可以對許多細(xì)胞進行調(diào)節(jié)，包括細(xì)胞周期、轉(zhuǎn)錄、應(yīng)激、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、核轉(zhuǎn)運和自噬等過程[14]。Ubl家族有神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)發(fā)育下調(diào)8(neural precursor cell-expressed developmentally downregulated 8,NEDD8)、小泛素相關(guān)修飾物(small ubiquitin-related modifier,SUMO)、泛素折疊修飾物1、泛素相關(guān)修飾物1、自噬相關(guān)蛋白8和自噬相關(guān)蛋白12、干擾素刺激基因 15和人類白細(xì)胞抗原-F 相鄰轉(zhuǎn)錄物 10。其中SUMO已經(jīng)在鞭毛原生寄生蟲中得到廣泛的研究，尤其是布氏錐蟲和克氏錐蟲[15]。

在布氏錐蟲中，基于45種蛋白質(zhì)已鑒定出53個SUMO的受體位點[16]。使PCF布氏錐蟲增殖前的SUMO沉默會導(dǎo)致蟲體生長抑制、G2/M期有絲分裂停滯及無法正確分離染色體的情況。BSF布氏錐蟲中SUMO的敲除導(dǎo)致了多核細(xì)胞的生長停止和積累。雖然其他的生物在染色體分離依賴DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的SUMO化修飾，但還沒有證據(jù)證明布氏錐蟲相關(guān)同源物受SUMO調(diào)節(jié)。而在缺乏SUMO的BSF布氏錐蟲中，布氏錐蟲拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的著絲粒定位切割活性卻保持完整，這解釋了為什么核分裂仍在這些突變體中進行。這些數(shù)據(jù)表明 SUMO 在布氏錐蟲的整個生活史中具有不同的底物和功能。

在直徑約為2 μm的布氏錐蟲表面，覆有一層厚度為12 nm～15 nm的VSG (variant surface glycoproteins,VSG)，占錐蟲總蛋白的10%[17]，寄生蟲自發(fā)地轉(zhuǎn)換其VSG，這個過程稱為抗原變異，目的是逃避宿主免疫反應(yīng)，這也是錐蟲病在非洲流行多年的原因之一。布氏錐蟲VSG的表達(dá)和功能也受多種泛素化途徑的控制。布氏錐蟲SUMO共軛物在細(xì)胞核中的富集，是VSG表達(dá)位點(VSG expression site,VSG-ES)所獨有的，涉及到VSG-ES啟動子上游的染色質(zhì)區(qū)域。TbSIZ1/PIAS1被鑒定為SUMO E3連接酶，它介導(dǎo)TbSUMO與VSG-ES染色質(zhì)的結(jié)合，通過集合RNA聚合酶Ⅰ導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄激活[18]。

布氏錐蟲NEDD8可以在整個細(xì)胞質(zhì)中找到，但它卻在細(xì)胞核和鞭毛中富集。在NEDD8缺失的布氏錐蟲中，出現(xiàn)了鞭毛脫離和有絲分裂缺陷的現(xiàn)象，同時出現(xiàn)有絲分裂和有絲分裂后細(xì)胞中DNA的異常重新復(fù)制。研究結(jié)果表明，這種Ubl對錐蟲細(xì)胞核和鞭毛具有重要的作用，并且調(diào)節(jié)了布氏錐蟲的細(xì)胞周期進程[19]。

2 布氏錐蟲組蛋白翻譯后修飾

與其他的真核生物不同，錐蟲在其組蛋白中保留了一個保守的特征——組蛋白及其翻譯后修飾高度保守。組蛋白的PTMs對布氏錐蟲有較大的影響，可能會導(dǎo)致其細(xì)胞或器官的活動發(fā)生有關(guān)變化，錐蟲中組蛋白PTMs的多樣性揭示了在組蛋白功能調(diào)節(jié)中的動態(tài)作用。組蛋白上氨基酸的甲基化、磷酸化以及乙?；舫霈F(xiàn)改變，將會導(dǎo)致整個細(xì)胞的周期進程發(fā)生變化。

除了VSG表達(dá)外，錐蟲中的幾個生物過程也涉及了組蛋白PTMs。已有研究發(fā)現(xiàn)H3K76二甲基化和三甲基化以及相關(guān)的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶DOT1A和DOT1B。組蛋白的甲基化在錐蟲DNA復(fù)制和細(xì)胞周期的進程中發(fā)揮作用，并且觀察到H3K76的缺失會導(dǎo)致布氏錐蟲的細(xì)胞周期缺陷[20]。進一步的研究表明，在DNA沒有完成合成的情況下，DOT1A的消耗會導(dǎo)致細(xì)胞進行核分裂，而DOT1A的過度表達(dá)會與持續(xù)合成的DNA相結(jié)合，從而導(dǎo)致非整倍性[21]，布氏錐蟲組蛋白去乙?；窼IR2相關(guān)蛋白的過度表達(dá)導(dǎo)致對DNA損傷劑的敏感性增加。

在動基體目中，布氏錐蟲也是唯一有DNA甲基化修飾的物種[22]。與其他真核生物相似，布氏錐蟲的核小體也都是由核心組蛋白H2A、H2B、H3、H4以及對應(yīng)的變體組成，但進行序列比對時，布氏錐蟲與高等真核生物組蛋白相比，C端相對保守，N端差異較大，尤其是H2A和H2B。H2A的C端有過度乙?；内厔?，H2A、H2B和H4的N端處的丙氨酸存在單甲基化位點。

3 錐蟲PTMs與相關(guān)功能聯(lián)系

3.1 蛋白質(zhì)PTMs與錐蟲的運動適應(yīng)性

鞭毛蛋白PTM組的變異可以反映出寄生蟲之間運動能力的差異。錐蟲鞭毛包含一個典型的9+2微管軸絲，旁鞭毛桿沿著該軸絲運行[23]。軸絲從基底體發(fā)出，并通過鞭毛附著區(qū)與細(xì)胞膜橫向連接。伊氏錐蟲鞭毛每個部分的大多數(shù)蛋白質(zhì)在伊氏錐蟲中被高度修飾或完全修飾，進而也解釋了為什么與布氏錐蟲相比，伊氏錐蟲在受限的環(huán)境中具有更靈活的外觀和更強的運動適應(yīng)性[24]。內(nèi)臂動力蛋白(IAD5-1,Tb927.7.920)在伊氏錐蟲中高度表達(dá)，敲除后會導(dǎo)致細(xì)胞運動缺陷。IAD5-1的K1,134在布氏錐蟲中被乙?；?，在伊氏錐蟲中則被2-羥基異丁?；?。

3.2 蛋白質(zhì)PTMs與錐蟲的能量代謝和特異性氧化還原

糖酵解途徑是錐蟲主要的能量代謝途徑[25]，其中參與的酶大部分都有多重修飾，其中8個PTMs在糖酵解途徑中顯著富集。在伊氏錐蟲和布氏錐蟲糖酵解的過程中最普遍的是發(fā)生在3種限速酶上的乙?；?2-羥基異丁?；?。此外，還觀察到許多 PTMs出現(xiàn)在酶的關(guān)鍵殘基處。例如，1,6-二磷酸果糖醛縮酶的K117可以被6種類型的PTM修飾，烯醇化酶的N338被N-糖基化。

作為早期分支的真核生物，錐蟲已經(jīng)以一種獨特的基于色氨硫酮的硫醇氧化還原體系的方式進化[26]。色氨硫酮還原酶被認(rèn)為是抗錐蟲病藥物的靶點，可將色氨硫酮二硫化物再循環(huán)回二氫色氨硫酮，并且錐蟲毒素(TXN)催化電子從二氫色氨硫酮轉(zhuǎn)移到不同的蛋白質(zhì)靶標(biāo)，這些靶標(biāo)通常涉及多種功能，例如細(xì)胞增殖和抗氧化防御的能力。已發(fā)現(xiàn)多個與TryS相關(guān)的PTM，TryR和TXN以及TXN1和TXN2在布氏錐蟲中的表達(dá)高于伊氏錐蟲。

3.3 蛋白質(zhì)PTMs與布氏錐蟲VSG

布氏錐蟲VSG的表達(dá)和功能也受多種泛素化途徑的控制，已鑒定了491個布氏錐蟲蛋白質(zhì)上的1204個磷酸化位點，并使用抗磷酸酪氨酸抗體鑒定了PCF布氏錐蟲中的34個磷酸化酪氨酸位點。另一項研究報告了布氏錐蟲階段特定的磷酸化變化，并表明差異磷酸化在PCF布氏錐蟲和BSF布氏錐蟲之間普遍存在。在最近的實驗中檢測到PCF布氏錐蟲的210種蛋白質(zhì)中有288個賴氨酸乙?；稽c，在BSF的285種蛋白質(zhì)中檢測到380個位點，尤其是大多數(shù)賴氨酸乙?；?K-ac) 蛋白在代謝過程中富集，表明它們對寄主的寄生蟲適應(yīng)至關(guān)重要[27]。這些檢測結(jié)果進一步解釋了錐蟲生長的調(diào)控機制以及錐蟲病的發(fā)病機制，說明參與蛋白質(zhì)修飾和去修飾的分子是生物制藥發(fā)展的重要目標(biāo)。

4 展望

布氏錐蟲缺乏轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，生活史中主要依靠蛋白質(zhì)翻譯和翻譯后修飾對細(xì)胞功能進行相關(guān)調(diào)節(jié)，研究不同種類的修飾對布氏錐蟲功能的影響是有必要的。目前已對蛋白PTMs進行了廣泛的分類，但關(guān)于其功能意義的研究還有大部分空白需要填補。錐蟲表觀遺傳學(xué)的研究在近幾年有廣泛擴大的趨勢，尤其是組蛋白的翻譯后修飾，作為錐蟲遺傳信息的第二媒介，起到調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的作用。理解蛋白質(zhì)各種修飾的功能意義以及調(diào)控機制，有利于對錐蟲相關(guān)生理功能以及針對其生物藥物靶點的研究奠定理論基礎(chǔ)。

為了研究各種修飾的功能和意義，可以通過敲除相關(guān)變體以及高分辨率質(zhì)譜等方法進行研究和檢測，分析修飾對蟲體功能、表型等的影響。同時還可對不同種類的錐蟲樣本進行定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析、免疫印跡、免疫沉淀等試驗，分析相關(guān)修飾位點和修飾特征，繪制PTM組學(xué)圖譜，通過研究不同修飾所造成的相關(guān)影響，進而推斷這些修飾進行了何種的調(diào)節(jié)以及何種程度的調(diào)節(jié)，以便深入推進對支持布氏錐蟲生活史和過程的生物學(xué)機制的了解、錐蟲重要藥物靶點的研究以及抗錐蟲藥物的研發(fā)。