曹 旭，馬 馨，呂文發(fā)

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)教育部國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春 130118；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生產(chǎn)與產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春 130118)

炎癥是影響子宮能否順利復(fù)歸的重要因素。分娩后子宮內(nèi)膜脫落，子宮復(fù)歸和上皮再生大約需要4周[1]。在此期間，奶牛子宮內(nèi)膜非常容易受到外界病原菌的侵害，同時(shí)機(jī)體會(huì)重新分配營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以支持泌乳期間營(yíng)養(yǎng)需求。因此，產(chǎn)后發(fā)生先天免疫受損和新陳代謝紊亂的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，大約50%產(chǎn)后奶牛在圍產(chǎn)期經(jīng)歷一種或多種生殖道炎疾病，包括胎衣不下、亞臨床子宮內(nèi)膜炎、子宮內(nèi)膜炎、宮頸炎和陰道炎[2]。

奶牛圍產(chǎn)期中性粒細(xì)胞的趨化性、吞噬作用以及氧化爆發(fā)功能降低，被認(rèn)為是導(dǎo)致子宮感染幾率增加的主要原因之一。這種中性粒細(xì)胞功能降低的機(jī)制可能包括營(yíng)養(yǎng)缺乏、能量負(fù)平衡及相關(guān)的組織動(dòng)員而導(dǎo)致的血液代謝物濃度紊亂。本文綜述了影響生殖道先天免疫的因素，并探討了圍產(chǎn)期奶牛免疫功能調(diào)節(jié)的有效治療方法，以期為圍產(chǎn)期奶牛生殖道疾病的預(yù)防及飼養(yǎng)管理提供理論依據(jù)。

1 產(chǎn)后子宮的復(fù)歸

分娩后，牛產(chǎn)道和子宮會(huì)出現(xiàn)天然損傷。牛的胎盤屬于結(jié)締絨膜胎盤，在胎盤形成時(shí)，胚胎絨毛膜上成簇的絨毛插入母體子宮肉阜內(nèi)形成的陷窩中，子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞被侵蝕，絨毛直接與母體的結(jié)締組織接觸。因此，當(dāng)胎盤脫落后，子宮內(nèi)膜對(duì)子宮肉阜保護(hù)喪失，加之分娩后機(jī)體免疫力下降，細(xì)菌的負(fù)荷和致病性、感染或病理性炎癥占上風(fēng)，導(dǎo)致子宮炎癥的發(fā)生[3]。

中性粒細(xì)胞是產(chǎn)犢后在子宮內(nèi)出現(xiàn)的最豐富的炎癥細(xì)胞類型。子宮中性粒細(xì)胞增加是子宮上皮細(xì)胞和常駐巨噬細(xì)胞的免疫受體被激活引起炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的結(jié)果，導(dǎo)致以分泌炎性細(xì)胞因子和趨化因子(TNF-α、IL-1、IL-6)為特征的促炎狀態(tài)。這種炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)被激活后，子宮腔中的中性粒細(xì)胞比例在產(chǎn)后第1周達(dá)到40%以上，到產(chǎn)后第4周降至5%以下[4]。目前，尚不清楚過(guò)度或持續(xù)的炎癥是否是由不同類型或數(shù)量細(xì)菌感染、或免疫功能及代謝調(diào)節(jié)的不穩(wěn)定引起，或者由兩者共同作用引起[5]?；加蟹亲訉m疾病的奶牛與患有胎盤殘留或子宮炎的奶牛在隨后產(chǎn)犢的比例上有類似程度降低，患有非子宮疾病的奶牛在第5天或第6天的高質(zhì)量胚胎百分比降低，以及從第45天到足月的更大妊娠損失。

2 能量負(fù)平衡和全身炎癥

產(chǎn)犢前3周至產(chǎn)犢后3周先天免疫功能降低和炎癥調(diào)節(jié)功能紊亂是生殖道炎性疾病發(fā)生的重要原因。雖然所有圍產(chǎn)期奶牛在產(chǎn)后早期都經(jīng)歷了不同程度的能量負(fù)平衡和全身炎癥，但機(jī)體對(duì)能量負(fù)平衡的適應(yīng)及全身炎癥的加重可能是引發(fā)生殖道炎性疾病的重要原因。產(chǎn)后早期酮體或非酯化脂肪酸(NEFA)濃度升高與亞臨床型子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生呈正相關(guān)，同時(shí)，奶牛圍產(chǎn)期中性粒細(xì)胞功能降低與NEFA、觸珠蛋白濃度、酮體濃度呈負(fù)相關(guān)，與細(xì)胞內(nèi)糖原儲(chǔ)存呈正相關(guān)[6]。

葡萄糖是免疫功能的重要原料[7]。在奶牛體內(nèi)，葡萄糖被大量重新分配到乳腺以合成用于產(chǎn)乳的乳糖，奶牛產(chǎn)犢前最后1周采食量平均會(huì)減少30%，在產(chǎn)犢后1周才恢復(fù)食量，在哺乳期營(yíng)養(yǎng)需求量增加了1倍以上。能量負(fù)平衡以適應(yīng)性及同源性反應(yīng)為特征，其特征在于外周胰島素抵抗和脂肪動(dòng)員，以及隨后將NEFA釋放到血流中。非酯化脂肪酸通過(guò)激素敏感脂肪酶的作用從甘油三酯分子中分離出來(lái)，作為生產(chǎn)牛乳的能源[8]。在肝臟中，NEFA重新酯化為甘油三酯或通過(guò)β-氧化產(chǎn)生能量。然而，NEFA也可能促進(jìn)炎癥[9]、抑制中性粒細(xì)胞氧化暴發(fā)功能和造成胰島素抵抗，肝細(xì)胞攝取NEFA也會(huì)產(chǎn)生酮體。酮類作為外周組織(尤其是肌肉)的能量底物，有研究將酮癥與全身炎癥指標(biāo)聯(lián)系起來(lái)。產(chǎn)犢后發(fā)生酮癥的奶牛，其循環(huán)脂多糖(LPS)濃度升高，LPS濃度的升高可能刺激全身炎癥，但目前無(wú)法確定LPS的來(lái)源。此外，酮癥(血BHB>3 mmol/L)常伴隨著血清中促炎細(xì)胞因子TNF-β、IL-1β和IL-18的濃度升高及抗炎性IL-10的濃度較低，暗示肝臟中NF-κB通路可能被激活[10]。

分娩與炎癥加劇有關(guān)(如宮頸中IL-8的表達(dá))。目前胎盤分離的機(jī)制尚不完全清楚，但是包括來(lái)自中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的基質(zhì)金屬蛋白酶在產(chǎn)犢期間常造成子宮組織損傷。因此，在分娩、胎盤排出和子宮復(fù)歸等正常生理活動(dòng)中會(huì)存在一定程度的炎癥。然而，人們?cè)絹?lái)越認(rèn)識(shí)到炎癥不僅是機(jī)體對(duì)損傷或疾病的反應(yīng)，而且可能是代謝紊亂的后果[11]。促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α可以刺激肝臟產(chǎn)生急性期蛋白，包括觸珠蛋白和血清淀粉樣蛋白α。這些促炎物質(zhì)可能來(lái)自脂肪動(dòng)員或胃腸道，也有可能是產(chǎn)后子宮的炎癥過(guò)程。脂肪活化產(chǎn)生TNF-α和IL-6，其能阻斷胰島素的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，從而促成胰島素抵抗，反過(guò)來(lái)又加劇了脂肪中NEFA的釋放[12]。此外，NEFA通過(guò)結(jié)合Toll樣受體-4(LPS的傳感器，來(lái)自革蘭氏陰性細(xì)菌的主要毒素，子宮炎的重要參與者)可以直接導(dǎo)致炎癥進(jìn)程的加劇。

3 先天免疫功能

分娩時(shí)，循環(huán)皮質(zhì)醇濃度急劇增加，導(dǎo)致L-選擇素表達(dá)下調(diào)。并通過(guò)抑制遷移來(lái)增加循環(huán)中的中性粒細(xì)胞數(shù)量，但分娩后中性粒細(xì)胞數(shù)量略有下降，可能是中性粒細(xì)胞遷移到炎癥部位，如產(chǎn)后子宮和乳腺。這種先天免疫功能的改變?cè)黾恿颂ヒ虏幌隆⒆訉m炎、PVD、亞臨床子宮內(nèi)膜炎和乳腺炎的風(fēng)險(xiǎn)。

分娩后白細(xì)胞會(huì)向子宮募集。中性粒細(xì)胞釋放后，其主要功能包括活化內(nèi)皮細(xì)胞黏附和遷移、病原體識(shí)別和中和。中性粒細(xì)胞的胞漿中有許多含有溶菌酶的顆粒，與病原體的相互作用刺激溶酶與吞噬體的融合，從而促進(jìn)病原體殺滅和進(jìn)一步的吞噬作用，功能性中性粒細(xì)胞合成細(xì)胞因子(如IL-8)以維持對(duì)急性炎癥的正反饋并招募更多的中性粒細(xì)胞[13]。在清除感染源后，中性粒細(xì)胞會(huì)經(jīng)歷程序性細(xì)胞死亡(凋亡)。如果細(xì)胞凋亡失敗，可能導(dǎo)致促炎癥途徑的持續(xù)激活引起慢性炎癥，如亞臨床子宮內(nèi)膜炎。成功凋亡的最終結(jié)果是中性粒細(xì)胞分裂成與膜結(jié)合的小體，被新到達(dá)的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞清除。此外，凋亡的中性粒細(xì)胞會(huì)進(jìn)行反向遷移并返回骨髓以調(diào)節(jié)進(jìn)一步的中性粒細(xì)胞反應(yīng)。

目前，關(guān)于炎癥是如何被下調(diào)并轉(zhuǎn)變?yōu)橛现敝赁D(zhuǎn)變?yōu)榛A(chǔ)狀態(tài)的過(guò)程仍知之甚少。炎癥所需的自我限制部分由專門的促分解介質(zhì)介導(dǎo)，如由ω-3脂肪酸合成的分解素、脂氧素和保護(hù)素；這與來(lái)自花生四烯酸途徑的促炎類花生酸(如前列腺素)相反。中性粒細(xì)胞在解決炎癥和啟動(dòng)組織修復(fù)中的作用可能還未被充分認(rèn)識(shí)。吞噬凋亡的中性粒細(xì)胞導(dǎo)致釋放抗炎或恢復(fù)性細(xì)胞因子，如IL-10和TGF-β，而不是促炎細(xì)胞因子[14]。與巨噬細(xì)胞的經(jīng)典型(M1)和活化型(M2)表型相似，中性粒細(xì)胞被描述為具有相似的N1和N2功能亞群?？紤]到產(chǎn)后的子宮健康，分娩后需要迅速、有力和有效的中性粒細(xì)胞流入子宮，亞臨床子宮內(nèi)膜炎可能在一半的病例中是一種持續(xù)的、失調(diào)的“無(wú)菌”炎癥。假設(shè)炎癥的調(diào)節(jié)是亞臨床子宮內(nèi)膜炎發(fā)病機(jī)制的核心，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)和藥物途徑調(diào)節(jié)炎癥的解決應(yīng)該是未來(lái)奶牛研究的一個(gè)重要目標(biāo)。

4 子宮免疫功能調(diào)節(jié)

4.1 非甾體抗炎藥

一個(gè)健康并且具有良好調(diào)節(jié)作用的產(chǎn)后子宮炎癥反應(yīng)對(duì)于耐受或消除病原體、恢復(fù)卵巢功能和避免生殖疾病是必不可少的[15]。但是如果全身炎癥狀態(tài)過(guò)度或持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能會(huì)影響正常的子宮復(fù)歸。炎癥和免疫的異常調(diào)節(jié)是導(dǎo)致臨床型或亞臨床子宮內(nèi)膜炎的決定因素。因此，使用非甾體抗炎藥(NSAID)可減少產(chǎn)后早期的全身性炎癥，并最終可能有助于減少生殖道疾病的發(fā)生。

高產(chǎn)奶牛產(chǎn)后代謝特征是促炎細(xì)胞因子(如TNF-α、IL-1、IL-6和IL-8)的基因表達(dá)或循環(huán)濃度升高。非甾體抗炎藥的治療作用是通過(guò)抑制環(huán)氧化酶(COX)，減少前列腺素的形成實(shí)現(xiàn)的。環(huán)氧合酶有2種亞型，即組成型環(huán)氧合酶-1(COX-1)和誘導(dǎo)型環(huán)氧合酶-2(COX-2)。非甾體抗炎藥通過(guò)抑制COX-2抑制全身炎癥，但是其副作用則是會(huì)抑制COX-1。非甾體抗炎藥可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子，如NF-κB，它可以調(diào)節(jié)包括TNF-α和IL-1β在內(nèi)的促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。

非甾體抗炎藥通過(guò)抑制COX-2通路、腫瘤形成和腫瘤生長(zhǎng)，減少了與胰島素抵抗相關(guān)的全身炎癥，降低了結(jié)腸癌和直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)。研究還表明，服用大劑量非甾體抗炎藥的2型糖尿病患者的空腹血糖、總膽固醇、甘油三酯和胰島素清除率降低。奶牛產(chǎn)后第1周口服非甾體抗炎藥會(huì)導(dǎo)致機(jī)體低葡萄糖和高NEFA的不利反應(yīng)，但治療奶牛在短期內(nèi)具有更高的肝臟胰島素敏感性，并且在整個(gè)哺乳期產(chǎn)奶量升高[16]，不過(guò)目前其代謝作用和對(duì)子宮健康的影響還未見報(bào)道。研究指出，用美洛昔康治療奶牛全身炎癥的第2天到最后1天血清觸珠蛋白降低，并改善了能量代謝指標(biāo)(治療期間β-羥基丁酸酯較少，胰島素樣生長(zhǎng)因子-1較高)[17]。產(chǎn)后14 d的多形核中性粒細(xì)胞(PMN)功能得到改善，但子宮內(nèi)膜炎癥狀態(tài)沒有受到影響。可以進(jìn)一步研究抗炎治療對(duì)全身炎癥、能量代謝的作用機(jī)制，并優(yōu)化非甾體抗炎藥劑量、治療時(shí)間和持續(xù)時(shí)間，以改善動(dòng)物健康。

4.2 粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子

粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)可以刺激干細(xì)胞產(chǎn)生粒細(xì)胞(中性粒細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞)和單核細(xì)胞。單核細(xì)胞離開循環(huán)并遷移到組織中，隨后它們成熟為巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞[18]。因而是免疫/炎癥級(jí)聯(lián)的一部分，通過(guò)該級(jí)聯(lián)，少量巨噬細(xì)胞的活化可以迅速導(dǎo)致其數(shù)量的增加，這是對(duì)抗感染一個(gè)關(guān)鍵的過(guò)程。此外，在胚胎著床、胎盤發(fā)育時(shí)期以及在月經(jīng)周期等子宮結(jié)構(gòu)劇烈變化時(shí)期，GM-CSF對(duì)子宮內(nèi)膜組織再生具有促進(jìn)作用[19]。GM-CSF可以靶向建立或維持妊娠所需的白細(xì)胞。研究表明，免疫環(huán)境的破壞會(huì)損害胎盤的發(fā)育，其后果包括胎兒生長(zhǎng)受限和不良的圍產(chǎn)期結(jié)局，類似于在GM-CSF缺失突變小鼠中看到的結(jié)果[20]。

有研究使用子宮灌注乙醇的方式建立小鼠子薄型子宮內(nèi)膜模型，使用不同濃度的GM-CSF處理其組織貼壁細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)GM-CSF有利于小鼠受損子宮內(nèi)膜再生，增加子宮內(nèi)膜厚度，促進(jìn)子宮內(nèi)膜腺細(xì)胞中Ki67的表達(dá)，并改善植入位點(diǎn)的數(shù)量[21]。此外，GM-CSF可以促進(jìn)原發(fā)性人類子宮內(nèi)膜腺細(xì)胞的增殖和子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的遷移。GM-CSF通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)人子宮內(nèi)膜腺細(xì)胞的增殖。也有研究表明，GM-CSF可以提高子宮內(nèi)中性粒細(xì)胞豐度[22]。而產(chǎn)后奶牛正處于免疫力波動(dòng)時(shí)期，因此在產(chǎn)后使用GM-CSF來(lái)提高中性粒細(xì)胞豐度，進(jìn)而提高產(chǎn)犢后奶牛的子宮免疫功能，降低產(chǎn)后疾病是可行的。但是關(guān)于這一方向仍需進(jìn)一步研究[23]。

4.3 牛重組白細(xì)胞介素-8

白細(xì)胞介素-8(IL-8)是一種有效的中性粒細(xì)胞趨化激活因子，主要由內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和吞噬細(xì)胞產(chǎn)生，由于其調(diào)節(jié)先天免疫功能的潛力，體外試驗(yàn)證明重組牛白介素-8(rbIL-8)處理的中性粒細(xì)胞趨化特性是對(duì)照組的10倍[24]。在奶牛生殖道進(jìn)行體內(nèi)中性粒細(xì)胞趨化試驗(yàn)。子宮內(nèi)注射1125 μg生理鹽水稀釋的rbIL-8，分別在給藥后3 h和1 h顯著增加陰道和子宮腔中中性粒細(xì)胞的比例。靜脈注射或?qū)m內(nèi)注射1125 μg rbIL-8后，未觀察到對(duì)健康的不良影響。在進(jìn)一步的試驗(yàn)中[25]，同一研究組在104頭初產(chǎn)奶牛和109頭多產(chǎn)荷斯坦奶牛產(chǎn)后24 h內(nèi)分別注入低或高劑量的rbIL-8(11.25 μg和1125 μg rbIL-8稀釋于250 ml鹽水中)。監(jiān)測(cè)奶牛胎衣不下、產(chǎn)褥期子宮炎和PVD。rbIL-8治療降低了多產(chǎn)奶牛產(chǎn)后子宮炎的發(fā)生率，但對(duì)胎盤殘留或PVD的發(fā)生率沒有影響。雖然有試驗(yàn)證明rbIL-8對(duì)產(chǎn)后奶牛的子宮健康有積極效果，但仍然需要更大的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)來(lái)評(píng)估分娩后使用rbIL-8對(duì)子宮炎、PVD和亞臨床子宮內(nèi)膜炎發(fā)病率的影響。但目前rbIL-8的作用機(jī)制尚不明確。

4.4 鈣代謝的調(diào)節(jié)

圍產(chǎn)期鈣穩(wěn)態(tài)被大量輸出用于生產(chǎn)初乳，引起產(chǎn)后血鈣濃度顯著降低[26]。血鈣嚴(yán)重降低可導(dǎo)致臨床低鈣血癥，但亞臨床低鈣血癥(血總鈣<2.1 mmol/L)可影響50%以上的多產(chǎn)奶牛[27]，并與血液中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)減少、中性粒細(xì)胞功能受損和子宮炎發(fā)病率增加有關(guān)[27]。負(fù)的膳食陽(yáng)離子-陰離子差(dietary cation-anion difference，DCAD)飲食在產(chǎn)前喂養(yǎng)會(huì)引起輕度代謝性酸中毒，導(dǎo)致產(chǎn)后鈣代謝改變及血鈣升高。兩項(xiàng)Meta分析表明，降低DCAD日糧可降低胎盤殘留、子宮炎和整體疾病的幾率[28-29]。喂食DCAD的奶牛發(fā)病率降低可能與免疫功能改善有關(guān)。也有一項(xiàng)研究表明，產(chǎn)前飼喂陰性的DCAD可導(dǎo)致中性粒細(xì)胞β-防御素的表達(dá)增加，進(jìn)而促進(jìn)產(chǎn)后健康[30]。與喂食陽(yáng)性DCAD(+130 mEq/kg)的奶牛相比，喂食陰性DCAD飼料(-130 mEq/kg)的經(jīng)產(chǎn)奶牛中性粒細(xì)胞的吞噬功能和氧化爆發(fā)熒光強(qiáng)度僅輕度增加[31]。鈣的細(xì)胞外流入對(duì)中性粒細(xì)胞的活化很重要，但鈣在中性粒細(xì)胞功能中的作用還不完全清楚。產(chǎn)犢后給予腸外鈣補(bǔ)充劑對(duì)中性粒細(xì)胞氧化爆發(fā)或吞噬功能沒有改善[32]。在另一項(xiàng)試驗(yàn)中產(chǎn)犢前喂養(yǎng)陰性(-100 mEq/kg)或陽(yáng)性(+100 mEq/kg)DCAD飼料的奶牛中未發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞吞噬或氧化爆發(fā)的差異。

關(guān)于鈣對(duì)子宮疾病的影響也有研究表明，在診斷為子宮炎奶牛中可以觀察到較低的血清鈣濃度，同時(shí)注射脂多糖也可以誘發(fā)血鈣濃度降低。也就是說(shuō)，低鈣血癥與生殖道疾病有關(guān)，但其機(jī)制尚不清楚。因此，是否可以通過(guò)預(yù)防或早期治療亞臨床低鈣血癥的方法作為提高免疫功能和預(yù)防生殖道疾病的手段還需進(jìn)一步研究。

5 展望

先天免疫功能下降是生殖道炎癥性疾病高發(fā)的重要原因，在產(chǎn)犢前2周到產(chǎn)犢后3周，調(diào)節(jié)圍產(chǎn)期奶牛的先天免疫應(yīng)答，有助于減少生殖道炎癥性疾病的發(fā)生。產(chǎn)后子宮炎癥可能是由于子宮內(nèi)膜對(duì)病原的耐受性失敗所引起，一旦病原體克服子宮內(nèi)膜耐受，迅速而強(qiáng)大的先天免疫反應(yīng)對(duì)于對(duì)抗它們是必不可少的。而相比于現(xiàn)在大多數(shù)產(chǎn)后使用抗生素治療的方法，增強(qiáng)奶牛先天免疫以及中性粒細(xì)胞功能可以降低產(chǎn)后奶牛發(fā)生子宮炎癥幾率，同時(shí)也在一定程度上規(guī)避由抗生素治療帶來(lái)的耐藥性風(fēng)險(xiǎn)。未來(lái)隨著對(duì)子宮免疫功能相關(guān)研究的推進(jìn)，將會(huì)減少由子宮炎癥產(chǎn)生的負(fù)面影響及經(jīng)濟(jì)損失，使養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展。