向 陽，黃 瓊，袁 林

1云南中醫(yī)藥大學(xué)，昆明 650000；2風(fēng)濕性疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點實驗室；3 湖北民族大學(xué)，恩施 445000

慢性萎縮性胃炎屬于中醫(yī)學(xué)“胃痞”“胃痛”范疇，病因多由正氣不足、外邪犯胃、情志不遂、飲食失常等導(dǎo)致，病在脾胃，病性多虛實夾雜，“氣滯、氣虛、濕熱、血瘀”等貫穿病程發(fā)展的始終，在不同階段又有所側(cè)重[1]。治療上多采用清熱化痰、益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)等法[2]。黃連、半夏是中醫(yī)臨床常用藥對之一，也是慢性萎縮性胃炎中醫(yī)及中西醫(yī)結(jié)合診療共識意見中所推薦方劑連樸飲、黃連溫膽湯、半夏瀉心湯的“君藥”組成部分[3]，對治療慢性萎縮性胃炎具有堅實的臨床基礎(chǔ)[1]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在慢性萎縮性胃炎發(fā)病過程中Janus激酶2(Janus kinase，JAK2)/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子3(signal transducer and activator of transcription，STAT3)信號通路的激活可以導(dǎo)致胃黏膜細胞的異常增殖、血管新生以及向惡性轉(zhuǎn)化，并最終導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[4]；胃癌患者胃黏膜中Yes相關(guān)蛋白1(yes-associated protein 1，YAP1)陽性率顯著高于正常人胃黏膜、慢性萎縮性胃炎及腸上皮化生患者，其在胃黏膜中的過表達與胃癌的進展、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后密切相關(guān)[5]；血管新生是影響慢性萎縮性胃炎及胃癌前病變相關(guān)預(yù)后轉(zhuǎn)歸的重要因素[6]?；诖?，本次研究首先采用分子對接的方法探討黃連半夏藥對中有效活性成分與慢性萎縮性胃炎發(fā)病過程中關(guān)鍵性靶標白介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、白介素6(interleukin 6，IL-6)、YAP1、STAT3、JAK2、血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、表皮生長因子受體(epidermal growth factorreceptor，EGFR)的結(jié)合性；然后，通過動物實驗方法建立慢性萎縮性胃炎大鼠模型，采用黃連與半夏的水煎液進行干預(yù)治療；最后，通過檢測血液和胃黏膜組織中相關(guān)靶標的表達情況，以探究該藥對防治慢性萎縮性胃炎的作用機制，為后繼研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 軟件與數(shù)據(jù)庫

Auto Dock Tools 1.5.7軟件、Vina軟件、Discovery Studio 2016軟件、TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)、RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)。

1.1.2 動物

5周齡SPF級SD大鼠60只，雌雄各半，體重180±15 g，購于湖北省疾病預(yù)防控制中心動物中心，許可證號：SCXK(鄂)2020-0018。飼養(yǎng)于風(fēng)濕性疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點實驗室IVC實驗動物籠具中常規(guī)飼養(yǎng)，溫度23±2 ℃，相對濕度70%～75%，晝夜各半間斷照明。本實驗經(jīng)湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會審查批準(2021019號)。

1.1.3 藥材與主要試劑

中藥材黃連飲片(產(chǎn)地四川，批號：2005052，以下簡稱CR)；半夏飲片(產(chǎn)地湖北，批號：20200521，以下簡稱PR)購于宜昌人福藥業(yè)，均經(jīng)湖北民族大學(xué)藥用植物學(xué)專業(yè)李厚聰副教授鑒定為毛莨科黃連屬植物黃連CoptischinensisFranch.的干燥根莖、天南星科半夏屬植物半夏Pinelliaternate(Thunb.) Breit.的干燥塊莖。用藥比例設(shè)置為1∶1，以臨床常規(guī)用量各15 g計算，各稱取15 g加水300 mL浸泡60 min后煎煮30 min留取藥液，濃縮至生藥比1 g/mL，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

N-甲基-N′-硝基-亞硝基胍(MNNG)溶液(東京化成工業(yè)株式會社生產(chǎn)，批號：WMUSI-LJ)；雷尼替丁(宜昌人福藥業(yè)，批號：88B09041)；維酶素片(樂普恒久遠藥業(yè)，批號：20190705)； IL-6 ELISA試劑盒(伊萊瑞特，批號：E-EL-R0015C)；IL-1βELISA試劑盒(欣博盛，批號：ERC007)；Trizol試劑盒(Aidlab，批號：252250AX)；蘇木素(Sigma，批號：H9627)；伊紅(國藥集團，批號：71014544)；磷酸酶抑制劑(碧云天，批號：S1873)；PMSF(阿拉丁，批號：P105539)；RIPA裂解液(碧云天，批號：P0013B)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天，批號：P0010)；TEMED(國藥集團，批號：80125336)；兔多抗p-YAP1(Affinity，批號：Af3328)；兔單抗p-STAT3(Cell signaling，批號：9145)；X光膠片(銳珂，批號：6535876)等。

1.1.4 主要儀器

酶標儀(Thermo scientific Multiskan，MK3型)；PCR儀(ABI，Quant Studio 6型)；紫外分析儀(北京君意東方，JY02S型)；電轉(zhuǎn)儀(北京六一儀器廠，DYCZ-40型)；凝膠成像系統(tǒng)(美國Aplegen公司，Omega Fluor型)等。

1.2 方法

1.2.1 分子對接

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索中藥黃連、半夏的成分數(shù)據(jù)，以同時滿足分子量(molecular weight，MW)<500、脂水分配系數(shù)(Alog P)<5、氫鍵供體(Hdon)<5、氫鍵受體(Hacc)<10、藥物半衰期(drug half-life，HL)≥4、口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥20%、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.1篩選主要活性成分，并下載Mol2格式文件，經(jīng)AutoDock Tools 1.5.7軟件進行能量最小化等處理，并定義為配體。在RCSB PDB數(shù)據(jù)庫中檢索受體IL-1β、IL-6、YAP1、STAT3、JAK2、VEGF、EGFR所對應(yīng)的PDB晶體結(jié)構(gòu)文件，經(jīng)Auto Dock Tools 1.5.7去水加氫等預(yù)處理后，定義活性位點，轉(zhuǎn)化為PDBQT格式文件。利用Auto Dock vina軟件將配體與受體進行分子對接，選取最佳(結(jié)合能得分數(shù)值越小代表結(jié)合性越好)對接構(gòu)象，用Discovery Studio 2016軟件分析對接構(gòu)象的結(jié)合情況。為了驗證本次分子對接結(jié)果的可靠性，本研究將各受體自帶配體抽取出來后再次對接到原受體中，并計算對接模式的均方根偏差(root mean square deviation，RMSD)值，以RMSD≤2評估對接結(jié)果的可靠性。

1.2.2 動物分組造模與藥物干預(yù)

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為6組，正常對照組(A組)、模型組(B組)、維酶素組(C組)、低劑量組(D組)、中劑量組(E組)、高劑量組(F組)，每組10只。參照文獻[1]建模方法復(fù)制大鼠模型，A組予以常規(guī)飼養(yǎng)；B～F組每日自由飲用量濃度為120 mg/L的MNNG溶液，飲水瓶用黑色塑料袋包裹后使用，此外每周(周1、周4)進行2次1 mL/100 g的MNNG溶液灌胃加強；進食2 d后禁食1 d，進食期間給予0.03 g/kg尼替丁的飼料喂養(yǎng)，進食第1 d予以56 ℃ 15% NaCl溶液灌胃(1 mL/100 g)；禁食當(dāng)天予以40%乙醇灌胃(1 mL/100 g)。造模14周時，隨機挑選1只，用10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)麻醉后，摘取胃組織進行常規(guī)HE染色觀察，鏡下證實胃黏膜固有腺體萎縮，表明造模成功。此后，B～F組進行灌胃治療，B組采用生理鹽水灌胃(1 mL/100 g)，按照人與大鼠體表面積折算公式換算為大鼠用量，D組給予中藥1.562 5 g/kg灌胃、E組給予中藥3.125 g/kg灌胃、F組給予中藥6.25 g/kg灌胃，C組給予維酶素0.3 g/kg灌胃，每日1次，連續(xù)干預(yù)8周。末次給藥結(jié)束12 h后，用10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)麻醉大鼠，腹主動脈取血進行血清學(xué)指標檢測，摘取一部分胃組織超低溫(-80 ℃)保存?zhèn)溆茫硪徊糠诌M行形態(tài)學(xué)檢測。

1.2.3 大鼠胃黏膜組織形態(tài)檢測

利用10%多聚甲醛溶液固定大鼠胃組織48 h后，取胃中段組織進行梯度酒精脫水、透明、浸蠟、包埋、切片(4 μm)，行蘇木精-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡觀察、拍照。

1.2.4 ELISA檢測

大鼠血液樣本靜置30 min后，以3 000 r/min離心10 min后采集血清，按照試劑盒說明書要求進行檢測，用酶標儀在450 nm波長測量各孔的光密度(OD值)。

1.2.5 實時熒光定量PCR檢測

按照試劑盒說明書要求操作，采用Trizol法提取胃中段組織RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，設(shè)計引物序列(見表1)，實時熒光定量PCR檢測胃組織中JAK2、STAT3、AKT1、YAP1、VEGF、EGFR mRNA的表達。以GAPDH表達量作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法對數(shù)據(jù)進行分析。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.6 Western blot檢測

參照試劑盒說明書操作要求，提取大鼠胃中段組織中總蛋白，采用酶標儀測定蛋白濃度OD值，并計算出樣品蛋白濃度。依次進行蛋白變性、電泳、電泳分離、電轉(zhuǎn)移(轉(zhuǎn)膜條件：GAPDH，200 mA 90 min、p-STAT3，200 mA 120 min后300 mA 15 min；p-JAK2 200 mA，120 min后300 mA，30 min；p-AKT1、p-YAP1 200 mA 120 min)、ECL顯色：封閉，滴加封閉液稀釋的一抗(抗體稀釋濃度GAPDH，1∶1 000；p-STAT3，1∶1 000；p-JAK2，1∶1 000；p-AKT1，1∶2 000；p-YAP1，1∶1 000)4 ℃孵育過夜，用TBST稀釋相應(yīng)的HRP標記二抗(1∶50 000稀釋)，室溫搖床孵育2 h，顯影、定影，沖洗膠片、掃描，用Band Scan分析膠片灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，目的蛋白表達量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 分子對接結(jié)果

經(jīng)篩選獲得符合篩選條件的有效活性成分共計13個，其中黃連8個、半夏5個，見表2所示。將這些主要活性成分與IL-1β、IL-6、YAP1、STAT3、JAK2、VEGF、EGFR進行分子對接，對接結(jié)果表明13種主要活性成分均能與靶標結(jié)合，選取最佳對接構(gòu)象作圖(見圖1)，結(jié)合能得分見熱圖所示(見圖2)。在對接驗證過程中，將各受體的原配體抽取出來后重新對接到原受體中，計算出的RMSD值均<2，說明對接參數(shù)可靠，對接結(jié)果可信。分子對接結(jié)果提示：黃連半夏主要活性物質(zhì)能夠作用于慢性萎縮性胃炎發(fā)生機制中的IL-1β、IL-6、YAP1、STAT3、JAK2、VEGF、EGFR靶標，進而發(fā)揮干預(yù)作用，其中主要活性成分與JAK2的結(jié)合能得分性最為突出，推測JAK2可能是其發(fā)揮防治作用的核心靶標之一，黃連堿(coptisine)可能是最佳成分之一。

表2 黃連、半夏中潛在活性化合物信息Table 2 Information of potential active compounds in CR and PR

2.2 對大鼠胃黏膜組織病理變化的影響

HE染色后鏡下觀察發(fā)現(xiàn)(見圖3)：A組大鼠胃黏膜組織上皮完整，腺體、細胞排列整齊，無炎癥浸潤；B大鼠胃黏膜組織上皮萎縮，腺體數(shù)目減少、排列紊亂，大量炎癥浸潤，部分腸上皮化生；C組較B組好轉(zhuǎn)，但腺體排列仍紊亂、萎縮，炎癥浸潤，少量腸上皮化生；D、E、F組較B、C組明顯好轉(zhuǎn)，但腺體數(shù)量較少，未見明顯腸化生。HE染色結(jié)果提示：黃連半夏水煎液能夠?qū)瘜W(xué)物質(zhì)損傷與饑飽失常狀態(tài)下的慢性萎縮性胃炎大鼠胃黏膜組織起到抑制炎癥和修復(fù)作用。

圖1 分子對接結(jié)果(2D)Fig.1 Molecular docking results(2D)注：a：黃連堿與YAP1；b：黃連堿與JAK2；c：甲基黃連堿與STAT3；d：甲基黃連堿與VEGF；e：甲基黃連堿與EGFR；f：(R)-Canadine與IL1β；g：小檗浸堿與IL-6。Note:a:Coptisine and YAP1; b:Coptisine and JAK2; c:Worenine and STAT3; d:Worenine and VEGF; e:Worenine and EGFR; f:(R)-Canadine and IL1β (2D); g:Berlambine and IL-6.

圖2 分子對接得分熱圖Fig.2 Heat map of molecular docking scoring

2.3 對大鼠血清炎癥因子IL-6、IL-1β濃度的影響

血清酶聯(lián)免疫檢測發(fā)現(xiàn)：B組大鼠血清IL-6、IL-1β濃度較A組顯著升高(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；C、D、E、F組較B組顯著降低(P<0.01)差異?統(tǒng)計學(xué)意義。見圖4所示。結(jié)果提示：造模后大鼠血清炎癥水平(IL-1β、IL-6)呈明顯上升趨勢，黃連、半夏藥對水煎液能夠顯著降低血清炎癥因子水平，發(fā)揮抑制炎癥的治療作用，特別以中劑量作用顯著，并較維酶素更具有優(yōu)勢。

2.4 對大鼠胃黏膜組織中各指標 mRNA表達的影響

經(jīng)過對大鼠胃組織進行RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)(見圖5)：在YAP1、JAK2、STAT3、AKT1、VEGF、EGFR mRNA表達量上，B組顯著高于A組(P<0.01)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。經(jīng)過治療干預(yù)后，C組在AKT1 mRNA水平上與B組沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，在YAP1、JAK2、STAT3、VEGF、EGFR mRNA水平上均顯著低于B組(P<0.01)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。D、E、F組在各指標水平上均顯著低于B、C組(P<0.01)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖3 各組大鼠胃組織HE染色(×200)Fig.3 HE staining of gastric tissues of rats in each group (×200)注：A：正常對照組；B：模型組；C：維酶素組；D：低劑量組；E：中劑量組；F：高劑量組，下同。Note:A:Normal control group; B:Model group；C:Vitase group; D:Low-dose group; E:Medium-dose group; F:High-dose group,the same below.

圖4 血清IL-6、IL-1β濃度Fig.4 Serum concentrations of IL-6 and IL-1β 注：與A組比較，**P<0.01；與B組比較，##P<0.01。Note:Compared with group A, **P < 0.01; Compared with group B,##P < 0.01.

RT-PCR實驗結(jié)果提示：模型大鼠胃黏膜組織中YAP1、JAK2、STAT3、AKT1、VEGF、EGFR mRNA水平顯著升高，呈現(xiàn)過表達狀態(tài)，經(jīng)過黃連、半夏水煎液灌胃干預(yù)后，顯著下調(diào)了相關(guān)靶標的表達水平，對慢性萎縮性胃炎具有治療作用，其作用機制與調(diào)控JAK2/STAT3炎癥信號通路和血管新生途徑(VEGF、EGFR)有關(guān)。

圖5 各組胃組織中YAP1、STAT3、JAK2、AKT1、VEGF、EGFR mRNA的表達Fig.5 mRNA expressions of YAP1,STAT3,JAK2,AKT1,VEGF and EGFR in gastric tissues of each s,n = 10)注：與A組比較，**P<0.01；與B組比較，#P<0.05，##P<0.01。Note:Compared with group A,**P < 0.01; Compared with group B,#P<0.05，##P<0.01.

2.5 對大鼠胃黏膜組織各關(guān)鍵指標磷酸化水平的影響

經(jīng)過WB實驗檢測發(fā)現(xiàn)(見圖6所示)：在p-YAP水平上，B組顯著低于A組(P<0.01)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，C、D、E、F組均較B組顯著升高(P<0.01)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。表明造模后的胃黏膜組織中p-YAP水平較正常狀態(tài)下的表達水平有所降低，經(jīng)過藥物干預(yù)后的p-YAP水平顯著上調(diào)，黃連、半夏水煎液的上調(diào)作用顯著優(yōu)于維酶素。

在p-STAT3、p-AKT1、p-JAK2水平上，B組顯著高于A組(P<0.01)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，C、D、E、F組較B組顯著降低(P<0.01)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。表明模型大鼠胃黏膜組織中p-STAT3、p-AKT1、p-JAK2水平顯著高于正常大鼠，持續(xù)的炎癥刺激促進了JAK2/STAT3炎癥信號通路的激活，經(jīng)過黃連、半夏水煎液干預(yù)后的磷酸化水平明顯下調(diào)，抑制了JAK2/STAT3信號通路的激活。

圖6 各組大鼠胃黏膜組織中p-STAT3、p-YAP、p-AKT1、p-JAK2表達水平Fig.6 Expression levels of p-STAT3,p-YAP,p-AKT1 and p-JAK2 in gastric mucosa of rats in each s,n = 10)注：與A組比較，**P<0.01；與B組比較，##P<0.01。Note:Compared with group A,**P < 0.01; Compared with group B,#P<0.05，##P<0.01.

3 討論與結(jié)論

黃連、半夏作為半夏瀉心湯、連樸飲、黃連溫膽湯的共同使用中藥，在各方劑中發(fā)揮“君臣”作用。黃連屬毛茛科黃連屬多年生草本植物，主要含生物堿類、黃酮類、木脂素類、酸性成分等，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效[7]；半夏屬天南星目天南星科半夏屬植物，含有生物堿、有機酸、甾醇類、氨基酸、揮發(fā)油、無機元素等多種化學(xué)成分，具有燥濕化痰、降逆止嘔的作用[8]。黃連半夏相配，一溫一寒無藥性過偏之慮，一辛一苦辛開苦降調(diào)暢氣機，一清一消清消結(jié)合，共同發(fā)揮和胃止嘔、清熱化痰、消痞散結(jié)、解毒消腫的效用，切合慢性萎縮性胃炎的病因病機規(guī)律。本次研究通過嚴格的Lipinski規(guī)則篩選到黃連與半夏中所含的13種主要活性成分，其中黃連8種、半夏5種。通過分子對接發(fā)現(xiàn)，以小檗堿、甲基黃連堿等為代表的主要活性成分均能與慢性萎縮性胃炎的核心靶標IL-1β、IL-6、YAP1、STAT3、JAK2、VEGF、EGFR結(jié)合，一定程度上代表了黃連、半夏防治慢性萎縮性胃炎的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，炎癥作為慢性萎縮性胃炎早期的主要病理改變，在“非可控性炎癥”作用下促使病變的胃黏膜組織向惡性轉(zhuǎn)化，加速癌癥的早期血管生成。臨床與實驗研究證實慢性萎縮性胃炎胃黏膜中JAK2/STAT3等炎癥信號通路的激活[9]，促炎細胞因子(IL-6、IL-1β等)表達上調(diào)[10]，血管新生途徑(VEGF、EGFR等)的活化在這一演變過程中發(fā)揮著重要的作用。YAP1作為Hippo信號通路中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄共激活因子，調(diào)控著細胞的生長、增殖和凋亡[11]。在正常情況下YAP1以磷酸化的形式存在于細胞漿中，參與器官及組織的再生調(diào)節(jié)。在非可控性炎癥等上游異常信號作用下，YAP1去磷酸化后進入細胞核，促進相關(guān)癌癥基因的表達與細胞增殖，并決定著致癌活性的大小[12,13]。AKT1參與胃癌的發(fā)生發(fā)展及浸潤轉(zhuǎn)移[14]，干擾AKT1表達能抑制胃癌細胞增殖與遷移[15,16]。因此，IL-1β、IL-6、YAP1、STAT3、JAK2、AKT1、VEGF、EGFR在慢性萎縮性胃炎的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要的作用，是防治其向惡行發(fā)展的重要靶標。

本次實驗在MNNG溶液、熱鹽、乙醇等化學(xué)物質(zhì)及饑飽失常等復(fù)雜條件的長期刺激下，添加含雷尼替丁(臨床常用的選擇性H2受體拮抗劑)飼料以抑制模型動物的胃酸分泌，促使飲用入胃的硝酸鹽快速轉(zhuǎn)為亞硝酸鹽，加速造模。經(jīng)HE病理檢測發(fā)現(xiàn)該方法成功建立了慢性萎縮性胃炎模型。維酶素是目前用于治療慢性萎縮性胃炎的常見西藥，主要成分為核黃素、黃素單核苷酸以及多種維生素及氨基酸，具有促進胃黏膜上皮與腺上皮再生的作用，與多成分的中藥具有較強的對比意義。經(jīng)過對各指標進行檢測發(fā)現(xiàn)，在大鼠血液中的炎性細胞因子IL-6、IL-1β顯著升高，形成炎癥微環(huán)境；引起p-JAK2、p-STAT3水平的升高，激活JAK2/STAT3信號通路，促使炎癥向非可控性發(fā)展，進而導(dǎo)致VEGF、EGFR活化，加速癌癥的早期新生血管形成，并引發(fā)YAP1去磷酸化(p-YAP1)，導(dǎo)致AKT1的過表達，進而損傷胃黏膜組織形態(tài)，誘導(dǎo)慢性萎縮性胃炎向惡性腫瘤演變。經(jīng)過黃連半夏藥對中多種活性成分共同干預(yù)治療后，顯著抑制了血清炎性細胞因子IL-6、IL-1β的表達，同時降低了胃黏膜組織中JAK2/STAT3信號通路關(guān)鍵指標的磷酸化水平，抑制通路激活，改善炎癥微環(huán)境，降低組織中VEGF、EGFR的表達，進而影響腫瘤血管新生，并調(diào)控YAP1、AKT1的過表達，修復(fù)受損的組織形態(tài)，延緩或阻斷慢性萎縮性胃炎向惡性轉(zhuǎn)變，進而對慢性萎縮性胃炎發(fā)揮治療作用，在這一過程中以黃連半夏配伍的中劑量具有顯著優(yōu)勢，且優(yōu)于維酶素，沒有發(fā)現(xiàn)劑量依賴。因此，我們認為黃連、半夏是防治慢性萎縮性胃炎的核心藥物，其作用機制與調(diào)控炎癥信號通路、抑制腫瘤血管新生等途徑密切相關(guān)。