姜 平，何東儀*

1上海中醫(yī)藥大學光華臨床醫(yī)學院，上海 201203；2上海中醫(yī)藥大學附屬光華醫(yī)院風濕免疫科，上海 200050

強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一種病因不明的慢性炎癥性疾病。與其他系統(tǒng)性自身免疫性疾病不同，先天免疫系統(tǒng)和免疫細胞的異常活動起主導作用[1]。在疾病發(fā)展過程中，AS易累及骶髂關(guān)節(jié)和中軸骨部位，最常見的癥狀是慢性背痛和脊柱僵硬，但外周和肌肉骨骼外的表現(xiàn)也很常見[2]。在治療上，非甾體抗炎藥(nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)仍然是一線藥物治療。作為二線藥物，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)抑制劑和白細胞介素-17(interleukin 17，IL-17)抑制劑是可用的[3]。而最近Janus激酶抑制劑也顯示出改善疾病癥狀的效果[4,5]。雖然這些生物制劑在AS治療上顯示出良好的效果，但同時也存在許多不良反應(yīng)。中醫(yī)藥傳承幾千年，有其自身獨特的治療優(yōu)勢。中醫(yī)藥專家一直致力于對AS治療的不懈追求中，中醫(yī)藥在改善AS癥狀以及提高遠期療效方面有著獨特的優(yōu)勢。上海中醫(yī)藥大學附屬光華醫(yī)院為三級甲等關(guān)節(jié)病?？漆t(yī)院，年門診23萬余人次，年出院6 800余人次，床位153張，是國內(nèi)最大的風濕科之一，具有一定的研究優(yōu)勢。由于中醫(yī)學為經(jīng)驗醫(yī)學，且流派較多，在治療AS疾病上用藥無統(tǒng)一標準，中醫(yī)藥方又多為自擬方，缺乏現(xiàn)代藥理學研究。因此，筆者采用數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)[6]，探索院內(nèi)風濕免疫科醫(yī)師運用中藥治療AS的處方用藥規(guī)律，分析出高頻率使用的單味中藥、藥對以及高頻率藥物的四氣五味、功效分類和歸經(jīng)規(guī)律等，并挖掘出新的藥方，同時結(jié)合中藥藥理學分析，進一步闡釋中藥治療AS的分子作用機制，從而為中醫(yī)藥治療AS疾病提供一定的理論基礎(chǔ)和指導。

1 資料與方法

1.1 中藥處方來源

本研究所需中藥處方均來自上海中醫(yī)藥大學附屬光華醫(yī)院風濕免疫科門診及住院部，患者就診時間限定為2021年4月至2022年2月。

1.2 數(shù)據(jù)篩選

病種為強直性脊柱炎，中藥處方數(shù)據(jù)完整且配伍合理。

1.3 數(shù)據(jù)錄入

數(shù)據(jù)錄入采用“人工雙錄入模式”，即1人錄入、另1人核對，將篩選后符合條件的處方錄入Excel 2019表格中。數(shù)據(jù)錄入時以2020版《中國藥典》[7]為參考標準來規(guī)范中藥名稱，并同時錄入中藥的藥味、藥性、歸經(jīng)和功效。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2019數(shù)據(jù)透視表統(tǒng)計中藥的藥味、藥性、歸經(jīng)和功效分類。用SPSS Modeler 18.0及SPSS Statistics 20.0軟件對高頻中藥進行關(guān)聯(lián)規(guī)則和系統(tǒng)聚類分析，得到高頻藥物組合并進行可視化展示。

1.5 狗脊-續(xù)斷成分和作用蛋白獲取

采用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP數(shù)據(jù)庫)和本草組鑒數(shù)據(jù)庫(http://herb.ac.cn/)獲取狗脊-續(xù)斷的化學成分，根據(jù)化學成分的藥動學參數(shù)(ADME)，按照口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug likeness，DL)≥0.18對其進行活性成分篩選，然后獲取相應(yīng)的成分作用蛋白，并利用Uniprot數(shù)據(jù)庫對獲得的基因蛋白進行名標準化處理。

1.6 AS疾病基因的獲取及藥物-疾病核心基因的篩選

在疾病相關(guān)數(shù)據(jù)庫(GeneCards、TTD、DrugBank、DisGeNET、OMIM)中分別以“ankylosing spondylitis”為關(guān)鍵詞檢索與AS相關(guān)的靶基因，限制靶基因物種類型為人類。然后對藥物基因與疾病基因之間進行交集，交集基因通過String數(shù)據(jù)進行蛋白互作分析，并將結(jié)果導入Cytoscape 3.7.2中進行優(yōu)化。

1.7 GO富集分析與KEGG通路分析

將交集基因進行GO生物過程分析和KEGG通路分析，結(jié)果得到相應(yīng)的生物過程(biological processes，BP)、細胞成分(cellular components，CC)、分子功能(molecular functions，MF)條目和KEGG通路，以P≤0.05為篩選標準，選出每個項目中符合條件的前10位。

2 結(jié)果

2.1 中藥頻次統(tǒng)計

本研究共納入符合條件的處方200個，涉及中藥236味，藥物未被《中國藥典》記錄者，則不納入統(tǒng)計。本研究共統(tǒng)計中藥236味，總頻次3 232次，其中使用頻率≥1%的有狗脊、白術(shù)、獨活、當歸、續(xù)斷等28味中藥(見表1)。這些中藥累計頻次1 742次，占總頻次的53.90%，屬于高頻率使用中藥。

表1 頻率≥1%的中藥統(tǒng)計表Table 1 Statistical table of TCM with frequency≥1%

2.2 藥味、藥性、歸經(jīng)及功效分類統(tǒng)計

對236味中藥進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在藥味分析中，苦、甘、辛三味居前三位，累計頻率為85.68%；在藥性分析中，溫、平、寒三性為主，累計頻率為73.31%；在藥物歸經(jīng)分析中，主要歸于肝、肺、脾、胃、腎經(jīng)，累計頻率為76.91%；在藥物功效分析中，補虛藥、活血化瘀藥、清熱藥、解表藥和祛風濕藥為常用藥(見表2、表3)。

表2 中藥藥味、藥性及歸經(jīng)統(tǒng)計表Table 2 Statistical table of TCM's taste,property and channel tropism

表3 中藥功效分類統(tǒng)計表Table 3 Statistical table of TCM with efficacy

2.3 中藥聚類分析

將使用頻率≥1%的28味中藥運用SPSS Statistics 20.0軟件采用平均聯(lián)接(組間)和Pearson相關(guān)性進行系統(tǒng)聚類分析，生成樹狀聚類圖(見圖1)。在中醫(yī)理論指導下，以類間距為21，將藥物分為6類。Ⅰ類：蒼術(shù)、黃柏、綿萆薢、薏苡仁、丹參；Ⅱ類：狗脊、續(xù)斷、獨活、威靈仙、莪術(shù)、炙甘草；Ⅲ類：伸筋草、木瓜、槲寄生、羌活、白術(shù)、黃芪、雞血藤、延胡索；Ⅳ類：茯苓、陳皮、山藥；Ⅴ類：甘草、牛膝、白芍；Ⅵ類：當歸、川芎、杜仲。

圖1 藥物聚類圖Fig.1 Clustering diagram of TCM

2.4 中藥關(guān)聯(lián)規(guī)則分析

運用SPSS Modeler 18.0軟件對高頻中藥進行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，設(shè)置“弱鏈接上限”為20，“強鏈接下限”為35，結(jié)果得到頻數(shù)≥40的藥物組合33個(見表4)。按頻數(shù)排名前10位的藥物組合(強鏈接組合)依次是狗脊-續(xù)斷、獨活-狗脊、白術(shù)-狗脊、獨活-續(xù)斷、白術(shù)-獨活、白術(shù)-黃芪、白術(shù)-續(xù)斷、川芎-當歸、白術(shù)-當歸、當歸-狗脊。藥物間的關(guān)聯(lián)通過網(wǎng)絡(luò)圖進行展示(見圖2)。然后利用Apriori建模進一步挖掘藥物之間的配伍關(guān)系，設(shè)置支持度為10%，置信度為90%，調(diào)整最大前項數(shù)為5，分析挖掘出潛在藥物組合。按照支持度排名，結(jié)果得到10個核心藥物組合(見表5)。其中獨活、狗脊、續(xù)斷、白術(shù)在多個藥物組合中頻繁出現(xiàn)，因此是中藥關(guān)聯(lián)規(guī)則網(wǎng)絡(luò)的核心藥物。

表4 頻數(shù)≥40的藥物組合Table 4 Drug combinations with count≥40

圖2 藥物關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Drug association of network diagram

表5 中藥關(guān)聯(lián)規(guī)則分析Table 5 Analysis of association rules of TCM

2.5 中藥因子分析

應(yīng)用SPSS Statistics 20.0軟件對高頻中藥(使用頻率≥1%)進行因子分析，結(jié)果顯示KMO值為0.692>0.5，Bartlett球形度檢驗值為378，且P值<0.01，表明本數(shù)據(jù)具有較好的線性關(guān)系，可進行因子分析。在方法中選擇最大方差法旋轉(zhuǎn)分析，結(jié)果得到8個公因子，其累積方差貢獻率為65.302%。由碎石圖(見圖3)可以看出，從第8因子之后，線條趨勢趨于平緩。經(jīng)過因子分析，形成高頻中藥的旋轉(zhuǎn)成分矩陣表(見表6)。之后根據(jù)旋轉(zhuǎn)成分信息表提取藥物因子分析組合(見表7)，最后產(chǎn)生因子分析圖(見圖4)。

圖3 中藥因子分析碎石圖Fig.3 Lithotripsy by factor analysis of TCM

表6 高頻中藥的旋轉(zhuǎn)成分矩陣表Table 6 Rotational component matrix of high frequency TCM

表7 因子分析組合Table 7 Combination of factor analysis

圖4 中藥因子分析旋轉(zhuǎn)空間成分圖Fig.4 Rotation space component diagram of factor analysis

2.6 新藥物組合

綜合上述研究結(jié)果，最終可以形成以“狗脊-續(xù)斷”為核心的新配伍藥物組合，包括組合1：狗脊、續(xù)斷、獨活、威靈仙、莪術(shù)、炙甘草；組合2：狗脊、續(xù)斷、白術(shù)、獨活；組合3：狗脊、獨活、續(xù)斷、槲寄生。這些新藥物組合有利于指導AS的臨床治療，之后的研究課題將對這些藥物組合進行深層次的分子作用機制研究和實驗驗證。

2.7 狗脊-續(xù)斷的成分和作用蛋白

根據(jù)第一部分數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果，狗脊-續(xù)斷藥物組合使用頻率最高，運用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法進一步分析狗脊-續(xù)斷治療AS的具體作用機制。通過數(shù)據(jù)庫篩選，結(jié)果獲得狗脊-續(xù)斷的有效成分12個(見表8)，獲取基因430個。

2.8 疾病基因的獲取和核心基因的篩選

共獲得疾病基因2 465個，藥物與疾病間的交集基因125個(見圖5)，交集基因的PPI分析結(jié)果顯示TNF、EGFR、VEGFA、STAT3、HSP90AA1、PTGS2、MMP2、MMP9、IL2等為主要作用蛋白(見圖6)。

2.9 GO和KEGG分析結(jié)果

GO分析結(jié)果顯示BP主要包括炎癥調(diào)控反應(yīng)(inflammatory response)和藥物反應(yīng)(response to drug)等過程；CC主要包括谷氨酸能突觸(glutamatergic synapse)和內(nèi)吞溶酶體(endolysosome)等結(jié)構(gòu)；MF主要包括核受體活性(nuclear receptor activity)和配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性(ligand-activated transcription factor activity)等功能(見圖7)。KEGG通路主要包括：癌癥通路(pathways in cancer)、Toll樣受體信號通路(toll-like receptor signaling pathway)、神經(jīng)營養(yǎng)素信號通路(neurotrophin signaling pathway)和T細胞受體信號通路(T cell receptor signaling pathway)等(見圖8)，表明狗脊-續(xù)斷可能通過上述通路作用于AS。并將富集在通路上的基因進行可視化分析，繪制基因-通路關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖(見圖9)。從圖9可知，一條KEGG通路可以富集到多個基因，而一個基因又可以同時出現(xiàn)在多條通路上，表明狗脊-續(xù)斷是通過多成分、多靶點、多通路來治療AS疾病。

表8 狗脊-續(xù)斷活性成分Table 8 Active components of RC-RD

圖5 交集基因Fig.5 Intersection genes

圖6 互作分析Fig.6 Interaction analysis

圖7 GO結(jié)果分析Fig.7 Analysis of GO results

3 討論與結(jié)論

AS的病因病機目前仍無法完全解釋?，F(xiàn)在中醫(yī)普遍認為本病在早期是以邪實為主，日久痰瘀互結(jié)，阻滯督脈，導致脊背僵硬不舒，后期出現(xiàn)肝腎虧虛、督脈受損，形成“早邪、中瘀、晚虛”的病理特點[8]。中醫(yī)藥治療AS歷史悠久，古代醫(yī)家的治療處方也是非常豐富。隨著現(xiàn)代信息技術(shù)的發(fā)展，利用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫，我們可以發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥治療疾病的用藥規(guī)律，并總結(jié)出中藥的藥性、歸經(jīng)和功效等，從中醫(yī)角度進一步研究疾病。

文章第一部分通過數(shù)據(jù)挖掘?qū)Ρ驹褐委烝S的中藥處方進行收集、整理。共收集處方200個，統(tǒng)計中藥236味，結(jié)果發(fā)現(xiàn)現(xiàn)代醫(yī)家在治療AS上與古代醫(yī)家用藥基本相似[9]。用藥上以補虛藥、活血化瘀藥、清熱藥和祛風濕藥為主，如狗脊祛風濕、補肝腎、強筋骨，續(xù)斷補肝腎，當歸活血化瘀，獨活祛風除濕等。藥味以苦、甘、辛為主，藥性主要是溫、平、寒，走行于肝、肺、脾、胃、腎等經(jīng)絡(luò)。中醫(yī)理論認為肝主筋，腎主骨藏精，脾胃主運化，為后天之本。肝、腎、脾、胃功能正常，則精血充足，筋骨得以濡養(yǎng)后脊柱關(guān)節(jié)才能正常活動[10]。之后對使用頻率≥1%的高頻率使用藥物進行了聚類分析。結(jié)果則劃分為6類，其中以祛風濕、活血化瘀和補腎強骨藥為主。符合AS多以肝腎虧虛，督脈受損，并伴隨久痹成瘀的病理特點[11]。關(guān)聯(lián)規(guī)則分析結(jié)果顯示出排名較高的33對藥物組合主要是補虛藥、活血化瘀藥和祛風濕藥之間相互組合。像狗脊-續(xù)斷、獨活-狗脊、川芎-當歸等，與高頻率中藥分析結(jié)果可以相互對應(yīng)，證實了數(shù)據(jù)分析結(jié)果的可靠性。中藥因子分析部分，則提取了8個公因子，如CF1是清熱藥、活血化瘀藥和祛風濕藥組合，CF2是祛風濕藥、補虛藥和活血化瘀藥組合，CF3是祛風濕藥和補虛藥組合等?？梢钥闯鲆蜃臃治鼋Y(jié)果與關(guān)聯(lián)規(guī)則分析結(jié)果基本吻合，具有較高的準確性。

圖8 KEGG通路分析氣泡圖Fig.8 Bubble diagram of KEGG pathway

圖9 基因-通路關(guān)聯(lián)圖Fig.9 Gene-pathway association′s network

第二部分針對數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果中發(fā)現(xiàn)的高頻率藥物組合狗脊-續(xù)斷進行進一步的網(wǎng)絡(luò)藥理學分析，闡述狗脊-續(xù)斷治療AS的具體分子作用機制。藥物成分分析發(fā)現(xiàn)，在狗脊-續(xù)斷治療AS中發(fā)揮主要作用的活性成分為β-谷甾醇、山奈酚和柚皮素等，具有重要的藥理作用。β-谷甾醇屬于植物甾醇類成分之一，屬于四環(huán)三萜類化合物。β-谷甾醇以其特有的生物學特性和物理化學性質(zhì)被較多地應(yīng)用到醫(yī)藥行業(yè)中。研究發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇具有重要的抗炎、抗氧化、抗腫瘤、促進創(chuàng)傷愈合和免疫調(diào)節(jié)作用，抑制腫瘤壞死因子的聚集與釋放，主要用于心血管系統(tǒng)和腫瘤等疾病的治療[12,13]。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)，山奈酚也具有抗炎、抗細菌病毒感染和免疫調(diào)節(jié)的作用。它能夠能增強調(diào)節(jié)性T細胞的抑制功能，提高FOXP3的表達水平，并能預(yù)防和治療AS等炎癥性疾病[14]。通過藥理學分析可以發(fā)現(xiàn)，在狗脊-續(xù)斷中存在多種具有抗炎、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)作用的活性成分，這些成分是狗脊-續(xù)斷發(fā)揮治療AS作用的關(guān)鍵成分。每個藥物成分都有自己的目標作用蛋白，為進一步闡述兩者之間的關(guān)系，將成分與基因進行網(wǎng)絡(luò)分析，得到了TNF、EGFR、VEGFA、STAT3、HSP90AA1、PTGS2、MMP2、MMP9、IL2等多個主要作用蛋白。像TNF在自身免疫性疾病和炎癥性疾病中作用機制目前已經(jīng)有很多報道，相關(guān)治療藥物也已經(jīng)應(yīng)用于臨床治療，且具有較好的療效[15,16]。PTGS2是前列腺素生物合成中的關(guān)鍵酶,既是一種雙加氧酶又是一種過氧化物酶。它常常參與機體的各種炎癥反應(yīng)，具有抑制炎癥因子分泌和抗炎、鎮(zhèn)痛的作用[17,18]。此外，對EGFR[19]、STAT3[20,21]等基因的研究也有很多，不再詳細闡述。綜上分析，可以發(fā)現(xiàn)TNF、EGFR、VEGFA、STAT3、HSP90AA1、PTGS2等基因是狗脊-續(xù)斷作用于AS的關(guān)鍵基因。后續(xù)的通路富集分析發(fā)現(xiàn)，這些關(guān)鍵基因主要富集在Toll樣受體信號通路和T細胞受體信號通路等，并主要參與炎癥調(diào)控反應(yīng)、核受體活性和配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性等進程。研究表明，Toll樣受體是免疫應(yīng)答的重要啟動者，包括先天免疫應(yīng)答和后天免疫應(yīng)答。Toll樣受體內(nèi)的基因多態(tài)性會導致某些相關(guān)的關(guān)鍵信號通路功能障礙，從而增加自身免疫性疾病的風險[22]，如調(diào)控AS的炎癥反應(yīng)[23]。而T細胞在免疫反應(yīng)上也發(fā)揮著重要的作用，它可以通過消除感染和腫瘤來幫助產(chǎn)生保護性免疫，或者通過破壞宿主細胞來調(diào)控免疫和炎癥反應(yīng)。通過精確定位抗原特異性T細胞受體信號來調(diào)節(jié)T細胞反應(yīng)，有可能從根本上改變自身免疫性疾病的治療策略[24]。綜上所述，狗脊-續(xù)斷中的β-谷甾醇和山柰酚等重要活性成分通過TNF、EGFR和PTGS2等基因作用于Toll樣受體信號和T細胞受體信號等通路發(fā)揮治療AS的作用，體現(xiàn)了中醫(yī)藥治療疾病多成分、多靶點、多通路的特點，并為應(yīng)用數(shù)據(jù)挖掘的結(jié)果提供了更好的理論基礎(chǔ)。

文章通過應(yīng)用數(shù)據(jù)挖掘和網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，對上海中醫(yī)藥大學附屬光華醫(yī)院在中醫(yī)藥治療AS上的處方用藥規(guī)律進行了總結(jié)分析，發(fā)現(xiàn)了狗脊-續(xù)斷等常用藥物組合。并對這一藥物組合進行了分子作用機制的研究，直觀地驗證了狗脊-續(xù)斷多成分、多靶點、多通路治療AS的特點，體現(xiàn)了中醫(yī)藥治療疾病的獨特優(yōu)勢。此外，本研究也存在一些不足之處，部分醫(yī)生開具中藥時會完全依照協(xié)定處方，使收集的處方數(shù)據(jù)存在一定的局限性。而網(wǎng)絡(luò)藥理學分析也只是在理論上闡述出狗脊-續(xù)斷治療AS的分子作用機制，后續(xù)還需要進一步動物實驗或細胞實驗進行驗證，從而完善研究。