周成美，胡晶紅,2*，任 鑫，閆慶康，楊東杰，張永清,2

1山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院；2山東省質(zhì)量控制與中藥全產(chǎn)業(yè)鏈建設(shè)協(xié)同創(chuàng)新中心，濟(jì)南 250355； 3山東康源堂中藥飲片股份有限公司，濟(jì)寧 277600

蟾酥作為我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥，主要包含生物堿、蟾毒內(nèi)酯類(lèi)等多種化學(xué)成分[1]，發(fā)揮抗腫瘤、抗心肌缺血等藥理活性，但其也有一定毒性，需要嚴(yán)格控制用量[2]。山東作為蟾酥藥材的道地產(chǎn)區(qū)，在市場(chǎng)上價(jià)格昂貴，質(zhì)量差異較大，甚至部分藥材具有摻入蟾皮、腺體的現(xiàn)象，且對(duì)蟾酥的采集和初加工環(huán)節(jié)監(jiān)管不夠，缺乏對(duì)源頭藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)。近年來(lái)，HPLC指紋圖譜和多成分含量測(cè)定多用于中藥質(zhì)量研究，2020版《中國(guó)藥典》規(guī)定華蟾酥毒基、脂蟾毒配基、蟾毒靈三種成分的總量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)應(yīng)不少于7.0%。然而，現(xiàn)存的研究缺乏多指標(biāo)成分和多分析手段系統(tǒng)性評(píng)價(jià)研究，且至今為止文獻(xiàn)報(bào)道蟾酥質(zhì)量評(píng)價(jià)成分不夠全面。本研究在此基礎(chǔ)上新增8種成分，以沙蟾毒精、蟾毒靈等11種主要成分作為評(píng)價(jià)蟾酥質(zhì)量的綜合指標(biāo)，通過(guò)指紋圖譜對(duì)40批次蟾酥樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合相似性分析、聚類(lèi)分析、主成分分析和偏最小二乘法判別分析結(jié)果對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行全面評(píng)價(jià)[3-9]。

1 儀器與材料

Aglient 1260 HPLC色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；KQ-500DE型超聲儀(昆山市儀器有限公司)；萬(wàn)分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)。

甲醇、乙酸和乙腈為色譜級(jí)(美國(guó)賽默飛公司)；純凈水(杭州娃哈哈有限公司)。

偽異沙蟾毒精(批號(hào)Y18O9Y72597)、日蟾毒它靈(批號(hào)P17O9F72594)、沙蟾毒精(批號(hào)Y03D9Y76566)、蟾蜍它里定(批號(hào)P14J11S118458)、遠(yuǎn)華蟾蜍精(批號(hào)Y13A9Y67875)、華蟾酥毒基(批號(hào)W27M10Z84297)、蟾毒靈(批號(hào)P27F10F81703)、脂蟾毒配基(批號(hào)C30S8G45143)、蟾毒它靈(批號(hào)P28M10F84299)、脂蟾毒精(批號(hào)P14J11S118459)、南美蟾毒精(批號(hào)C25F10G81502)，純度均大于98.0%，均購(gòu)于上海源葉生物有限公司。

40批次蟾酥藥材經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院張永清教授鑒定為中華大蟾蜍BufobufogargarizansCantor和黑框蟾蜍BufomelanostictusSchneider的干燥分泌物，藥材具體信息見(jiàn)表1。

表1 蟾酥樣品的基本信息Table 1 Sample information of Bufonis Venenum

續(xù)表1(Continued Tab.1)

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

安捷倫 InfinityLab Poroshell 120 EC-C18(150 mm×3 mm，2.7 μm)色譜柱；流動(dòng)相為0.1%乙酸水(A)-乙腈(B)進(jìn)行梯度洗脫(0～15 min，85%→72% A；15～35 min，72%→71% A；35～40 min，71%→65% A；40～50 min，65%→60% A)，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)296 nm，流速0.5 mL/min，進(jìn)樣量5 μL，自動(dòng)進(jìn)樣。

2.2 供試品溶液的制備

取40批蟾酥藥材粉末(過(guò)3號(hào)篩)約0.1 g，精密稱(chēng)定，置于具塞離心管中，加入甲醇10 mL密封，稱(chēng)重后超聲(40 kHz，100 W，60 ℃)提取60 min，放至室溫后補(bǔ)足失重，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱(chēng)取偽異沙蟾毒精、沙蟾毒精、蟾蜍它里定、華蟾酥毒基、遠(yuǎn)華蟾蜍精、脂蟾毒配基、蟾毒它靈、脂蟾毒精、日蟾毒它靈、南美蟾毒精、蟾毒靈11種對(duì)照品適量，加甲醇溶解得質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對(duì)照品溶液，搖勻即得。

2.4 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn)

取蟾酥供試液(S4)，按“2.1”項(xiàng)確立的色譜方法連續(xù)進(jìn)樣6次，以華蟾酥毒基為參照峰，分別記錄其色譜結(jié)果。結(jié)果表明各共有峰的相對(duì)峰面積RSD為0.910%～2.230%，相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.002%～0.143%，均小于5%。表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取蟾酥供試液(S4)，按“2.1”項(xiàng)確立的色譜條件分別在 0、2、4、8、12、24 h不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣，分別記錄結(jié)果，得到各共有峰相對(duì)峰面積RSD為0.890%～3.905%，相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.014%～0.714%，均小于5%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取蟾酥樣品6份(S4)，分別按照“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，根據(jù)“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明各共有峰相對(duì)峰面積RSD為1.060%～4.780%，相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.002%～0.174%，均小于5%。表明方法的重復(fù)性良好。

2.5 指紋圖譜的建立

2.5.1 樣品指紋圖譜及共有峰指認(rèn)

取供試液(S1～S40)進(jìn)樣，分別測(cè)得其色譜圖，將結(jié)果導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012年版)》，設(shè)置S1為參考圖譜，采用平均數(shù)法以及時(shí)間寬度為0.1進(jìn)行多點(diǎn)校正和全譜峰匹配分析，得到40批蟾酥指紋圖譜共有模式及對(duì)照譜圖譜(見(jiàn)圖1)。在40批次蟾酥藥材的對(duì)照指紋圖譜中共標(biāo)記21個(gè)共有峰，通過(guò)與混合對(duì)照品圖譜比對(duì)、查閱文獻(xiàn)資料共指認(rèn)出 11個(gè)色譜峰(見(jiàn)圖2)。

圖1 40批次蟾酥樣品的HPLC疊加指紋圖譜Fig.1 Overlapping HPLC fingerprints of 40 batches of Bufonis Venenum samples

2.5.2 相似性分析

采用相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012 版)，通過(guò)參照對(duì)照?qǐng)D譜對(duì)蟾酥指紋圖譜進(jìn)行相關(guān)系數(shù)計(jì)算，對(duì)樣本的相似性和差異性進(jìn)行分類(lèi)，用相關(guān)系數(shù)評(píng)價(jià)相似度[10,11]。將蟾酥的指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜對(duì)比，相似度在0.779～0.991之間(見(jiàn)表2)，表示不同批次蟾酥存在品質(zhì)差異。

圖2 蟾酥的HPLC對(duì)照指紋圖譜(A)和混合對(duì)照品溶液的HPLC圖(B)Fig.2 HPLC comparison fingerprint (A) and mixed reference substances (B) of Bufonis Venenum注：1-偽異沙蟾毒精；2-日蟾毒它靈；7-沙蟾毒精；8-蟾蜍它里定；14-遠(yuǎn)華蟾蜍精；16-蟾毒它靈；17-脂蟾毒精；18-南美蟾毒精；19-蟾毒靈；20-脂蟾毒配基；21-華蟾酥毒基。Note:1-Bufarenogin;2-Gamabufotalin;7-Arenobufagin;8-Bufotalidin;14-Telocinobufagin;16-Bufotalin;17-Resibufagin;18-Marinobufagin;19-Bufalin;20-Resibufogenin;21-Cinobufagin.

表2 40批次蟾酥樣品的指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)Table 2 Similarity evaluation of 40 batches of Bufonis Venenum samples

2.6 化學(xué)模式識(shí)別分析

2.6.1 聚類(lèi)分析(HCA)

聚類(lèi)分析是為了消除藥材數(shù)據(jù)中的不對(duì)稱(chēng)信息，以劃分重要性為前提，將關(guān)系更接近的研究對(duì)象整合為一類(lèi)[12]，實(shí)質(zhì)是將多維空間中不同位置的樣本，用多種方法測(cè)量樣本之間的距離，建立分類(lèi)[13,14]。本研究運(yùn)用SIMCA 13.0軟件，以40批藥材的共有峰峰面積為變量進(jìn)行聚類(lèi)。聚類(lèi)分析可以將不同批次蟾酥藥材進(jìn)行區(qū)分，結(jié)果如圖3所示，一類(lèi)包括S35～S40，一類(lèi)包括S29～S34，其余28批藥材為一類(lèi)。

2.6.2 主成分分析(PCA)

利用SPSS 22.0軟件以蟾酥共有峰的相對(duì)峰面積為指標(biāo)，對(duì)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行主成分分析，以特征值大于1和貢獻(xiàn)率大于85%為標(biāo)準(zhǔn)，提取出4個(gè)主成分，其累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為91.122%，表明這4個(gè)主成分包含了21個(gè)共有成分的91.122%的信息，符合主成分分析條件(見(jiàn)表3)。結(jié)果顯示蟾酥主成分1特征值為13.012，方差貢獻(xiàn)率為61.961%，對(duì)應(yīng)的載荷量較大成分有8號(hào)、7號(hào)和5號(hào)色譜峰，表明主成分1受這幾種成分影響較大，為蟾酥藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)；主成分2的特征值為2.921，方差貢獻(xiàn)率為13.912%，15、12和18號(hào)色譜峰載荷量較大，說(shuō)明主成分2受這3個(gè)成分影響較大；主成分3和主成分4的特征值分別為1.662和1.540，方差貢獻(xiàn)率為7.915%和7.334%，說(shuō)明4個(gè)主成分代表了原始數(shù)據(jù)的絕大部分信息，碎石圖顯示排名前4的成分直線較陡峭(見(jiàn)圖4)，有助于解釋變量，能夠綜合蟾酥成分的大部分信息。通過(guò)分析得到40批次蟾酥樣品中21種成分的得分圖(見(jiàn)圖4)和載荷圖(見(jiàn)圖5)。結(jié)合圖4、5來(lái)看可以將40批藥材分為3類(lèi)，與聚類(lèi)分析結(jié)果一致。

圖3 蟾酥樣品的聚類(lèi)樹(shù)狀圖Fig.3 Custer analysis of Bufonis Venenum samples

圖4 主成分分析碎石圖Fig.4 PCA scree plot of Bufonis Venenum

圖5 主成分分析 (PCA) 得分圖Fig.5 PCA score plot of Bufonis Venenum

表3 蟾酥藥材主成分分析特征值及方差貢獻(xiàn)率Table 3 Principal component eigenvalues and cumulative variance contribution rate of Bufonis Venenum

2.6.3 偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)

為進(jìn)一步區(qū)分不同采集時(shí)期樣品，本研究采用偏最小二乘法判別分析建立數(shù)據(jù)模型。運(yùn)用SIMCA 13.0軟件對(duì)40批蟾酥21種共有成分含量進(jìn)行模式識(shí)別，將標(biāo)準(zhǔn)化的共有峰峰面積導(dǎo)入系統(tǒng)進(jìn)行PLS-DA。模型驗(yàn)證參數(shù)結(jié)果顯示，解釋率參數(shù)為R2X=0.752，模型區(qū)分參數(shù)為R2Y=0.999，模型預(yù)測(cè)參數(shù)為Q2=0.999，表明建立的模型合理并能做出較好的預(yù)測(cè)。分析得到PLS-DA分析得分圖(見(jiàn)圖6)，結(jié)果顯示與主成分分析和聚類(lèi)分析結(jié)果一致。為確定貢獻(xiàn)程度最大的成分，變量投影重要性(variable importance in projection，VIP)體現(xiàn)成分對(duì)數(shù)據(jù)模型的整體貢獻(xiàn)程度，值越大表明成分的貢獻(xiàn)越大，一般認(rèn)為VIP>1的化合物發(fā)揮了重要作用[15]，通過(guò)VIP圖(見(jiàn)圖7)分析篩選出12個(gè)變量，影響大小依次為峰7、8、5、11、10、6、3、12、20、21、2和16，以上成分也是區(qū)分蟾酥藥材質(zhì)量的重要成分。

2.7 多成分含量測(cè)定

2.7.1 系統(tǒng)適應(yīng)性

分別取混合對(duì)照品和供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，偽異沙蟾毒精等11種成分與其相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05(見(jiàn)圖1和2)。

圖6 40批蟾酥藥材偏最小二乘判別分析得分圖Fig.6 PLS-DA score plot for 40 batches of Bufonis Venenum

圖7 40批蟾酥PLS-DA 模型中11個(gè)色譜峰的VIP圖Fig.7 VIP of 21 chromatographic peaks in PLS-DA model of Bufonis Venenum

2.7.2 線性關(guān)系考察

分別精密取適量的“2.2.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，按照倍數(shù)稀釋法最終得出11種成分的線性回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 回歸方程及相關(guān)系數(shù)Table 4 Linear equation and correlation coefficient

2.7.3 精密度考察

取蟾酥供試液(S4)，按“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算11 種成分的峰面積的RSD。結(jié)果偽異沙蟾毒精等11種成分峰面積RSD 分別為0.30%、0.23%、0.22%、0.12%、0.31%、1.28%、0.29%、0.45%、0.24%、0.28%、0.82%，表明儀器精密度良好。

2.7.4 穩(wěn)定性考察

取蟾酥供試液(S4)，按“2.1”項(xiàng)下方法分別在0、2、4、8、12、24h，計(jì)算11種成分的峰面積的RSD。結(jié)果偽異沙蟾毒精等11種成分峰面積RSD分別為0.58%、0.31%、0.25%、0.12%、0.41%、1.46%、3.34%、0.85%、0.48%、0.30%、0.81%，表明樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7.5 重復(fù)性考察

取蟾酥樣品(S4)6 份，分別按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，計(jì)算11 種成分含量 RSD。結(jié)果偽異沙蟾毒精等11種成分含量RSD 分別為2.26%、1.32%、1.33%、1.33%、1.43%、1.48%、1.96%、1.78%、1.57%、1.38%、1.10%，表明方法重復(fù)性良好。

2.7.6 加樣回收率考察

取蟾酥樣品(S4)6份，約0.1g，分別按精密加入適量對(duì)照品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表5，結(jié)果表明該方法的回收率良好。

表5 蟾酥回收率試驗(yàn)結(jié)果(n = 6)Table 5 The results of recovery test of Bufonis Venenum (n = 6)

續(xù)表5(Continued Tab.5)

續(xù)表5(Continued Tab.5)

2.7.7 含量測(cè)定

精密稱(chēng)定40批次不同采收期的蟾酥藥材粉末約0.1 g，按“2.2”項(xiàng)下樣品處理方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)中的條件進(jìn)行檢測(cè)，采用外標(biāo)法計(jì)算各批次樣品中 11 種化合物的含量百分?jǐn)?shù)(見(jiàn)表6)。對(duì)比不同批次蟾酥各成分的含量百分?jǐn)?shù)結(jié)果可知，11種成分中相差較大的是偽異沙蟾毒精，平均含量百分?jǐn)?shù)為0.063%，且該成分的RSD值大于50%，作者推測(cè)是因?yàn)樵摮煞址迕娣e較小(檢測(cè)限和定量限分別為1.399和2.138 μg/mL)，S5批次中該成分濃度低于定量限濃度，不同批次之間含量誤差較大。此外，山東省內(nèi)蟾毒靈等3種藥典規(guī)定成分總含量在7.100%～11.000%之間，均大于規(guī)定的7.0%，符合2020版《中國(guó)藥典》要求。

表6 40批次蟾酥藥材多成分含量測(cè)定 Table 6 Contend determination results of 40 batches of Bufonis Venenum

3 討論與結(jié)論

山東省為蟾酥的道地產(chǎn)區(qū)，據(jù)調(diào)查山東省內(nèi)蟾蜍養(yǎng)殖戶(hù)總數(shù)多達(dá)127戶(hù)，除東營(yíng)市以外各市均有分布。因養(yǎng)殖規(guī)模差異，蟾酥質(zhì)量參差不齊，指紋圖譜與多成分定量分析相結(jié)合能準(zhǔn)確判別出蟾酥樣品之間的質(zhì)量差異，可初步作為考察商品藥材優(yōu)劣的判斷標(biāo)準(zhǔn)。本研究基于蟾酥樣品中11種化學(xué)成分建立HPLC指紋圖譜，主要針對(duì)蟾酥藥材中的強(qiáng)心苷蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯類(lèi)成分，現(xiàn)代藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究表明這些成分具有抗腫瘤，免疫調(diào)節(jié)活性和衰減癌癥衍生疼痛的功效。

此外，對(duì)色譜峰進(jìn)行相似性分析，結(jié)果顯示山東省內(nèi)不同批次的蟾酥相似度大于0.900，表明山東省內(nèi)不同批次的蟾酥特征成分相似度良好，但省外6批樣品相似度與其他批次相比差距較大，尤其是湖南和江蘇6批樣品相似度在0.779～0.802之間。

為進(jìn)一步分析不同批次蟾酥藥材中共有峰的差異，對(duì)40批次蟾酥進(jìn)行聚類(lèi)、主成分和偏最小二乘法判別分析分析并對(duì)樣本進(jìn)行有效區(qū)分，40批樣品可以分為3類(lèi)，分類(lèi)結(jié)果一致，不同批次之間蟾酥的質(zhì)量存在差異，且偏最小二乘法判別分析的VIP分析得到貢獻(xiàn)程度最大的12個(gè)成分包含沙蟾毒精、蟾蜍它里定、脂蟾毒配基、華蟾酥毒基、日蟾毒它靈和蟾毒它靈這6種成分。

通過(guò)含量測(cè)定不同批次的40批蟾酥藥材，發(fā)現(xiàn)藥典規(guī)定的蟾毒靈、脂蟾毒配基和華蟾酥毒基含量最高的是濟(jì)寧微山的蟾酥，此外所有成分總含量排名最高的樣品為日照莒縣的蟾酥。山東省內(nèi)的蟾酥樣品在藥典規(guī)定三種成分含量之和以及所有測(cè)量成分含量之和兩方面均高于省外蟾酥樣品，且湖南和江蘇的蟾酥樣品不符合藥典規(guī)定，由此結(jié)果可以表明山東蟾酥在質(zhì)量方面有一定的優(yōu)勢(shì)。山東省內(nèi)蟾酥含量分析結(jié)果顯示，濟(jì)寧微山和日照莒縣的蟾酥不僅在主成分分析中得分較高，藥典規(guī)定的蟾毒靈、脂蟾毒配基和華蟾酥毒基含量較高的樣品，且此樣本所含成分總量在全部批次中也是較高的，因此作者認(rèn)為這批樣品蟾酥的綜合質(zhì)量最佳，造成這一結(jié)果可能與這兩地氣候條件和地理位置有關(guān)，為該地大力發(fā)展蟾蜍養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

綜上，本研究不僅建立同時(shí)測(cè)定蟾酥中11種成分指紋圖譜，還與蟾酥質(zhì)量鑒定和品質(zhì)評(píng)價(jià)有一定的相關(guān)性，綜合評(píng)價(jià)蟾酥的質(zhì)量，為蟾酥生產(chǎn)過(guò)程中質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。在對(duì)蟾蜍的養(yǎng)殖過(guò)程中，應(yīng)充分考慮蟾蜍的生存條件，采用科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)馁|(zhì)量控制指標(biāo)，建立更為合理科學(xué)的馴養(yǎng)基地，提高產(chǎn)地經(jīng)濟(jì)效益。