楊靖源，蒙俊，楊堃

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院a.麻醉科，b.心血管外科，昆明 650032)

腸道是吸收營養(yǎng)成分和水分的主要器官，同時它也構(gòu)成了抵御外部環(huán)境有害物質(zhì)和病原體的重要屏障。腸黏膜屏障包括機(jī)械屏障、生物屏障、免疫屏障、化學(xué)屏障，其中機(jī)械屏障是腸黏膜屏障的重要組成[1]。單層上皮細(xì)胞構(gòu)成腸腔和黏膜組織之間的主要物理屏障，而細(xì)胞旁的空間由緊密連接封閉，緊密連接下面是黏附連接。緊密連接在細(xì)胞側(cè)空間形成首要屏障，發(fā)揮重要調(diào)控作用，維持腸黏膜上皮屏障功能的完整性[2]。當(dāng)腸道屏障功能受損時，腸道的通透性增高，腸內(nèi)細(xì)菌及毒素可轉(zhuǎn)移入血，從而導(dǎo)致腸源性的膿毒血癥，膿毒血癥繼發(fā)的全身炎癥反應(yīng)進(jìn)一步加重腸道屏障功能損傷，甚至引起膿毒性休克和多器官功能障礙綜合征[3]。腸緊密連接蛋白結(jié)構(gòu)是高度動態(tài)的，可使細(xì)胞不斷適應(yīng)其環(huán)境，腸緊密連接蛋白表達(dá)或功能的干擾以及(或)緊密連接蛋白完整性的破壞與多種腸道疾病及癌癥相關(guān)[4]?，F(xiàn)就腸緊密連接蛋白的結(jié)構(gòu)和功能、腸緊密連接蛋白的破壞因素以及腸緊密連接蛋白的功能調(diào)節(jié)予以綜述，以指導(dǎo)臨床工作中的腸道屏障功能保護(hù)。

1 腸緊密連接蛋白的結(jié)構(gòu)與功能

早在1963年，F(xiàn)arquhar和Palade[5]用電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)了緊密連接，提出細(xì)胞間緊密連接是一種膜蛋白復(fù)合體，在上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞間的連接方面發(fā)揮作用。緊密連接由不同的咬合蛋白(Occludin)、閉合蛋白(Claudins)及閉合小環(huán)蛋白(zonula occludens，ZOs)組成，這三類蛋白與肌動蛋白細(xì)胞骨架將相鄰細(xì)胞連接起來構(gòu)成上皮屏障[6]。緊密連接蛋白通過賦予細(xì)胞間離子、小分子和溶質(zhì)流動的選擇性，在細(xì)胞旁的通透性中起至關(guān)重要的作用。此外，緊密連接蛋白還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞極性，對細(xì)胞定向刺激的反應(yīng)性、運(yùn)輸功能以及增殖起重要作用[7]。

1.1Occludin Occludin是第一個完整的形成緊密連接的跨膜蛋白[8]。其是一個分子量為65 000的蛋白，有4個跨膜結(jié)構(gòu)域，轉(zhuǎn)錄后修飾成為幾種剪接變體。Occludin含有一個小的胞內(nèi)環(huán)和兩個胞外環(huán)，其中胞外環(huán)1和胞外環(huán)2參與相鄰細(xì)胞上表達(dá)的Occludin之間的親和作用。Occludin末端為N端和C端，末端均位于細(xì)胞內(nèi)，且C端部分較N端部分長，通過Occludin的翻譯后修飾調(diào)控緊密連接的組裝、結(jié)構(gòu)和功能[9]。Occludin的C端結(jié)構(gòu)域與各種緊密連接的細(xì)胞內(nèi)蛋白相互作用，包括ZO-1、ZO-2和ZO-3，這種相互作用是將Occludin組裝到緊密連接中所必需[10]。Occludin在維持緊密連接屏障中起關(guān)鍵作用，研究表明，在體內(nèi)和體外腸上皮細(xì)胞中，Occludin的缺失將導(dǎo)致大分子的選擇通透性增加[11]，造成腸道屏障功能損傷。

1.2Claudins Claudins于1998年首次被Furuse等[12]從雞肝的一個純化連接部分中分離出來。其是一個分子量為25 000～27 000的蛋白質(zhì)家族，在哺乳動物中最多由27個成員組成，具有很高的序列同源性[13]。與Occludin一樣，Claudins也可能受到翻譯后和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，其結(jié)構(gòu)與Occludin相似，僅C端較短。胞外環(huán)通過與Claudins或位于相鄰細(xì)胞上的Claudins相互作用促進(jìn)緊密連接的形成[14]。同時，Claudins可以形成不同特異性和通透性的細(xì)胞旁離子通道，它是調(diào)節(jié)緊密連接細(xì)胞旁通透性的主要決定因素[15]。此外，Claudins在腸道腫瘤患者中的表達(dá)是變化的，故被認(rèn)為是癌癥治療的診斷標(biāo)志物和靶點(diǎn)[16]。

1.3ZOs ZOs是連接細(xì)胞骨架和跨膜緊密連接蛋白的重要細(xì)胞內(nèi)緊密連接蛋白，其中ZO-1、ZO-2和ZO-3均為多結(jié)構(gòu)域蛋白，分別含有3個N端PDZ結(jié)構(gòu)域、1個中心SH3(Src homology 3)結(jié)構(gòu)域和1個與鳥苷酸激酶同源的區(qū)域，ZO-1可以與自身、ZO-2或ZO-3通過第二PDZ結(jié)構(gòu)域的相互作用發(fā)生二聚反應(yīng)；另外，ZO-1可部分通過其第二PDZ結(jié)構(gòu)域與膜磷脂酰肌醇結(jié)合的能力而部分靶向或穩(wěn)定在質(zhì)膜上，但它們具有與跨膜Claudins和Occludin結(jié)合的良好特性[17]。ZO-1與其他緊密連接蛋白有密切聯(lián)系，常被作為評價腸道屏障功能的指標(biāo)。一項(xiàng)回顧性研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌性膿毒癥患者的血清ZO-1水平顯著升高，而腹外感染源和腹內(nèi)感染源患者的血清ZO-1水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且可以與內(nèi)毒素一樣預(yù)測28 d死亡率[18]。

2 腸緊密連接蛋白的破壞因素

在腸道中，腸道微生物與宿主共同居住的不平衡可能威脅宿主健康，只有通過維持腸道屏障的完整性才能維持腸道微生物與宿主的平衡狀態(tài)。通常任何感染或嚴(yán)重的額外腸外傷等均可能導(dǎo)致嚴(yán)重的創(chuàng)傷，從而引起腸道屏障穩(wěn)態(tài)的顯著改變，這將導(dǎo)致腸道緊密連接破壞，上皮細(xì)胞通透性增加以及隨后的炎癥信號造成的腸道細(xì)胞損傷[19]。

2.1腸道相關(guān)疾病 在腸道病毒感染和細(xì)菌感染中，緊密連接蛋白通常是細(xì)菌毒素或炎癥因子的靶點(diǎn)，最終導(dǎo)致緊密連接蛋白結(jié)構(gòu)的破壞，腸道通透性增加，從而進(jìn)一步促進(jìn)病原體移位至腸道外組織甚至血液循環(huán)[20]。致病性大腸埃希菌是腹瀉的常見病原體，該細(xì)菌通過激活各種蛋白激酶(包括肌球蛋白輕鏈激酶等)引起一系列細(xì)胞反應(yīng)，從而導(dǎo)致緊密連接結(jié)構(gòu)破壞和細(xì)胞旁通透性增加[21]。另外，炎性腸病也會引起緊密連接蛋白的破壞。Tan等[22]研究發(fā)現(xiàn)，潰瘍性結(jié)腸炎患者的Claudin-2表達(dá)上調(diào)，Occludin和ZO-1表達(dá)減少。炎癥狀態(tài)下緊密連接蛋白屏障功能受損，細(xì)胞旁通透性增加，最終觸發(fā)細(xì)胞凋亡導(dǎo)致腸上皮損傷形成糜爛和潰瘍，而免疫細(xì)胞通過破壞的緊密連接進(jìn)入腸黏膜，通過刺激促炎細(xì)胞因子釋放促進(jìn)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)一步破壞腸道屏障[23]。如果因腸道疾病感染引起了膿毒癥，Claudin-2的表達(dá)水平會升高，而Claudin-5和Occludin的表達(dá)水平降低[24]。

2.2外科手術(shù)操作 圍手術(shù)期應(yīng)激和疼痛刺激可誘發(fā)細(xì)胞因子和急性期反應(yīng)物釋放，升高血兒茶酚胺水平，激活腎素-血管緊張素系統(tǒng)，然而交感神經(jīng)系統(tǒng)活動增加和血液中兒茶酚胺水平升高會導(dǎo)致心動過速和內(nèi)臟血管收縮。嚴(yán)重的血管收縮可能使血液重新分配到遠(yuǎn)離內(nèi)臟的地方，進(jìn)而降低小血管的通暢性，影響其灌流[25]。這種嚴(yán)重持續(xù)的內(nèi)臟動脈收縮可能導(dǎo)致胃腸黏膜缺血，黏膜屏障破壞或應(yīng)激性潰瘍出血。如在腹腔鏡或開腹結(jié)腸切除過程中，腸緊密連接破壞，腸道屏障功能受損，患者體內(nèi)內(nèi)毒素水平和腸道通透性均顯著升高，并伴隨細(xì)菌易位[26]。

2.3失血性休克 失血性休克是一種以組織灌注不足為特征的臨床疾病。失血性休克通過破壞腸上皮完整性和增加通透性導(dǎo)致腸道屏障功能障礙。有研究表明，失血性休克可導(dǎo)致肌動蛋白解聚因子/粘連蛋白激活，選擇性腸肌動蛋白細(xì)胞骨架破壞，并在休克早期發(fā)生緊密連接蛋白丟失[26]。這種腸道屏障的喪失會導(dǎo)致毒素和細(xì)菌的移位，從而加重炎癥并導(dǎo)致感染。一項(xiàng)大鼠失血性休克的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了上述觀點(diǎn)，結(jié)果顯示，休克大鼠回腸的腸黏膜絨毛出現(xiàn)嚴(yán)重水腫、增粗甚至壞死脫落，大量的細(xì)胞核發(fā)生固縮，上皮細(xì)胞緊密連接寬度增加；同時，休克大鼠回腸組織ZO-1、Occludin蛋白的染色變淡，分布出現(xiàn)不均勻，ZO-1、Occludin蛋白的表達(dá)水平明顯降低[27]。

3 腸緊密連接蛋白的功能調(diào)節(jié)

腸緊密連接蛋白受到嚴(yán)格調(diào)節(jié)對于維持正常腸道屏障完整性至關(guān)重要。腸上皮細(xì)胞迅速增殖并快速更新，因此應(yīng)嚴(yán)格控制緊密連接蛋白以避免對膜完整性的任何不利影響。緊密連接蛋白受多種物質(zhì)的調(diào)節(jié)，這些調(diào)節(jié)均通過各種信號蛋白和信號分子來實(shí)現(xiàn)，但調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確[28]。

3.1細(xì)胞因子 細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞和某些非免疫細(xì)胞經(jīng)刺激而合成、分泌的一類具有廣泛生物學(xué)活性的小分子蛋白質(zhì)。根據(jù)在炎癥反應(yīng)中的作用，其可分為促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子。在所有上皮細(xì)胞中，緊密連接的組裝和拆卸是一個涉及內(nèi)吞、遷移和再循環(huán)的動態(tài)過程，這個過程受到多種細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)[29]。其中，促炎細(xì)胞因子主要包括白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6、IL-13、IL-17、IL-18、IL-21以及腫瘤壞死因子-α，它們會破壞腸緊密連接，改變腸道通透性，影響腸道屏障功能。然而，抗炎細(xì)胞因子(如IL-10、IL-11)則可以增加緊密連接蛋白的表達(dá)，維持腸道屏障的完整性。所以，通過抑制促炎細(xì)胞因子和增強(qiáng)抗炎細(xì)胞因子的作用來恢復(fù)免疫失調(diào)和調(diào)節(jié)腸道屏障功能，將為腸道疾病的治療提供新思路。

3.2右美托咪定 右美托咪定是一種高效選擇性的α2腎上腺素能受體激動劑，在臨床常被用作麻醉、鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)靜的輔助藥物。近年來，研究已證實(shí)右美托咪定對多種器官具有保護(hù)作用，包括心臟、肺、腎臟、肝臟和小腸，可減輕炎癥反應(yīng)，激活抗凋亡信號通路，從而保護(hù)細(xì)胞免受損傷[30]。一項(xiàng)內(nèi)毒素血癥和膿毒癥的動物實(shí)驗(yàn)表明，右美托咪定可減輕腸微循環(huán)功能障礙，減少腸黏膜細(xì)胞凋亡和緊密連接損傷，對內(nèi)毒素血癥大鼠腸上皮屏障有保護(hù)作用[31]。此外，在缺血再灌注動物實(shí)驗(yàn)中，右美托咪定預(yù)處理可顯著減少缺血再灌注引起的腸組織損傷[32]。然而，當(dāng)前的大多數(shù)右美托咪定研究均基于動物實(shí)驗(yàn)，且其機(jī)制尚未完全闡明，故還需要進(jìn)行深入研究。

3.3表皮生長因子 表皮生長因子作為有絲分裂原，參與調(diào)節(jié)基礎(chǔ)條件下的修復(fù)和生存以及各種損傷。有研究通過觀察表皮生長因子對大鼠小腸缺血再灌注損傷后增殖和修復(fù)的影響發(fā)現(xiàn)，外源性表皮生長因子以類似于增殖和組織損傷的方式加速了缺血再灌注后ZO-1和Occludin蛋白的恢復(fù)，應(yīng)用表皮生長因子后，絨毛上皮部分恢復(fù)，緊密連接蛋白表達(dá)有不同程度的恢復(fù)，共聚焦成像結(jié)果與蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果基本一致，共同證實(shí)了表皮生長因子對腸缺血再灌注損傷后緊密連接蛋白恢復(fù)的影響[33]。表皮生長因子對腸道損傷的生長修復(fù)提供了重要幫助，因此其在腸道相關(guān)疾病的治療方面將有廣闊的應(yīng)用前景。

3.4維生素D 維生素D被認(rèn)為與廣泛的生物活性有關(guān)，其中包括維生素D在維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面的作用。如維生素D能穩(wěn)定上皮間的連接，促進(jìn)腸道微生物區(qū)系和腸道免疫之間的適當(dāng)平衡[34]。在一項(xiàng)體外和體內(nèi)胃蛋白酶-胰蛋白酶抗性的醇溶蛋白誘導(dǎo)的緊密連接損傷試驗(yàn)中[35]，維生素D能顯著減輕緊密連接蛋白損傷引起的腸黏膜屏障通透性增加，同時通過維生素D上調(diào)緊密連接蛋白表達(dá)，顯著減少髓系分化因子88的表達(dá)和Zonulin的釋放，其機(jī)制可能與干擾髓系分化因子88依賴的Zonulin釋放信號通路有關(guān)。另一項(xiàng)利用脂多糖誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞損傷的研究發(fā)現(xiàn)，脂多糖可使腸上皮細(xì)胞-18活力降低，而維生素D可抑制腸上皮細(xì)胞-18的炎癥反應(yīng)，恢復(fù)ZO-1和Claudin-2的緊密連接，減少損傷器官中腫瘤壞死因子-α的表達(dá)，阻止ZO-1的破壞[36]。這表明，維生素D的腸道保護(hù)作用，可能可作為一種腸道保護(hù)治療策略。

3.5谷氨酰胺 在腸黏膜中，谷氨酰胺是一種獨(dú)特的營養(yǎng)物質(zhì)，可為新陳代謝、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、修復(fù)和維持腸道屏障功能提供能量。研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酰胺可以促進(jìn)緊密連接蛋白Claudin-1和Occludin的表達(dá)，其可能通過反式激活表皮生長因子受體、蛋白激酶C和促分裂原活化的蛋白激酶，誘導(dǎo)緊密連接蛋白的表達(dá)[37]。雖然谷氨酰胺是維持動物和人類腸道屏障功能的主要營養(yǎng)素，谷氨酰胺消耗會導(dǎo)致絨毛皺縮、緊密連接蛋白表達(dá)減少和腸通透性增加，通過補(bǔ)充谷氨酰胺可以在幾種損傷實(shí)驗(yàn)條件下和某些臨床情況下改善腸道屏障功能，但在臨床實(shí)踐中需進(jìn)一步研究并評估谷氨酰胺，以減輕腸道不適并避免可能的高通透性并發(fā)癥，如全身炎癥反應(yīng)綜合征和敗血癥[38]。

3.6其他 除以上幾種物質(zhì)外，一氧化碳釋放分子2、雌孕激素均對腸道緊密連接具有保護(hù)作用。一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大鼠在盲腸結(jié)扎穿孔后，一氧化碳釋放分子2可顯著減少膿毒癥引起的腸黏膜損傷緊密連接蛋白(包括ZO-1、Claudin-1和Occludin)減少、肌球蛋白輕鏈的磷酸化和促炎細(xì)胞因子的釋放，總體揭示了一氧化碳釋放分子2抑制了膿毒癥誘導(dǎo)的腸上皮通透性改變，降低了膿毒癥大鼠的死亡率[39]。近年研究顯示，雌孕激素可減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)腸道上皮細(xì)胞，增強(qiáng)上皮細(xì)胞屏障功能，對疾病活躍度產(chǎn)生有益的影響[40]。

4 小 結(jié)

腸緊密連接蛋白對腸上皮屏障功能至關(guān)重要，不僅可以通過限制蛋白質(zhì)在質(zhì)膜內(nèi)的運(yùn)動以及調(diào)節(jié)細(xì)胞旁的溶質(zhì)和水通量來維持細(xì)胞極性，同時還充當(dāng)信號中樞。腸緊密連接蛋白表達(dá)、功能的紊亂和(或)腸緊密連接完整性的破壞與疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)。各種緊密連接蛋白的結(jié)構(gòu)功能復(fù)雜，其與腸道疾病的發(fā)展轉(zhuǎn)歸存在復(fù)雜的關(guān)系。隨著對腸緊密連接蛋白的不斷研究，影響腸緊密連接蛋白信號通路方面的研究將不斷深入，這也將為腸道屏障功能的保護(hù)提供更多重要的臨床指導(dǎo)依據(jù)。