白登彥 王冠 張海軍 朱濤 趙志鵬

1.甘肅省第二人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730015 2.西北民族大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730015

骨質(zhì)疏松(osteoporosis，OP)主要表現(xiàn)為骨微結(jié)構(gòu)改變及骨強(qiáng)度降低，其發(fā)病機(jī)制與雌激素降低等多種因素有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)[1-2]，基質(zhì)金屬蛋白酶代謝對(duì)成骨細(xì)胞的分化、增殖及代謝起關(guān)鍵作用，其中基質(zhì)金屬蛋白酶-7(matrix metalloproteinase-3，MMP-7)和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1(tissue inhibitor of metalloproteinases 1，TIMP-1)的含量變化與OP發(fā)病存在密切關(guān)系[3-4]。大豆苷元是大豆異黃酮的主要成分之一，與17β-雌二醇的結(jié)構(gòu)相似，研究指出[5]，大豆苷元能夠干預(yù)破骨細(xì)胞的形成，調(diào)控骨質(zhì)疏松過(guò)程，但機(jī)制不明確。研究發(fā)現(xiàn)[6]，刺猬(Hedgehog，Hh)信號(hào)通路與雌激素通路有相互促進(jìn)作用，而且能干預(yù)成骨細(xì)胞，調(diào)控骨細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖。本研究通過(guò)大豆苷元濃縮液灌胃干預(yù)OP模型大鼠，探究大豆苷元對(duì)Hedgehog信號(hào)通路的調(diào)控作用，并分析其對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性SPF級(jí)20周齡Wistar大鼠60只(購(gòu)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(甘)2020-0001)，體質(zhì)量(200±20)g，飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF動(dòng)物中心，適應(yīng)性自由進(jìn)食、飲水，1周后進(jìn)行OP實(shí)驗(yàn)造模。

1.2 藥物、試劑及儀器

大豆苷元(北京藥品生物制品檢定所，純度>98%，批號(hào)：20001)，血清雌激素(E2)、骨鈣素(BGP)、血清堿性磷酸酶(ALP)試劑盒(上海信帆生物，批號(hào)：E202009P、E202041P、E202033P)。PBS緩沖液(北京藍(lán)博斯特)，瓊脂糖(濟(jì)南匯錦川)，TRIZOL試劑(北京萊博潤(rùn)科)，兔多克隆抗體PTC1、Gli1、Shh(美國(guó)Sigma，批號(hào)：47014、43022、42150)；羊抗兔二抗(美國(guó)Thermo，批號(hào)：QE225340)；SDS-PAGE試劑盒(批號(hào)：45420)、PCR試劑盒(批號(hào)：45525)、BCA檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：48751)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(批號(hào)：76330)、ECL試劑盒(批號(hào)：98417)均購(gòu)自美國(guó)CST公司，奧林巴斯光學(xué)顯微鏡(JAPAN)；PCR熱循環(huán)儀及熒光定量PCR儀(美國(guó)伯樂(lè))。

1.3 動(dòng)物分組、造模及處理

將60只大鼠按隨機(jī)數(shù)字法分為假手術(shù)組、模型組、大豆苷元治療低、中、高劑量組共5組，每組12只。除假手術(shù)組外，其他組大鼠按照參考文獻(xiàn)[7]，腹腔麻醉后，沿腹中線劍突下切口，分離中下腹部肌肉，打開(kāi)腹膜，暴露大鼠腹腔，切除雙側(cè)卵巢后制備OP模型。術(shù)后控制飲食，自由飲水。造模成功后開(kāi)始灌胃治療，假手術(shù)組及模型組給予等劑量生理鹽水灌胃，大豆苷元低、中、高劑量組大鼠分別按人鼠比例2.42、4.84、9.68 mg/(kg·d)灌胃治療，1次/d，共持續(xù)12周。灌胃結(jié)束24 h后，大鼠股動(dòng)脈取血5 mL，迅速離心并提取上清液保存。處死大鼠后取股骨組織樣品4份保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 指標(biāo)處理及檢測(cè)

1.4.1ELISA檢測(cè)：取上清液，參照ELISA試劑操作說(shuō)明，檢測(cè)各組大鼠血清中血清E2、BGP、ALP含量水平變化。

1.4.2免疫組化檢測(cè)：取各組大鼠股骨組織進(jìn)行石蠟包埋切片，脫蠟后水洗進(jìn)行抗原修復(fù)后室溫孵育過(guò)夜，PBS洗滌3次，室溫孵育60 min，滴加一抗二抗后，PBS洗滌3次，DAB在顯微鏡下染色，高倍鏡下(×400)觀察各組標(biāo)本中MMP-7及TIMP-1陽(yáng)性染色情況，并進(jìn)行半定量分析。

1.4.3TUNEL法檢測(cè)：取各組大鼠股骨組織，常規(guī)方法石蠟切片后二甲苯洗滌2次，每次5 min，梯度乙醇浸洗后PBS漂洗細(xì)胞通透液處理，加入含過(guò)氧化氫的PBS漂洗后加入TUNEL反應(yīng)混合液于標(biāo)本上檢測(cè)標(biāo)本中各組大鼠骨組織細(xì)胞凋亡情況，顯微鏡下記錄并拍照。

1.4.4RT-PCR法檢測(cè)：RNA抽提試劑盒提取各組大鼠骨組織中總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲取各組cDNA后設(shè)計(jì)引物序列，參考RT-PCR實(shí)驗(yàn)方法對(duì)各組Shh、PTC1、Gli1 mRNA表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，內(nèi)參為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)，采用 2-ΔΔCt方法分析不同組別mRNA表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.4.5Western blot檢測(cè)：各組股骨組織中加入RIPA裂解緩沖液提取樣本中的總蛋白，參照BCA檢測(cè)說(shuō)明測(cè)定各組股骨組織中蛋白的含量。SDS-PAGE將蛋白質(zhì)等量分離，4 ℃條件下PDVF膜上添加一抗孵育過(guò)夜。PBS洗滌后常溫下添加二抗2 h孵育。ECL試劑顯影后應(yīng)用軟件Quantity One測(cè)定PTC1、Gli1、Shh蛋白表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 血清E2、BGP、ALP水平變化

與假手術(shù)組大鼠對(duì)比，模型組大鼠的BGP、ALP升高，E2含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組對(duì)比，大豆苷元治療組BGP、ALP含量降低，E2含量升高(P<0.05)，且大豆苷元隨劑量增加治療效果更加明顯(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 不同組大鼠血清E2、BGP、ALP含量對(duì)比

2.2 股骨組織中MMP-7及TIMP-1蛋白含量變化

免疫組化染色結(jié)果顯示，模型組大鼠組織中MMP-7及TIMP-1表達(dá)明顯增多；干預(yù)治療后，各治療組MMP-7及TIMP-1表達(dá)明顯減少，其中大豆苷元隨劑量增加治療效果更加明顯(P<0.01)。見(jiàn)圖1，表3。

圖1 大鼠骨組織中MMP-7及TIMP-1含量對(duì)比(×400)Fig.1 Comparison between MMP-7 and TIMP-1 contents in bone tissue of rats(×400) 注：A：假手術(shù)組，B：模型組，C：大豆苷元低劑量組，D：大豆苷元中劑量組，E：大豆苷元高劑量組。

表3 大鼠骨組織中MMP-7及TIMP-1含量對(duì)比

2.3 股骨組織細(xì)胞凋亡情況比較

藍(lán)色熒光為正常細(xì)胞核，綠色熒光為凋亡細(xì)胞。鏡下顯示，假手術(shù)組大鼠骨組織正常，綠色熒光極少；模型組大鼠造模后綠色熒光增多，提示凋亡細(xì)胞增加；干預(yù)治療后，各治療組大鼠股骨遠(yuǎn)端細(xì)胞凋亡數(shù)量減少，其中大豆苷元隨劑量增加治療效果更加明顯。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠股骨遠(yuǎn)端細(xì)胞凋亡情況(×200)Fig.2 Apoptosis of the distal femur cells in each group(×200)

2.4 股骨組織中PTC1、Gli1、Shh mRNA表達(dá)水平

與假手術(shù)組對(duì)比，模型組大鼠股骨組織中PTC1、Gli1、Shh mRNA表達(dá)升高(P<0.05)。與模型組對(duì)比，各治療組PTC1、Gli1、Shh mRNA含量明顯降低(P<0.05)，且大豆苷元的治療效果隨劑量增加更加明顯(P<0.01)。見(jiàn)圖3。

圖3 股骨組織中PTC1、Gli1、Shh mRNA表達(dá)量比較Fig.3 Comparison among PTC1, Gli1, and Shh mRNA expression in the femur注：A：假手術(shù)組，B：模型組，C：大豆苷元低劑量組，D：大豆苷元中劑量組，E：大豆苷元高劑量組。與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05。

2.5 股骨組織中PTC1、Gli1、Shh蛋白表達(dá)水平

與假手術(shù)組對(duì)比，模型組股骨組織中PTC1、Gli1、Shh蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。與模型組對(duì)比，各治療組PTC1、Gli1、Shh蛋白含量表達(dá)降低(P<0.05)，且大豆苷元的治療效果隨劑量增加更加明顯(P<0.01)。見(jiàn)圖4。

圖4 股骨組織中PTC1、Gli1、Shh蛋白表達(dá)對(duì)比Fig.4 Comparison among PTC1, Gli1, and Shh protein expression in the femur注：A：假手術(shù)組，B：模型組，C：大豆苷元低劑量組，D：大豆苷元中劑量組，E：大豆苷元高劑量組。與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05。

3 討論

雌激素替代治療是雌激素缺乏導(dǎo)致的OP的主要治療方法，但其禁忌癥較多[8]。植物激素存在與雌激素相似的功能和結(jié)構(gòu)，其中部分植物激素在組織中能夠選擇性地與雌激素受體(ER)結(jié)合，發(fā)揮弱雌激素樣活性作用。大豆苷元是一種具有類似雌激素功能的非甾類化合物。研究顯示[9-10]，大豆苷元能夠有效抗雌激素活性，改善骨損傷，干預(yù)成骨細(xì)胞的形成，但其具體機(jī)制不詳。

血清E2濃度是反映絕經(jīng)后機(jī)體雌激素水平最重要的一種激素[11]。BGP和ALP由成骨細(xì)胞分泌產(chǎn)生，其表達(dá)水平能夠體現(xiàn)骨形成與骨吸收的過(guò)程，是評(píng)估骨質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)[12]。本研究結(jié)果顯示，在摘除大鼠卵巢后，大鼠E2含量明顯降低，BGP、ALP含量升高，證明大鼠在造模后雌激素降低，骨質(zhì)量發(fā)生改變，經(jīng)過(guò)大豆苷元干預(yù)后，OP大鼠E2明顯升高，BGP、ALP含量明顯降低，說(shuō)明OP大鼠在大豆苷元干預(yù)后，雌激素水平及骨的發(fā)育得到一定改善。MMP-7是骨吸收過(guò)程中具有降解細(xì)胞外基質(zhì)作用的酶，在OP發(fā)病過(guò)程中MMP-7過(guò)表達(dá)可降解細(xì)胞外蛋白多糖、IX型膠原等多種基質(zhì)蛋白產(chǎn)物，影響骨組織平衡狀態(tài)下基質(zhì)的合成與分解，加速骨吸收過(guò)程[13]。TIMPs作為金屬蛋白酶抑制因子，對(duì)組織中的間質(zhì)膠原酶以及間質(zhì)溶解素具有特異性，可直接與活化的MMPs家族形成1∶1復(fù)合體進(jìn)而抑制MMPs活性，降低MMP-7對(duì)骨組織的損害[14]。本研究顯示，OP大鼠的骨組織在造模后MMP-7及TIMP-1蛋白含量發(fā)生明顯變化，MMP-7表達(dá)增高，TIMP-1表達(dá)降低，經(jīng)大豆苷元干預(yù)治療后，MMP-7及TIMP-1蛋白含量發(fā)生明顯改善，這說(shuō)明大豆苷元干預(yù)了骨組織中MMP-7及TIMP-1的蛋白表達(dá)。

Hh信號(hào)通路是骨細(xì)胞分化過(guò)程中的關(guān)鍵通路之一，與骨細(xì)胞形成及骨代謝疾病存在密切關(guān)系[15]。在骨細(xì)胞分化過(guò)程中，Hh信號(hào)通路的關(guān)鍵受體音猬因子(Shh)與下游基因12次跨膜蛋白Ptched1(Ptch1)和膠質(zhì)瘤相關(guān)腫瘤基因同源物 1(Gli-1)在成骨細(xì)胞中表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞[16-17]。骨缺損和骨再生過(guò)程中Shh含量變化可激發(fā)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，這是促進(jìn)骨組織生成的關(guān)鍵因素[18]。正常骨組織中Hh信號(hào)活性較低，當(dāng)激發(fā)骨細(xì)胞分化時(shí)，Hh通路中關(guān)鍵的因子含量發(fā)生明顯變化，其中關(guān)鍵因子Gli1能夠調(diào)控膜型金屬基質(zhì)蛋白酶(MTI-MMP)的表達(dá)來(lái)促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲，而Shh表達(dá)變化與MMP-7及TIMP-1存在密切聯(lián)系[19-20]。本研究也表明，OP大鼠造模成功后，骨組織細(xì)胞凋亡明顯增加，基質(zhì)金屬蛋白酶發(fā)生改變，PTC1、Gli1、Shh蛋白及基因表達(dá)也發(fā)生明顯改變，這說(shuō)明Hh信號(hào)通路參與了OP的發(fā)病過(guò)程。而且本實(shí)驗(yàn)還證實(shí)，大豆苷元干預(yù)OP大鼠后，大鼠骨細(xì)胞凋亡情況顯著改善，而骨組織中Hh信號(hào)通路相關(guān)蛋白基因及基質(zhì)金屬蛋白酶也發(fā)生明顯改善，這也證明大豆苷元有效調(diào)控了OP大鼠Hh信號(hào)通路的表達(dá)，影響細(xì)胞凋亡過(guò)程，干預(yù)了基質(zhì)金屬蛋白酶代謝，進(jìn)而影響OP的發(fā)病過(guò)程。

綜上所述，大豆苷元可調(diào)控Hh信號(hào)通路，影響基質(zhì)金屬蛋白酶代謝，干預(yù)骨細(xì)胞凋亡過(guò)程，但其干預(yù)的具體機(jī)制仍需深入研究。