顧曉東 李鵬翠 李飛

1.山西白求恩醫(yī)院骨科，山西 太原 030032 2.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，骨與軟組織損傷修復(fù)山西省重點實驗室，山西 太原 030001

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是中老年人常見的關(guān)節(jié)疾病，因關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙，嚴(yán)重影響患者的日常生活[1]。關(guān)節(jié)軟骨退行性變是OA最顯著的病理特征，隨著病變的進(jìn)展，會繼發(fā)出現(xiàn)關(guān)節(jié)周圍骨質(zhì)增生，關(guān)節(jié)畸形，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛及功能喪失[2-3]。雖然在不斷地進(jìn)行研究，但是關(guān)節(jié)軟骨退變的機(jī)制不清楚，目前尚未有有效的方法延緩或者逆轉(zhuǎn)關(guān)節(jié)軟骨退變的發(fā)生。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)，OA人群肥大化軟骨細(xì)胞在關(guān)節(jié)軟骨中的占比增高，這種細(xì)胞會大量分泌蛋白酶降解基質(zhì)，最終破壞軟骨，引起嚴(yán)重關(guān)節(jié)功能障礙[4]。

組蛋白去乙?；?(HDAC4)是調(diào)控軟骨細(xì)胞發(fā)生肥大樣表型變化的關(guān)鍵酶類，其可以抑制Runx-2的表達(dá)，進(jìn)而抑制軟骨細(xì)胞發(fā)生肥大樣改變[5-6]。研究表明，OA患者關(guān)節(jié)軟骨組織HDAC4的含量較正常軟骨組織明顯降低[7]。然而其在OA發(fā)生發(fā)展過程中的變化趨勢和與關(guān)節(jié)軟骨損傷程度之間的關(guān)系并不清楚。本研究擬通過構(gòu)建大鼠膝關(guān)節(jié)OA模型，研究OA發(fā)生發(fā)展過程中HDAC4及其下游分子Runx-2的變化規(guī)律及其與關(guān)節(jié)軟骨退變的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

54只8周齡雄性SD大鼠，購自山西醫(yī)科大學(xué)動物部，實驗通過了倫理審查，并且符合相關(guān)部門關(guān)于實驗動物管理和使用規(guī)定。

1.2 主要試劑及儀器

Ⅱ型膠原酶及番紅染色劑購自美國Sigma公司；IL-1β購自PeproTech公司；HDAC4一抗購自美國Proteintech公司；Runx-2一抗購自北京博奧森公司；免疫組化試劑購自北京中杉金橋公司；TRIzol試劑購自Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄、PCR試劑購自日本TAKARA公司；熒光定量PCR引物由上海生工公司合成。

1.3 軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng)

出生3 d內(nèi)的SD大鼠乳鼠，脫頸處死，75%乙醇浸泡消毒。分離乳鼠胸廓組織，PBS清洗3次，加入0.2%的Ⅱ型膠原酶，37 ℃消化90 min，更換0.05% Ⅱ型膠原酶，37 ℃消化3 h，過濾并收集消化液，低速離心10 min，沉淀為軟骨細(xì)胞團(tuán)，PBS漂洗及離心后，用含10%的胎牛血清的培養(yǎng)基吹打混勻，按照105個/cm2接種，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)[8]。

1.4 體外OA模型

第2代軟骨細(xì)胞分為實驗組和對照組，細(xì)胞生長至60%～70%時，實驗組加入IL-1β，使其在培養(yǎng)液中的濃度為10 ng/mL，對照組加等體積無菌PBS緩沖液，48 h后行Western blot檢測HDAC4和Runx-2的表達(dá)。

1.5 Western blot檢測

提取細(xì)胞全蛋白，SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉2 h。添加HDAC4(1∶500)、Runx-2(1∶500)抗體，4 ℃過夜。TBST洗膜，然后加入稀釋的二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h。再次用TBST洗膜，超敏ECL顯色并攝取圖像。Image Lab軟件分析條帶灰度值，β-actin為內(nèi)參，計算蛋白相對表達(dá)量。

1.6 實驗動物分組與手術(shù)

54只8周齡雄性SD大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=27)和前交叉韌帶切斷(ACLT)組(n=27)。手術(shù)簡述：大鼠腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉 (1 mL/100 g)麻醉。右膝消毒后鋪無菌單。切開皮膚，采用髕內(nèi)切口，切開關(guān)節(jié)腔，采用11號尖刀片切斷ACL，抽屜試驗陽性代表手術(shù)成功。假手術(shù)組只切開關(guān)節(jié)囊。

1.7 動物取材

術(shù)后2、4、8周兩組各取9只大鼠過量麻藥安樂處死，取右膝關(guān)節(jié)，脛骨平臺做番紅固綠及免疫組化檢測，股骨髁軟骨用于RT-qPCR實驗[8]。

1.8 番紅固綠染色及OARSI評分

大鼠脛骨平臺通過4%多聚甲醛常溫固定，10% EDTA脫鈣6周，制備6 μm組織切片。脫蠟至水，蘇木素染色1 min，流水清洗后鹽酸酒精分化15 s，再次清洗2 min。0.05%固綠染色5 min，1%乙酸酸化。蒸餾水清洗后，0.5%番紅O染色2 min。脫水透明，封片。關(guān)節(jié)軟骨損傷程度采用OARSI評分[9]。

1.9 免疫組織化學(xué)染色

制備大鼠脛骨平臺6 μm組織切片，脫蠟至水，3% H2O2使內(nèi)源性過氧化物酶失活，加入酶消化液行抗原修復(fù)，滴加HDAC4(1∶50)、Runx-2(1∶50)抗體，37 ℃孵育120 min；PBS沖洗后加入羊抗兔IgG聚合物，37 ℃孵育30 min；DAB顯色，蘇木素復(fù)染。

1.10 RT-qPCR檢測

將大鼠股骨髁軟骨用刀片切下，每3只大鼠股骨髁軟骨混合成一份樣本，共3份樣本。TRIzol試劑提取關(guān)節(jié)軟骨中的總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。在QuantStudioTM6 Flex Real-Time PCR儀，使用TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ進(jìn)行兩步法RT-qPCR反應(yīng)?；虻南鄬Ρ磉_(dá)量采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行計算。引物序列：18SrRNAF: GATGCGGCGGCGTTATT CCC ，R: GTGGTGCCCTTCCGTCAATTCC；HDAC4 F: GGCTTCCTTGTGGTGGTGTTGG ，R: TGTACTCTCCT CGGCATGGTGTC；Runx-2 F: AACAGCAGCAGCAG CAGCAG ，R: GCACGGAGCACAGGAAGTTGG。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 體外OA模型HDAC4和Runx-2的蛋白表達(dá)量

Western blot表明，實驗組(IL-1β組)細(xì)胞HDAC4的表達(dá)量較對照組細(xì)胞降低(P<0.05)，而Runx-2的表達(dá)量較對照組升高(P<0.05)(圖1)。

圖1 各組細(xì)胞HDAC4和Runx-2蛋白表達(dá)情況Fig.1 Protein expression of HDAC4 and Runx-2 in each group注：和對照組比較，*P<0.05。

2.2 不同時間點大鼠關(guān)節(jié)軟骨番紅固綠染色及OARSI評分

番紅固綠染色結(jié)果表明，前交叉韌帶切斷組脛骨平臺軟骨在2周時可見軟骨表面尚平整，未見明顯關(guān)節(jié)軟骨破壞，但軟骨表面開始纖維化，軟骨表層番紅著色淺；4周時軟骨表面開始出現(xiàn)裂隙，番紅著色進(jìn)一步減少，8周時軟骨表層破壞明顯，裂隙延伸到軟骨中層，部分區(qū)域軟骨細(xì)胞呈簇狀增生，番紅染色明顯減少。各時間點假手術(shù)組的軟骨表面完整，番紅著色均勻。OARSI評分結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，前交叉韌帶切斷組各時間點評分均升高(P<0.05)。各時間點假手術(shù)組評分差異不明顯；前交叉韌帶切斷組評分隨時間延長升高(P<0.05)(圖2)。

圖2 假手術(shù)組和前交叉韌帶切斷組不同時間點番紅固綠染色及OARSI評分結(jié)果(×100，標(biāo)尺：100 μm)Fig.2 Safranin O/Fast green staining and OARSI scores at different time points in Sham and anterior cruciate ligament transection group (×100, scale bar: 100 μ m)注：和假手術(shù)組比較，*P<0.05；和2周ACLT組比較，#P<0.05；和4周ACLT組比較，&P<0.05。

2.3 大鼠關(guān)節(jié)軟骨HDAC4和Runx-2免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

免疫組化結(jié)果顯示，前交叉韌帶切斷組脛骨平臺軟骨HDAC4陽性染色細(xì)胞隨著造模時間延長，其數(shù)量逐漸降低，而Runx-2陽性染色細(xì)胞數(shù)隨著造模時間的延長，其數(shù)量逐漸增加，各時間點差異明顯(P<0.05)。假手術(shù)組作為對照組，雖然HDAC4的表達(dá)隨時間推移有所降低，Runx-2的表達(dá)隨著造模時間延長有所增加(P<0.05)，但不如前交叉韌帶切斷組明顯(圖3、4)。

圖3 各組不同時間點HDAC4免疫組化染色結(jié)果(×200)Fig.3 Immunohistochemical staining of HDAC4 at different time points in each group (×200)注：和假手術(shù)組比較，*P<0.05；和2周ACLT組比較，#P<0.05；和4周ACLT組比較，&P<0.05；和2周假手術(shù)組比較，^P<0.05；和4周假手術(shù)組比較，%P<0.05。

圖4 各組不同時間點Runx-2免疫組化染色結(jié)果(×200)Fig.4 Immunohistochemical staining of Runx-2 at different time points in each group (×200)注：和假手術(shù)組比較，*P<0.05；和2周ACLT組比較，#P<0.05；和4周ACLT組比較，&P<0.05；和2周假手術(shù)組比較，^P<0.05；和4周假手術(shù)組比較，%P<0.05。

2.4 大鼠關(guān)節(jié)軟骨HDAC4、Runx-2 mRNA表達(dá)量

RT-qPCR結(jié)果顯示，在相同時間點內(nèi)，ACLT組HDAC4的表達(dá)較假手術(shù)組降低，Runx-2的表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。組內(nèi)比較，ACLT組HDAC4的表達(dá)隨時間推移逐漸降低，Runx-2的表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。假手術(shù)組HDAC4、Runx-2的表達(dá)隨時間推移雖有差異，但沒有ACLT組明顯(圖5)。

圖5 各組不同時間點HDAC4和Runx-2 mRNA的表達(dá)比較Fig.5 Comparison of HDAC4 and Runx-2 mRNA expression at different time points between each group注：和假手術(shù)組比較，*P<0.05；和2周ACLT組比較，#P<0.05；和4周ACLT組比較，&P<0.05；和2周假手術(shù)組比較，^P<0.05；和4周假手術(shù)組比較，%P<0.05。

3 討論

軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨中僅有的細(xì)胞種類，其散在分布于關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)中，軟骨細(xì)胞在維持軟骨的正常合成和降解代謝中十分關(guān)鍵[10]。軟骨細(xì)胞表型及其功能的改變會破壞軟骨的代謝穩(wěn)定性，從而破壞軟骨正常的生物力學(xué)性能，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨損傷。在OA病變軟骨進(jìn)行性退變破壞過程中，軟骨細(xì)胞發(fā)生了肥大樣改變。肥大的軟骨細(xì)胞表達(dá)Runx-2、MMP-13等因子水平升高，導(dǎo)致軟骨破壞[11-12]。其中，Runx-2在調(diào)控細(xì)胞肥大表型中起關(guān)鍵作用[13]。Runx-2可以促進(jìn)其下游MMP-13、ADAMTS5等軟骨基質(zhì)降解酶類的表達(dá)，破壞軟骨基質(zhì)，從而促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展[14]。在小鼠膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)定OA模型中，通過條件性敲除軟骨細(xì)胞Runx-2基因，其下游MMP-9、13和ADAMTS4、5、7、12的表達(dá)降低，從而延緩OA關(guān)節(jié)軟骨退變。另外，Runx-2對成骨細(xì)胞分化起到關(guān)鍵作用[15]，因此在OA進(jìn)程中，Runx-2的變化同樣會影響軟骨下骨的改變。由于關(guān)節(jié)軟骨與軟骨下骨之間可能存在密切的關(guān)系和相互作用，因此，將小鼠軟骨中的Runx2敲除，這種小鼠不但軟骨降解受到抑制，軟骨下骨硬化亦得到好轉(zhuǎn)[16]。

HDAC4是Runx-2的上游分子，它可以與Runx-2啟動子結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄，使其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)下調(diào)，從而起到抑制軟骨細(xì)胞發(fā)生肥大表型改變的作用[8]。提高細(xì)胞中HDAC4的表達(dá)水平，可起到與Runx-2敲除相同的抑制軟骨細(xì)胞肥大化及后續(xù)的軟骨內(nèi)成骨的效果[17]。HDAC4敲基因鼠由于喪失了其抑制Runx-2的作用，促進(jìn)了軟骨細(xì)胞肥大樣改變的進(jìn)程，從而導(dǎo)致小鼠骨骼提前發(fā)生礦化[5]。另外，HDAC4作為去乙?；?，具有去乙酰化的酶活性，由于其特殊的核內(nèi)外定位序列，其具有核質(zhì)穿梭的能力，可通過其核質(zhì)穿梭機(jī)制，使Runx-2發(fā)生去乙?；瑥亩铀倨浣到鈁18]。

本研究通過體外細(xì)胞OA模型及大鼠前交叉韌帶切斷體內(nèi)OA模型，并在造模的不同時間點選取大鼠處死，通過番紅染色、免疫組化及PCR等實驗方法研究了HDAC4及其下游Runx-2在OA發(fā)生發(fā)展過程中的變化趨勢以及其對軟骨退變的影響。從而有助于對這兩種軟骨細(xì)胞肥大相關(guān)關(guān)鍵分子在OA中的作用進(jìn)行深入的了解。本實驗中，體外OA模型條件下，HDAC4的表達(dá)降低，而Runx-2的表達(dá)升高。大鼠前叉切斷OA模型結(jié)果表明，隨著術(shù)后時間不斷增加，即骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變程度的不斷加重，HDAC4的表達(dá)量持續(xù)下降，而Runx-2的表達(dá)持續(xù)增高。這說明HDAC4的降低和Runx-2的表達(dá)升高參與了OA的病理進(jìn)程，這種變化可能是由于在OA發(fā)生發(fā)展過程中，HDAC4的表達(dá)量不斷降低，其對Runx-2的抑制作用持續(xù)減弱，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞發(fā)生肥大樣改變。本研究通過番紅固綠染色評價了OA發(fā)生和進(jìn)展過程中蛋白聚糖丟失和軟骨破壞情況。結(jié)果顯示，隨著術(shù)后時間的增加，番紅著色逐漸變淺，且從軟骨表面染色淺逐漸過渡到軟骨中深層染色淺，從軟骨表面粗糙、纖維化進(jìn)展到軟骨裂隙出現(xiàn)，軟骨面皸裂，破壞。這表明隨著軟骨細(xì)胞發(fā)生肥大樣改變，軟骨正常的代謝平衡遭到破壞，從而導(dǎo)致OA的不斷進(jìn)展。OARSI是一種半定量評分，定義為OA分級與OA分期相結(jié)合的評估，OARSI分?jǐn)?shù)為0～24分，評分越高，代表軟骨損傷越嚴(yán)重[9]。在番紅固綠染色的基礎(chǔ)上，本研究對OA進(jìn)展過程中軟骨損傷的程度進(jìn)行了評分，研究表明，隨著時間推移，OARSI評分逐漸升高，OA關(guān)節(jié)軟骨退變在不斷進(jìn)展。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，在OA發(fā)生和進(jìn)展過程中，HDAC4含量的不斷降低，而其下游Runx-2的表達(dá)逐漸增加，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞發(fā)生肥大樣改變，軟骨正常的代謝穩(wěn)定遭到破壞，導(dǎo)致OA關(guān)節(jié)軟骨退變。本研究的不足之處在于：前交叉韌帶切斷模型是一種關(guān)節(jié)不穩(wěn)定模型，并不能完全模擬OA發(fā)生和進(jìn)展的病理過程，后續(xù)將探索更好的動物模型來模擬OA的病理進(jìn)程，更好地闡明OA的發(fā)病機(jī)制。另外，后續(xù)將進(jìn)行更詳細(xì)的細(xì)胞實驗來驗證在OA病理進(jìn)程中，HDAC4對Runx-2的調(diào)控作用，為OA的防治提供理論依據(jù)。