吳燾 張國(guó)秋 李超 張?zhí)m濤

青海大學(xué)附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，青海 西寧 810012

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性關(guān)節(jié)炎性疾病，病理特征以關(guān)節(jié)組織炎癥損傷、軟骨組織破損、滑膜增生等為主，患者關(guān)節(jié)畸形、疼痛、功能受損，導(dǎo)致其行動(dòng)不便，工作能力喪失，生活質(zhì)量嚴(yán)重下降[1-2]。RA患者免疫系統(tǒng)功能紊亂，體內(nèi)氧化應(yīng)激水平增高，抑制炎癥，可減輕足腫脹、水腫等關(guān)節(jié)炎癥狀，是防治RA的有效手段[3]。miR-155可抑制TLR4/NF-κB信號(hào)激活，抑制炎癥，明顯改善大鼠臨床癥狀[4]。PI3K/Akt信號(hào)可參與介導(dǎo)RA的發(fā)生發(fā)展過程，阻斷其傳導(dǎo)，可減少促炎因子產(chǎn)生，阻止炎癥反應(yīng)，抑制滑膜增生，改善RA大鼠關(guān)節(jié)炎癥狀[5]，PIK3R1是PI3K/Akt/mTOR信號(hào)的負(fù)調(diào)節(jié)因子，脂多糖可下調(diào)其表達(dá)，促使炎癥進(jìn)展[6-7]，miR-155可靶向下調(diào)PIK3R1的表達(dá)，進(jìn)而激活PI3K/Akt信號(hào)，促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡[8]，但miR-155靶向調(diào)節(jié)PIK3R1對(duì)RA大鼠PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路及關(guān)節(jié)炎癥的影響目前還不清楚，本文通過構(gòu)建RA大鼠模型，對(duì)此進(jìn)行探究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)SD雄性大鼠，成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(川)2020-030，動(dòng)物飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》要求。

1.1.2主要試劑與儀器：牛Ⅱ型膠原(貨號(hào)1220-02)由艾美捷科技有限公司提供；不完全弗氏佐劑(貨號(hào)7002)由北京博蕾德生物科技有限公司提供；人胚腎細(xì)胞株293 T(CL-0005)、DMEM培養(yǎng)基(PM150210)分別由武漢普諾賽生命科技有限公司和北京索萊寶科技有限公司提供；胎牛血清(30044333)、Opti-MEM培養(yǎng)基(31985062)由美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司提供；LipofectamineTM2000(11668019)由美國(guó)invitrogen公司提供；miR-155 agomir、miR-155 antagomir、miR-155陰性對(duì)照、PIK3R1 3′-UTR無義序列、野生型PIK3R1 3′-UTR報(bào)告質(zhì)粒、突變型PIK3R1 3′-UTR報(bào)告質(zhì)粒，由吉?jiǎng)P基因公司提供；miR-155、U6、GAPDH、PIK3R1引物由上海生工生物工程股份有限公司提供；高效RIPA裂解液(貨號(hào)R0010)、總RNA提取試劑盒(貨號(hào)R1200)、HE染色試劑盒(貨號(hào)G1120)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)T2240)、大鼠IL-6 ELISA試劑盒(貨號(hào)SEKR-0005)、大鼠IL-17 ELISA試劑盒(貨號(hào)SEKR-0007)、大鼠IL-18 ELISA試劑盒(貨號(hào)SEKR-0054)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(貨號(hào)PC0020)、SYBR Green Realtime PCR Master Mix(貨號(hào)QPK-201)、胰蛋白酶-EDTA消化液(T1300)、青鏈霉素混合液(P1400)、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)D0010)由北京索萊寶科技有限公司提供；兔源Anti-PI3K一抗(貨號(hào)ab151549)、兔源Anti-GAPDH(貨號(hào)ab181602)一抗、兔源Anti-p-PI3K一抗(貨號(hào)ab138364)、兔源Anti-AKT一抗(貨號(hào)ab179463)、兔源Anti-p-AKT一抗(貨號(hào)ab38449)、兔源Anti-p-mTOR一抗(貨號(hào)ab84400)、兔源Anti-mTOR一抗(貨號(hào)ab2732)、羊抗兔二抗(貨號(hào)ab150077)由Abcam公司提供等。

YLS-7B足趾容積測(cè)量?jī)x由上海鑫閔生命科技有限公司提供(中國(guó))；CX23光學(xué)顯微鏡由Olympus公司提供(日本)；XElx800型酶標(biāo)儀由Perkin Elmer公司提供(美國(guó))；ABI 7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)由應(yīng)用生物系統(tǒng)公司提供(美國(guó))；RM2035輪轉(zhuǎn)切片機(jī)由萊卡公司提供(德國(guó))；Mini PROTEAN蛋白電泳儀與轉(zhuǎn)膜儀由伯樂公司提供(美國(guó))；GIS-500型凝膠成像儀由杭州米歐儀器有限公司提供(中國(guó))等。

1.2 方法

1.2.1建立RA大鼠模型及分組處理：參照文獻(xiàn)[9]誘導(dǎo)建立RA模型大鼠：將牛Ⅱ型膠原蛋白與不完全弗氏佐劑等體積混合，勻漿攪拌(30 000 r/min，2.5 min)，制成乳劑，于大鼠尾部皮下注射200 μL，1周后再次注射200 μL，3 d后即完成造模，造模成功率87.3%，死亡7只，將其隨機(jī)分為模型組、miR-155 agomir組、miR-155 antagomir組、miR-155陰性對(duì)照組，每組均12只，另取12只大鼠以同樣方法注射等劑量0.9% NaCL溶液，作為對(duì)照組。

參照文獻(xiàn)[10]及說明書，將miR-155 agomir、miR-155 antagomir、miR-155陰性對(duì)照溶于0.9% NaCL溶液，以100 μg/g的劑量分組尾靜脈注射，模型組、對(duì)照組大鼠尾靜脈注射等劑量0.9% NaCL溶液，隔日注射一次，共注射3次。

1.2.2大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分及后足趾容積測(cè)定：給藥干預(yù)結(jié)束后24 h，觀察大鼠雙側(cè)后足關(guān)節(jié)癥狀進(jìn)行評(píng)分，標(biāo)準(zhǔn)如下[11]：關(guān)節(jié)無腫脹，形態(tài)正常，0分；關(guān)節(jié)輕微腫脹，1分；關(guān)節(jié)中度腫脹，2分；關(guān)節(jié)嚴(yán)重腫脹，3分；關(guān)節(jié)嚴(yán)重腫脹并出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)障礙，4分。然后以足趾容積測(cè)量?jī)x測(cè)量大鼠后足趾容積，每只大鼠測(cè)量3次，取平均值。

1.2.3大鼠關(guān)節(jié)組織病理形態(tài)檢測(cè)及標(biāo)本采集：以乙醚氣體麻醉大鼠，然后頸椎脫臼處死，解剖取出雙側(cè)后足關(guān)節(jié)，每只大鼠剪下兩塊關(guān)節(jié)組織，均約0.8 g，分組標(biāo)記后保存在液氮中。剩余關(guān)節(jié)組織漂洗、脫水、透明、包埋后切片，然后選出厚薄均勻且無破損的關(guān)節(jié)組織切片，脫蠟、水化、HE染色(步驟參照試劑盒說明書)、漂洗、脫水、透明、封片，使用顯微鏡觀察大鼠關(guān)節(jié)組織病理形態(tài)，并選出任意5個(gè)視野進(jìn)行拍照。

1.2.4大鼠關(guān)節(jié)組織炎性因子IL-6、IL-17及IL-18水平檢測(cè)：取出1.2.3中保存在液氮中的關(guān)節(jié)組織0.8 g，研碎后，加入高效RIPA裂解液，冰水浴中勻漿，4 ℃離心后取出上清，通過BCA法測(cè)出各組蛋白總濃度后檢測(cè)IL-6、IL-17及IL-18水平(步驟參照各自試劑盒說明書)，剩余關(guān)節(jié)組織蛋白樣品液保存在-80 ℃，進(jìn)行蛋白表達(dá)檢測(cè)。

1.2.5大鼠關(guān)節(jié)組織PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平測(cè)定：取1.2.4中剩余的各組關(guān)節(jié)組織蛋白樣品液，加入適量上樣緩沖液后煮沸，5 min后蛋白變性后向SDS-PAGE濃縮膠上樣孔中加入含20 μg總蛋白的樣品液，電泳(110 V，85 min)將蛋白在分離膠中充分分離，濕轉(zhuǎn)(40 mA，75 min)將分離膠中蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，蛋白非特異位點(diǎn)經(jīng)5%的脫脂奶粉封閉(37.5 ℃，2 h)后，根據(jù)分子量截下目的蛋白，經(jīng)兔源Anti-PI3K一抗、Anti-GAPDH一抗、Anti-p-PI3K一抗、Anti-AKT一抗、Anti-p-AKT一抗、Anti-p-mTOR一抗、Anti-mTOR一抗孵育12 h(4 ℃)，洗膜3次(TBST，37.5 ℃，5 min/次)，羊抗兔二抗孵育1.5 h(37.5 ℃)，洗膜3次(TBST，37.5 ℃，5 min/次)，化學(xué)發(fā)光法顯色，采集蛋白條帶圖像，運(yùn)用Image J軟件對(duì)其灰度值定量，然后統(tǒng)計(jì)做分析后得出各組蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6大鼠關(guān)節(jié)組織miR-155及PIK3R1 mRNA水平檢測(cè)：將1.2.3中保存在液氮中的關(guān)節(jié)組織0.8 g研碎后，提取總RNA后通過逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)制得cDNA(步驟參照各自試劑盒說明書)，取反應(yīng)排管，向其中依次加入6 μL DEPC水，10 μL SYBR Green Realtime PCR Master Mix，0.4 μL ROX染料，上、下游引物各0.8 μL，混勻后上機(jī)做PCR擴(kuò)增，參照試劑說明指導(dǎo)設(shè)定反應(yīng)參數(shù)，所得Ct值采用2-ΔΔCt法計(jì)算，以U6做miR-155內(nèi)參，以GAPDH做PIK3R1內(nèi)參，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequences

1.2.7雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miR-155對(duì)PIK3R1的靶向調(diào)控：將購買的293 T細(xì)胞快速解凍后，以5 mL細(xì)胞培養(yǎng)液(DMEM培養(yǎng)基+1%青鏈霉素混合液+10%胎牛血清)重懸混勻，接種在培養(yǎng)瓶中，無菌培養(yǎng)至細(xì)胞基本鋪滿瓶底，傳代后接種在24孔板，無菌培養(yǎng)12 h后隨機(jī)分為轉(zhuǎn)染PIK3R1 3′-UTR無義序列+miR-155 mimics陰性對(duì)照組、轉(zhuǎn)染PIK3R1 3′-UTR無義序列+miR-155 mimics組、轉(zhuǎn)染野生型PIK3R1 3′-UTR報(bào)告質(zhì)粒+miR-155 mimics陰性對(duì)照組、轉(zhuǎn)染野生型PIK3R1 3′-UTR報(bào)告質(zhì)粒+miR-155 mimics組、轉(zhuǎn)染突變型PIK3R1 3′-UTR報(bào)告質(zhì)粒+miR-155 mimics陰性對(duì)照組、轉(zhuǎn)染突變型PIK3R1 3′-UTR報(bào)告質(zhì)粒+miR-155 mimics組，將細(xì)胞培養(yǎng)液更換為Opti-MEM培養(yǎng)基，使用LipofectamineTM2000參照其說明書指導(dǎo)做分組轉(zhuǎn)染6 h，然后棄去Opti-MEM培養(yǎng)基，以細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)無菌培養(yǎng)24 h，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒，并參照其說明指導(dǎo)對(duì)各組雙熒光素酶相對(duì)活性進(jìn)行測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-155對(duì)大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)及后足趾容積的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)及后足趾容積明顯升高(P<0.05)。與模型組、miR-155陰性對(duì)照組分別比較，miR-155 antagomir組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)及后足趾容積降低(P<0.05)；miR-155 agomir組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)及后足趾容積升高(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)及后足趾容積Fig.1 Arthritis index and hind toe volume of rats in each group注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05；與miR-155陰性對(duì)照組相比，cP<0.05。

2.2 miR-155對(duì)大鼠關(guān)節(jié)組織病理形態(tài)的影響

對(duì)照組大鼠關(guān)節(jié)形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，組織無損傷。模型組大鼠關(guān)節(jié)表面不平整，滑膜層增厚，軟骨侵蝕破壞，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，關(guān)節(jié)組織呈現(xiàn)較嚴(yán)重病理損傷。與模型組、miR-155陰性對(duì)照組分別比較，miR-155 antagomir組大鼠關(guān)節(jié)組織病理損傷減輕；miR-155 agomir組大鼠關(guān)節(jié)組織病理損傷加重。見圖2。

圖2 HE染色觀察各組大鼠關(guān)節(jié)組織病理形態(tài)(×200)Fig.2 HE staining was used to observe the pathological morphology of joints in each group(×200)

2.3 miR-155對(duì)大鼠關(guān)節(jié)組織炎性因子IL-6、IL-17、IL-18水平的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)組織炎性因子IL-6、IL-17、IL-18水平明顯升高(P<0.05)。與模型組、miR-155陰性對(duì)照組分別比較，miR-155 antagomir組大鼠關(guān)節(jié)組織炎性因子IL-6、IL-17、IL-18水平降低(P<0.05)；miR-155 agomir組大鼠關(guān)節(jié)組織炎性因子IL-6、IL-17、IL-18水平升高(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組大鼠關(guān)節(jié)組織炎性因子IL-6、IL-17、IL-18水平Fig.3 Levels of inflammatory factors IL-6, IL-17, and IL-18 in joint tissue of rats in each group注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05；與miR-155陰性對(duì)照組相比，cP<0.05。

2.4 miR-155對(duì)大鼠關(guān)節(jié)組織PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)組織PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路蛋白p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR水平均明顯升高(P<0.05)。與模型組、miR-155陰性對(duì)照組分別比較，miR-155 antagomir組大鼠關(guān)節(jié)組織PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路蛋白p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR均降低(P<0.05)；miR-155 agomir組大鼠關(guān)節(jié)組織PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路蛋白p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR水平均升高(P<0.05)。見圖4、5。

圖4 免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠關(guān)節(jié)組織PI3K/Akt/mTOR通路蛋白表達(dá)Fig.4 The expression of PI3K/Akt/mTOR pathway proteins in the joint tissue of rats was detected with Western blotting注：A：對(duì)照組；B：模型組；C：miR-155 antagomir組；D：miR-155 agomir組；E：miR-155陰性對(duì)照組。

圖5 各組大鼠關(guān)節(jié)組織PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路蛋白相對(duì)表達(dá)水平Fig.5 Relative expression level of PI3K/Akt/mTOR signal pathway proteins in the joint tissue of rats in each group注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05；與miR-155陰性對(duì)照組相比，cP<0.05。

2.5 miR-155對(duì)大鼠關(guān)節(jié)組織miR-155及PIK3R1 mRNA水平的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)組織miR-155水平明顯升高(P<0.05)，PIK3R1 mRNA水平明顯降低(P<0.05)。與模型組、miR-155陰性對(duì)照組分別比較，miR-155 antagomir組大鼠關(guān)節(jié)組織miR-155水平降低(P<0.05)，PIK3R1 mRNA水平升高(P<0.05)；miR-155 agomir組大鼠關(guān)節(jié)組織miR-155水平升高(P<0.05)，PIK3R1 mRNA水平降低(P<0.05)。見圖6。

圖6 各組大鼠關(guān)節(jié)組織miR-155及PIK3R1 mRNA水平Fig.6 MiR-155 and PIK3R1 mRNA levels in the joint tissues of rats in each group注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05；與miR-155陰性對(duì)照組相比，cP<0.05。

2.6 miR-155對(duì)PIK3R1的靶向調(diào)節(jié)

經(jīng)miRcode數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)miR-155和PIK3R1之間有結(jié)合位點(diǎn)，推測(cè)PIK3R1可能是miR-155的靶基因。與轉(zhuǎn)染PIK3R1 3′-UTR無義序列+miR-155 mimics陰性對(duì)照組(0.99±0.15)比較，轉(zhuǎn)染PIK3R1 3′-UTR無義序列+miR-155 mimics組(1.02±0.13)相對(duì)熒光素酶活性無明顯差異(P>0.05)。與轉(zhuǎn)染野生型PIK3R1 3′-UTR報(bào)告質(zhì)粒+miR-155 mimics陰性對(duì)照組(1.00±0.18)比較，轉(zhuǎn)染野生型PIK3R1 3′-UTR報(bào)告質(zhì)粒+miR-155 mimics組(0.31±0.09)相對(duì)熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；與轉(zhuǎn)染突變型PIK3R1 3′-UTR報(bào)告質(zhì)粒+miR-155 mimics陰性對(duì)照組(0.99±0.16)比較，轉(zhuǎn)染突變型PIK3R1 3′-UTR報(bào)告質(zhì)粒+miR-155 mimics組(1.01±0.25)相對(duì)熒光素酶活性無明顯差異(P>0.05)。見圖7。

圖7 miRcode數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)miR-155和PIK3R1之間的結(jié)合位點(diǎn)Fig.7 miRcode database predicts the binding site between miR-155 and PIK3R1

3 討論

依據(jù)文獻(xiàn)方法[9]誘導(dǎo)RA模型，引發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)腫脹發(fā)炎，模型建立成功。研究發(fā)現(xiàn)，RA患者體內(nèi)長(zhǎng)期存在炎癥，抑制致炎細(xì)胞因子表達(dá)及釋放，減輕炎癥是RA治療的關(guān)鍵[12]。miR-155是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要因子，脂多糖可促使其表達(dá)，引發(fā)炎癥并促進(jìn)其進(jìn)展；下調(diào)miR-155表達(dá)，可抑制脂多糖誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥，降低其凋亡率，改善骨關(guān)節(jié)炎癥狀[13]，本文顯示miR-155 antagomir可降低關(guān)節(jié)組織miR-155水平，減輕關(guān)節(jié)組織病理損傷，降低關(guān)節(jié)炎指數(shù)、后足趾容積、關(guān)節(jié)組織炎性因子IL-6、IL-17及IL-18水平，miR-155 agomir起到相反的作用，表明miR-155參與介導(dǎo)RA的發(fā)病與病情進(jìn)展過程；下調(diào)其表達(dá)，可減少促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生，抑制關(guān)節(jié)炎癥，減輕關(guān)節(jié)組織損傷，改善關(guān)節(jié)腫脹等癥狀。

PI3K/Akt/mTOR可介導(dǎo)關(guān)節(jié)炎疾病，阻斷PI3K/Akt信號(hào)途徑，可改善膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨損傷，減輕大鼠關(guān)節(jié)炎癥[14]，PIK3R1可負(fù)調(diào)控PI3K/Akt的激活，抑制PI3KR1表達(dá)，增強(qiáng)PI3K、Akt的磷酸化[15]，miR-155可增強(qiáng)PI3K/Akt信號(hào)，并靶向下調(diào)PIK3R1表達(dá)，在白細(xì)胞介素-1β誘導(dǎo)的原代軟骨細(xì)胞中，miR-155可通過靶向下調(diào)PIK3R1激活PI3K/Akt通路，引發(fā)軟骨細(xì)胞凋亡和分解[16]，本文顯示RA大鼠關(guān)節(jié)組織PIK3R1 mRNA水平明顯降低，p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt及p-mTOR/mTOR水平明顯升高，以拮抗劑antagomir下調(diào)miR-155表達(dá)，可升高PIK3R1 mRNA水平，抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)激活，miR-155 agomir作用相反。此外，還顯示miR-155能靶向下調(diào)PIK3R1的表達(dá)，表明miR-155可靶向下調(diào)PIK3R1的表達(dá)，激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)，促進(jìn)RA病情進(jìn)展，下調(diào)其表達(dá)，可增強(qiáng)PIK3R1的表達(dá)，阻斷PI3K/Akt/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)，抑制炎癥，減輕關(guān)節(jié)組織損傷，改善RA大鼠關(guān)節(jié)炎癥狀。

綜上所述，miR-155在RA大鼠中高表達(dá)，下調(diào)其表達(dá)，可上調(diào)PIK3R1表達(dá)，抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)激活，阻止炎癥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展，減輕關(guān)節(jié)組織損傷，改善RA大鼠關(guān)節(jié)腫脹等癥狀，證實(shí)靶向PIK3R1調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號(hào)表達(dá)是調(diào)節(jié)RA大鼠病情的作用機(jī)制之一，是否有其他通路間接參與調(diào)控RA大鼠病情，還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)加以說明。