秦佳月 朱志鵬 周紅梅 路 建 吳 城

研究表明，臨床的各種心肌缺血再灌注損傷往往伴隨著心肌細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及凋亡的病理過程[1-3]。七氟醚適應性干預對重要的臟器缺血再灌注損傷具有一定保護作用，但是同時也帶來了心臟之外的副作用[4-5]。例如可以誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激引起幼腦發(fā)育障礙、細胞凋亡和學習記憶功能下降[6-7]。為了明確七氟醚是否是通過干預心肌細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激而調(diào)控MIRI，本研究對缺血再灌注模型大鼠采用七氟醚后處理，研究心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應程度，探索可能的分子機制。

1 實驗材料

1.1 動物 55 只SPF 級雌性SD 大鼠（10 周齡），體質(zhì)量（250±17）g，購買于浙江省醫(yī)學科學院，自由飲食，常規(guī)飼養(yǎng)于浙江大學醫(yī)學院附屬邵逸夫醫(yī)院實驗動物中心。實驗動物使用許可證：SYXK（浙）2017-0006，實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK（浙）2019-0002，實驗動物合格證：20220209Aazz0100018463。

1.2 細胞 H9C2 大鼠胚胎心肌細胞株購于武漢普諾賽生命科技有限公司（procell，批號KG444），傳代小于2 代。

1.3 試劑與儀器 七氟醚購于上海恒瑞醫(yī)藥有限公司（批號16030731）。DMEM 培養(yǎng)基（gibco 公司，批號C11995500BT），胎牛血清（FBS，四季青公司，批號11011），青霉素/鏈霉素（P/S，gibco 公司，批號15140-12），胰蛋白酶（浦泰生物，批號9002-07-7），二甲基亞砜（DMSO，Gibco 公司，批號D12345），Trizol（美國Invitrogen 公司，批號15596026），乳酸脫氫酶（LDH）（南京建成生物工程研究所，批號A020-1），anti-GRP78 抗體（Abcam 公司，批號ab21685）、anti-CHOP 抗體（Abcam 公司,批號ab11419）；β-actin 單克隆抗體（華安生物，批號33036M），RNA 引物（擎科生物科技公司），逆轉(zhuǎn)錄和qPCR 試劑盒（南京諾唯贊公司，批號R223-01，Q311-02）。所用儀器主要有：CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司，HERACELL 240iC02），離心機（SorvMl STl6），酶標儀（Muhiskan GO），倒置熒光顯微鏡（德國Carl Zeiss 公司；Axio Vert.A1）；MIC-101 細胞缺氧裝置（美國Billups-Rothenberg 公司，MIC-101），核酸蛋白定量檢測儀（Eppendorf，Gemany），Western 電泳、轉(zhuǎn)膜、發(fā)光和分析系統(tǒng)（北京六一儀器廠）。

2 實驗方法

2.1 動物實驗方案 模型組取大鼠25 只，隨機數(shù)字表法分為對照組（sham）和2、4、6、8 h 缺血再灌注組（I/R），每組各5 只。麻醉后對照組大鼠行心臟左冠狀動脈前降支放線，但是不結(jié)扎。I/R 組大鼠分別于結(jié)扎血管缺血30 min 之后進行再灌注2、4、6 和8 h，制造在體心臟左冠狀動脈前降支結(jié)扎缺血再灌注動物模型，獲取心肌損傷和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應最理想模型參數(shù)；實驗組取大鼠30 只，隨機數(shù)字表法分為sham組、I/R 組、七氟醚后處理組（sevoP，分為2.5%、3.0%亞組）、4-苯基丁酸（4-PBA）復合七氟醚組（4-PBA+2.5%、3.0% sevoP 組），每組各5 只。sevoP 組大鼠于缺血完成后通過七氟醚揮發(fā)罐吸入七氟醚和氧氣的混合氣體，通過特異密封性的口罩置于大鼠口鼻，吸入相應濃度和時間后單純氧氣洗脫七氟醚5 min，松開結(jié)扎線至規(guī)定時間。4-PBA 干預組的大鼠在實驗前進行4-PBA 腹腔注射（300 mg/kg，造模前1 h 給予），后進入實驗程序。再灌注時間結(jié)束即刻處死大鼠，取頸動脈血，取心尖和心臟組織，檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白的蛋白、mRNA 表達（GRP78、CHOP）。

2.2 細胞模型及實驗方案 H9C2 細胞放入DMEM培養(yǎng)基（含10%FBS 和1%P/S）于37 ℃、5%CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，過夜，當細胞鋪滿整個培養(yǎng)皿底面積達到80%以上時，用0.25%胰蛋白酶消化，并按1∶3 進行傳代或進行后續(xù)實驗，傳代不高于10 代。采用課題組前期的缺氧/復氧模型[8]，將H9C2 細胞培養(yǎng)至密度為70%左右，按細胞密度為4×105/mL 接種于6 孔板，每組3 個復孔，不含血清培養(yǎng)，放入含5%CO2，和95%N2密閉缺氧罐中缺氧3 h；之后由七氟醚揮發(fā)罐導入相應濃度的七氟醚30 min，最后換含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，常氧條件下培養(yǎng)3 h，對照組常氧條件下培養(yǎng)。siSERCA 引物設計由擎科生物公司設計，合成3 對引物（預實驗中最有效的一對為：F，CCUCCUAGAAGGCCGAUACUU；R，AAGUAUCGGCCUUCUAGGAGG）和1 對ncSERCA 陰性對照，心肌細胞造模前48 h 進行siSERCA 基因敲低實驗，敲低效率大于80%以上的細胞進入后續(xù)H/R 實驗。

2.3 組織樣本石蠟切片HE 染色 心臟組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋。制作4 μm 厚的HE 石蠟切片，切片用蘇木精和伊紅（HE）染色，并進行倒置光學顯微鏡檢查。另取樣本脫水后用環(huán)氧樹脂浸泡包埋，制作超薄切片，雙重染色后置于H-600 透射電鏡下觀察。

2.4 LDH 和cTnI 濃度檢測 每組5 只大鼠于不同再灌注結(jié)束時間點，CO2氣體處死后取頸動脈血2 mL，3000 轉(zhuǎn)離心10 min 后取上層血清。H9C2 細胞收集上清，12000 轉(zhuǎn)離心5 min 備用。樣本采用大鼠cTnI 和LDH 酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）檢測試劑盒（RD 公司，美國），酶標儀上機測量450 nm 波長下的吸光度值進行分析。

2.5 RT-PCR 分析檢測mRNA 表達 引物由擎科生物公司設計并合成，如下：GRP78 引物：正義鏈5'-AACCCAGATGAAACTGTAGCA-3'，反義鏈5'-ACATCAAGCAGAACCAGGTCAC-3'；CHOP 引物：正義鏈5'-AGCTGAGTCTCTGCCTTTCG-3'，反義鏈5'-TGTGGTCTCTACCTCCCTGG-3'；GAPDH 引物：正義鏈5'-GAGAAGGCTGGGGCTCATTT-3'，反義鏈5'-CCAATATGATTCCACCCATG-3'。組織和細胞樣本經(jīng)各種處理后，按照RNA 提取試劑盒的步驟說明，以Trizol 法裂解細胞，之后轉(zhuǎn)移至EP 管中離心，加入氯仿，放置、離心，分層后上層轉(zhuǎn)移至有異丙醇的EP 管中，提取各組細胞總RNA，取沉淀溶于水中，分光光度計測定濃度，測定各組OD260/280,測定純度，-80℃超低溫冰箱儲存。符合純度的用反轉(zhuǎn)錄劑盒將1 μg RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA 各組分別取1 μL 在PCR 儀上進行擴增,設置一定的PCR反應條件變性、退火、延伸，觀察溶解曲線。通過目的基因CT 值/內(nèi)參GAPDH，計算出目的基因的相對表達。每組3 復孔，重復3 次。

2.6 Western blot 蛋白檢測 組織和細胞經(jīng)相應處理后，加入適量體積的蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑，冰上裂解15 min，離心后取上清，直接用于SDS buffer 蛋白電泳上樣或凍存于-80 ℃?zhèn)溆?。利用BCA試劑盒檢測各組蛋白濃度，用酶標儀測定吸光值，根據(jù)標準曲線計算出蛋白濃度。根據(jù)分離膠的不同濃度參考目的蛋白分子量的大小，進行SDS-PAGE電泳。封膠、蛋白上樣、調(diào)節(jié)電壓開始電泳。接著備膜、切膠、裝膜、轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶封閉液中封閉，結(jié)合特異性一抗過夜、二抗孵育后，搖床上洗滌，進行ECL 化學發(fā)光曝光，拍照。以β-actin 為內(nèi)參，各蛋白產(chǎn)物的相對表達量=蛋白產(chǎn)物電泳條帶光密度值/βactin 產(chǎn)物電泳條帶凈光密度值。通過ImageProPlus軟件對發(fā)光條帶進行定量分析，記錄各組數(shù)據(jù)后進行統(tǒng)計學分析。

2.7 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism 9.0 軟件進行統(tǒng)計分析和作圖，計量資料以D'Agostino and Pearson omnibus 法作變量正態(tài)性分析，采用均數(shù)±標準差（）表示，組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey 法；非正態(tài)分布變量采用K-W 非參數(shù)檢驗。計數(shù)資料采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激模型建立 sham 組大鼠缺血0.5 h后，外周血平均cTnI 濃度為（2.72±0.61）ng/mL，LDH濃度為（3.44±0.54）U/L，GRP78 相對表達量為（0.38±0.18），所有大鼠均存活。與sham 手術(shù)組比較，I/R 組的大鼠心肌損傷程度于缺血0.5 h 再灌注2 h 后明顯增加，表現(xiàn)為血清LDH、cTnI 濃度的急劇升高（P＜0.05）；而不同模型中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激分子伴侶GRP78 的表達顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應直到缺血0.5 h 再灌注6 h后才表現(xiàn)明顯，與sham 組比較，0.5/6 h 組和0.5/8 h模型組心肌組織GRP78 表達的顯著增高（P＜0.05）。其中，0.5/6 h 模型組和0.5/8 h 模型組分別死亡大鼠1 只和2 只，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），后續(xù)將以0.5/6 h 為實驗條件，見表1。

表1 不同條件下大鼠心肌缺血再灌注損傷程度和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激變化

3.2 各組大鼠心肌病理形態(tài)改變 0.5/6 h 實驗條件下大鼠心肌及心尖組織的HE 染色和電鏡下形態(tài)改變顯示（見圖1）：與sham 組（圖1a）相比，I/R 組（圖1b）大鼠的心肌組織規(guī)則紊亂，斷裂，水腫，心肌細胞壞死增多；電鏡下sham 組（圖1c）心肌細胞結(jié)構(gòu)大致正常，I/R 組電鏡下（圖1d）的心肌纖維排列紊亂,細胞腫脹,細胞間邊界模糊，心肌細胞呈現(xiàn)狀壞死改變。

圖1 sham 組和I/R 組大鼠心肌組織HE 染色情況和電鏡下形態(tài)學改變

3.3 體內(nèi)實驗各組大鼠心肌組織GRP78、CHOP 基因和蛋白表達水平 與sham 組比較，I/R 組大鼠經(jīng)歷0.5/6 h I/R 后心肌組織的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激分子伴侶GRP78、CHOP 的基因和蛋白顯著高表達（P＜0.05）；與I/R 組比較，sevoP2.5、sevoP3.0 七氟醚后處理干預組大鼠心肌的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激被有效抑制，表現(xiàn)在明顯降低0.5/6 h 實驗條件下產(chǎn)生的GRP78、CHOP 的mRNA 和蛋白高表達，其中2.5%與3.0%組間差異不明顯（P＞0.05）；與sevoP2.5、sevoP3.0 比較，通過4-PBA 對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應的抑制，4-PBA+sevoP2.5、4-PBA+sevoP3.0 組的GRP78、CHOP 表達被逆轉(zhuǎn)，七氟醚的保護作用被削弱，表現(xiàn)為與sevoP2.5 或sevoP3.0組比較，4-PBA 干預組mRNA 表達顯著增高，見表2、圖2。

圖2 七氟醚后處理對缺血再灌注大鼠心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的影響

表2 七氟醚后處理對大鼠心肌GRP78 和CHOP mRNA表達的影響（）

表2 七氟醚后處理對大鼠心肌GRP78 和CHOP mRNA表達的影響（）

注：sham 組大鼠麻醉后行心臟左冠狀動脈前降支放線，但是不結(jié)扎；I/R 組大鼠于結(jié)扎血管缺血30 min 之后進行再灌注6 h，2.5%、3%sevoP 組動物在行微創(chuàng)左冠狀動脈前降支結(jié)扎后即刻，吸入相應濃度的七氟醚15 min 后洗脫，4-PBA 干預組的大鼠在實驗前進行4-PBA腹腔注射（300 mg/kg，造模前1 h 給予）；GRP78 為葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78；CHOP 為C/EBP 同源蛋白；與sham 比較，aP＜0.05；與H/R 組比較，bP＜0.05；與sevoP2.5 組比較，cP＜0.05；與sevoP3.0 組比較，dP＜0.05

3.4 體外實驗各組大鼠心肌細胞GRP78、CHOP 基因和蛋白表達水平 與Control 組比較，3/3 h 的H/R損傷可能引起顯著的細胞上清中LDH 濃度上升，以及細胞裂解成分的GRP78 和CHOP 蛋白表達顯著升高（分別升高4.1 和4 倍），以2.5%七氟醚飽和后處理措施能夠抑制過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激[（GRP78：（2.46±0.50）比（1.52±0.38）；CHOP：（2.1±0.43）比（1.32±0.23），P＜0.05]，而給予心肌細胞SERCA 基因干擾后，能夠體現(xiàn)出對H/R 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的應激逆轉(zhuǎn)，與sevoP+H/R 組和siSERCA 陰性對照組相比，siSERCA+sevoP+H/R 組的GRP78 和CHOP 表達再度升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 七氟醚后處理對細胞GRP78 和CHOP 表達的影響（）

表3 七氟醚后處理對細胞GRP78 和CHOP 表達的影響（）

注：control 組的細胞常規(guī)培養(yǎng)，H/R 組細胞缺氧/復氧均3 h，sevoP 組復氧前以2.5%七氟醚處理缺氧箱內(nèi)H9C2 細胞30 min，另兩組H9C2細胞分別以小干擾肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP 酶（siSERCA）和陰性對照（ncSERCA）處理48 h 后進行sevoP 同樣的操作；LDH 為乳酸脫氫酶；GRP78 為葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78；CHOP 為C/EBP 同源蛋白；sevoP 為七氟醚后處理；H/R 為缺氧/復氧；ncSERCA 為陰性對照；siSERCA 為小干擾敲低SERCA；與control 組比較，aP＜0.05；與H/R 比較，bP＜0.05；與sevoP+H/R 組比較，cP＜0.05

4 討論

缺血再灌注損傷是圍手術(shù)期缺血性心臟病患者高死亡率、致病率的主要原因，雖然目前關于缺血再灌注損傷的機制已基本了解，但是仍然缺乏有效的干預手段。七氟醚是臨床廣泛使用的麻醉氣體，其不同的適應性調(diào)控技術(shù)在心臟缺血再灌注損傷防控領域顯示出一定的保護作用，但是也有一定的爭議，具體機制未明。針對目前已有的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激充分參與了心肌缺血再灌注損傷的生理病理進程這一共識[1，5，9]，本研究利用大鼠在體缺血再灌注損傷所致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激模型，闡明七氟醚對I/R-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的影響，再利用前期實驗的H9C2 細胞缺氧3h/復氧3 h 模型，初步驗證了七氟醚后處理通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激而保護缺血再灌注損傷的靶點。

心肌I/R 損傷可導致多種嚴重后果，其中最主要的是心肌梗死，因此本實驗將檢測LDH、cTnI 作為評價心肌I/R 損傷程度的金標準。而GRP78 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激特異性的標志分子，CHOP 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激凋亡通路的關鍵分子，組織和細胞在缺血缺氧后，引起ERS導致GRP78 的高表達，同時啟動未折疊蛋白反應穩(wěn)定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，保持細胞穩(wěn)態(tài)，當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應失控以后，心肌細胞通過CHOP 信號通路的激活，而產(chǎn)生細胞凋亡[10]。本研究選擇這些指標能夠反映心肌缺血再灌注損傷和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的變化情況，結(jié)果顯示，H9C2 在3H/3R 條件下就會造成細胞損傷，心肌組織于缺血30 min 再灌注2 h 時刻即造成自心臟損傷，但是要產(chǎn)生顯著的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激變化，則需要在再灌注6 h 才有明顯變化，猜想再灌注的損傷時間依賴性，這也間接印證了臨床急性心梗解除的黃金6 h 原則，因為再灌注時間如超過6 h，由于自由基大量形成、細胞內(nèi)鈣超載、興奮性氨基酸的釋放等因素綜合一起，組織和細胞的壞死在所難免。本研究沒有采用大鼠langendroff 離體心臟灌注模型，旨在力求真實還原病理事件，模型結(jié)果同Huang 等[11]與Ding 等[12]的小鼠心肌缺血30min 再灌注6 h 的研究一致，此模型能夠明顯產(chǎn)生心肌的CK-MB、cTnI 高表達和細胞凋亡。

七氟醚適應性調(diào)控心臟缺血再灌注損傷已經(jīng)被廣泛研究，涉及到預處理、后處理、聯(lián)合處理等方式。其中，后處理主要調(diào)控的通路包括線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔功能失調(diào)、心肌細胞凋亡等方面。除了七氟醚后處理抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在腦保護領域的貢獻[13-14]，七氟醚后處理對心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的調(diào)控機制方面鮮有報道。Liu 等[5]報道指出七氟醚后處理對缺血再灌注損傷心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的調(diào)控是通過PERK/eIF2a/ATF4/CHOP 信號通路達到，靶點分子為Akt，不同于本研究中的靶點分子Ca2+-ATP 酶，但是結(jié)局指標均是相同的GRP78、CHOP 分子伴侶表達。

Ca2+-ATP 酶是細胞肌漿網(wǎng)中維持細胞內(nèi)外Ca2+平衡的蛋白質(zhì)，它能夠分解ATP，維持細胞發(fā)揮正常功能時所需的鈣濃度，尤其在能量供應缺乏情況下,鈣泵失活致細胞內(nèi)外濃度差紊亂，細胞內(nèi)Ca2+濃度升高，最終引起鈣超載，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應的發(fā)生[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，在心肌細胞H/R 模型的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激條件下Ca2+-ATP 酶的敲低顯著影響七氟醚的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激調(diào)控作用，初步說明了七氟醚內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激調(diào)控的機制和靶標，研究結(jié)果與劉紅超等[16]的七氟醚對糖尿病大鼠海馬中Ca2+-ATP 酶活性的影響一致。至于七氟醚調(diào)控Ca2+-ATP 酶具體的信號通路和相互作用，有待進一步研究。

綜上所述，本實驗證實了七氟醚后處理可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，從而減輕缺血再灌注心臟的損傷，其機制與心肌細胞Ca2+-ATP 酶的活性有關。