王佳明，鄭蹦蹦，馬勇勝

(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院骨二科，哈爾濱 150001)

骨對機械性振動刺激敏感，可通過調(diào)節(jié)骨骼的質(zhì)量和結構應對不斷變化的負荷。骨細胞是骨組織中主要的機械刺激感覺細胞[1]，振動刺激可通過激活分子信號通路調(diào)節(jié)骨軟骨細胞和成骨細胞的增殖、分化和基質(zhì)產(chǎn)生。骨組織在低應力條件下由間充質(zhì)細胞生成，而間充質(zhì)細胞在高應力條件下可形成纖維組織，在中等應力下，間充質(zhì)細胞分化為軟骨細胞，并啟動軟骨性愈傷組織的形成，這一過程最初填補了骨折空隙[2-3]。因此，生物力學環(huán)境在骨重建和骨再生過程中對骨細胞的影響至關重要。此外，在骨植入物整合過程中，生物力學環(huán)境也起著至關重要的作用。植入物材料的表面特性及其生物力學特性是影響成骨細胞向植入物表面募集和分化的主要因素，可防止植入物的松動。因此，開發(fā)新型的骨科植入物材料和涂層成為研究熱點。目前，骨科植入物多為不銹鋼、鈦合金，其作為人體內(nèi)異物會引起局部的炎癥反應，而鍍有二氧化鈦/鈦酸鎂(TiO2/Mg2TiO4)納米層的骨植入物能夠很好地解決植入物分層的問題[4]，鎂合金植入引起的術區(qū)炎癥反應程度低于其他植入物，且具有較高的機械強度和彈性模量，故較鈦合金和不銹鋼合金更適合作為骨折手術內(nèi)植入物[5-6]。骨具有機械敏感性，低能量高頻振動(low-magnitude high-frequency vibration，LMHFV)可促進骨質(zhì)疏松患者的骨形成、改善其骨密度[7-8]，故認為LMHFV對于改善骨愈合和骨植入物骨整合有積極影響?，F(xiàn)就LMHFV對骨組織細胞及骨愈合的作用及機制研究進展予以綜述。

1 LMHFV對骨組織細胞的作用

在骨折愈合過程中，LMHFV對不同骨組織細胞類型產(chǎn)生不同的影響。LMHFV可誘導間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)骨架重構，從而影響MSC的增殖和分化；還可通過減少成骨細胞釋放破骨細胞介質(zhì)來直接或間接抑制破骨細胞的形成和活性。LMHFV可調(diào)節(jié)巨噬細胞極化、促進血管生成、增加骨折處的骨形成，故分析LMHFV在細胞層面上的骨愈合相關信號通路和機制有重要意義。

1.1LMHFV與骨髓MSC(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC) BMSC是一種具有自我更新能力和多系分化潛能的基質(zhì)細胞[9]，存在于中軸骨或外周骨松質(zhì)骨的骨小梁中，骨髓組織中含量最多，可分化為骨、軟骨、肌腱、肌肉、脂肪等[10]。骨折發(fā)生時，BMSC在體內(nèi)多種炎癥因子、免疫調(diào)節(jié)因子等細胞因子作用下定向遷移、分化[11]，并在骨折部位完成歸巢及植入[12]。BMSC通過分泌表達多種細胞因子(如轉化生長因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白)促進骨與軟骨的形成[13]，在骨折部位的招募過程中發(fā)揮重要作用。LMHFV可在細胞水平上抑制干擾素產(chǎn)生，并可抑制自然殺傷細胞和T細胞的活化、增殖及細胞毒性作用[14]。

骨折發(fā)生時受損組織導致的局部出血和缺氧會造成炎癥反應，產(chǎn)生白細胞介素-6等炎癥因子，這些炎癥因子會刺激骨髓釋放MSC，并促進骨折部位MSC的歸巢[15]，從而促進骨愈合。LMHFV通過刺激基質(zhì)細胞衍生因子-1/CXC趨化因子受體4通路促進骨折愈合，對MSC的募集起重要作用，故血清基質(zhì)細胞衍生因子-1檢測可評估LMHFV對BMSC的募集作用程度[16]，從而調(diào)整LMHFV的能量和頻率參數(shù)，體現(xiàn)了LMHFV的可調(diào)節(jié)性。此外，LMHFV可通過抑制脂肪生成和促進成骨作用來改變BMSC的譜系定型[17]，促進BMSC增殖[18]。其中，LMHFV對BMSC的機械轉導主要通過細胞骨架重構機制來完成[19]。其具體過程為LMHFV通過上調(diào)肌動蛋白相關基因，并通過細胞核與細胞骨架的偶聯(lián)放大機械刺激反應進一步促進細胞信號轉導[20]。

1.2LMHFV與成骨細胞 骨的形成由成骨細胞介導，其中機械刺激對成骨和骨重建具有至關重要的作用。骨細胞[21]和成骨細胞[22]是機械敏感細胞，成骨細胞可受到LMHFV的影響。當振動范圍為0.25～0.5 g、振動頻率為30～60 Hz時，細胞發(fā)生增殖、礦化，細胞骨架染色結果顯示，LMHFV可增加細胞外基質(zhì)的礦化作用[23]。此外，LMHFV可加速成骨細胞的分化。LMHFV還可顯著提高血清堿性磷酸酶、骨鈣素、Runt相關轉錄因子2、骨形態(tài)發(fā)生蛋白/成骨相關轉錄因子抗體/Ⅰ型膠原蛋白和骨保護素(osteoprotegerin，OPG)信使RNA(messenger RNA，mRNA)的表達，而下調(diào)骨硬化蛋白(sclerosteosis，SOST)基因表達[24]，上述標志物對骨形成和成骨細胞分化非常重要。此外，LMHFV可明顯上調(diào)低密度脂蛋白受體相關蛋白6和β聯(lián)蛋白信號通路成員Wnt3a、低密度脂蛋白受體相關蛋白6、β聯(lián)蛋白的基因表達[25]，其對成骨細胞生成均具有積極影響。

機械性振動刺激可促進成骨相關基因表達，并降低破骨細胞的表達。外部生物力學刺激與調(diào)節(jié)MSC中肌動蛋白的細胞骨架重構有關，Haffner-Luntzer等[26]研究表明，LMHFV可增加肌動蛋白重構，振動組的微絲數(shù)量增加、應力纖維變厚，表明振動誘導的成骨細胞效應可能取決于細胞骨架的重排。此外，骨組織中的機械轉導主要取決于雌激素及雌激素受體(estrogen receptor，ER)[27]，特別是LMFHV中ERα對成骨細胞的作用。環(huán)加氧酶2受LMHFV機械應變上調(diào)，并參與成骨細胞增殖。綜上，LMHFV可通過上調(diào)與成骨細胞分化相關蛋白的mRNA轉錄、Wnt相關基因表達、低密度脂蛋白受體相關蛋白6、β聯(lián)蛋白的基因表達以及細胞骨架重構和ER通路來調(diào)節(jié)成骨細胞的增殖、分化及基質(zhì)礦化，從而促進骨愈合。

1.3LMHFV與破骨細胞 除上調(diào)成骨細胞對破骨細胞生成的間接作用外，LMHFV還可能直接作用于破骨細胞。這些細胞來自單核細胞/巨噬細胞的造血譜系，對骨吸收至關重要。破骨細胞的分化和活性由核因子κB受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL)結合誘導，但該作用可被可溶的RANKL結合受體OPG減弱[28]。Wu等[29]對小鼠RAW246.7破骨細胞進行45 Hz(0.3 g)的LMHFV處理(15 min/d)，分析抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)陽性的多核細胞和破骨細胞特異性基因表達，結果表明，機械性振動刺激能夠顯著下調(diào)TRAP陽性多核細胞的形成和破骨細胞基因組織蛋白酶K、基質(zhì)金屬蛋白酶9的生成。TRAP和組織蛋白酶具有骨骼吸收作用，基質(zhì)金屬蛋白酶9可介導前體細胞向骨骼遷移，而LMHFV可減少破骨細胞黏附結構中肌動蛋白環(huán)的形成[30]。Sakamoto等[31]研究發(fā)現(xiàn)，在破骨細胞和骨細胞培養(yǎng)板底部行機械性振動刺激后，破骨細胞的分化明顯增加，其原因可能為振動刺激導致骨細胞上清液中RANKL/OPG比值升高。由此可見，LMHFV可影響破骨細胞功能、抑制破骨細胞增殖，但其對骨骼重構過程中破骨細胞的潛在機制仍需要進一步探索。

1.4LMHFV與骨細胞 骨細胞源自成骨細胞，可嵌入礦化的骨基質(zhì)中，并通過調(diào)節(jié)成骨細胞和破骨細胞活性來調(diào)節(jié)骨骼重構。此外，骨細胞可分泌促進或抑制骨形成或吸收的細胞因子，通過樹突突觸與周圍細胞進行信號傳遞。骨細胞被認為是骨組織中的主要生理機械傳感器，可受LMHFV的影響。Thompson等[32]將LMHFV應用于源自BMSC衍生的骨細胞，未發(fā)現(xiàn)骨細胞標記基因牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1、成纖維細胞生長因子23的變化，表明LMHFV對骨細胞的分化或礦化沒有影響。然而，LMHFV可明顯降低SOST mRNA的表達，但RANKL和OPG不受影響。SOST是成骨細胞骨形成的抑制劑，可增加成骨細胞的骨形成。Sakamoto等[31]發(fā)現(xiàn)，在振動刺激下，MLO-Y4細胞的RANKL mRNA表達增強，而OPG水平不受影響，表明LMHFV對破骨細胞分化具有間接的積極作用。在分子水平上，間隙連接細胞間通訊可能通過連接蛋白43參與振動誘導的細胞機械轉導[33]。綜上，LMHFV可激活RANKL表達并減少骨細胞中SOST，但不直接影響骨細胞分化標記基因。

2 LMHFV對骨再生的作用

骨折發(fā)生后的骨再生需要多種不同細胞類型和生物介質(zhì)之間的復雜相互作用。適當機械性振動刺激對于骨折愈合十分重要，通過LMHFV引入外部機械刺激可對骨形成產(chǎn)生積極影響。骨折發(fā)生時，局部炎癥反應受到促炎介質(zhì)腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1和白細胞介素-6以及抗炎介質(zhì)白細胞介素-10的調(diào)節(jié)[34]。在去勢骨質(zhì)疏松動物模型中，LMHFV影響大鼠骨折愈合過程中的早期炎癥反應，骨質(zhì)疏松大鼠先天免疫的相對穩(wěn)定性有所變化[35]，但關于振動刺激作用下炎癥反應程度變化的認識尚未達成共識[36]，仍需進一步探究。同時，LMHFV被認為可能是影響骨折愈合效果的重要機制。既往研究證實，M2型巨噬細胞可促進祖細胞的成骨分化[37]。骨折早期M1型巨噬細胞較多，而M2型巨噬細胞較少。Chow等[35]發(fā)現(xiàn)，LMHFV可促進骨折早期再生性M2型巨噬細胞的產(chǎn)生，表明振動刺激與巨噬細胞極化表型的改變有關。

骨折愈傷組織中，新血管的形成對骨再生十分重要。骨折部位的血液供應減少導致動物模型和患者的骨愈合效果不佳[38]。由于骨折后纖維愈傷組織的正常形成與骨折愈合結局高度相關，且在很大程度上受到骨折部位生物力學環(huán)境的影響，因此LMHFV施加機械刺激可能促進骨折愈合。有研究表明，LMHFV可加速生理性骨折愈合，并能夠進一步挽救去卵巢誘導的骨質(zhì)疏松性骨折受損愈合[39]。機械性振動刺激在骨折后1～3周通過增加愈傷組織的寬度和面積來促進愈傷組織的形成[40]。但LMHFV僅可改善去卵巢動物的骨折愈合，而其作用于雌激素正常分泌小鼠則表現(xiàn)為骨折愈合延遲[41]。在雌激素缺乏小鼠中，LMHFV(45 Hz、0.3 g)可顯著增加骨折部位礦化骨痂的體積，促進骨形成[42]，可見雌激素在介導LMHFV骨吸收的作用中起著至關重要的作用。在分子水平上，ER的表達可能在振動生物力學誘導的骨折加速愈合中起重要作用。在去卵巢大鼠的骨折中，LMHFV可增強mRNA水平以及蛋白水平上ERα的表達[40]，故推測ERα具有機械刺激感覺功能。

在振動頻率方面，比較間歇性和連續(xù)性振動的療效顯示，LMHFV作用于7 d間隔組實驗動物骨折部位的愈傷組織形成面積最大，骨折愈合效果最佳[43-44]。由此可見，LMHFV可能通過影響骨折部位的局部炎癥反應、巨噬細胞極化表型促進纖維愈傷組織形成，進而促進骨再生，加速骨折愈合。

3 LMHFV對骨植入物的整合作用

復雜多樣的骨創(chuàng)傷類型推動了骨修復材料及相關材料的飛速發(fā)展。隨著材料學的發(fā)展，合金被制成有微孔隙植入物，其可與周圍骨骼更好地結合，并促進合金之間的骨骼生長，且不易發(fā)生松動。使用3D打印的鈦合金骨小梁杯治療骨質(zhì)疏松且初次全髖關節(jié)置換的患者，結果顯示，與鉭杯組相比，鈦杯組的初始穩(wěn)定性及骨長入效果更佳[45]。另有研究顯示，結合3D打印技術個性化定制鈦合金假體能夠成功為患者重建長達11.7 cm的股骨骨缺損[46]。在椎體壓縮性骨折方面，與單純經(jīng)皮椎體成形術治療組相比，3D打印輔助經(jīng)皮椎體成形術治療組的椎體高度恢復率和骨水泥單側分布率均較高，且骨水泥滲漏發(fā)生率較低[47]。骨植入物骨整合是防止骨再生過程中植入物失敗的關鍵，植入物材料及其表面特性可能影響成骨細胞向植入物表面募集和分化，是避免植入物松動的主要因素。

外部生物力學刺激可能是優(yōu)化骨整合的一種良好選擇，其骨合成代謝潛力已充分得到證明，骨-植入物界面的機械條件對骨再生和骨整合至關重要[48]。研究顯示，經(jīng)LMHFV干預的植入物周圍的骨形成明顯增加[49]。此外，LMHFV的應用使骨-植入物界面的骨礦物質(zhì)密度明顯升高，且其作用可通過生物力學測試進一步加強[50]。LMHFV不僅可直接促進植入物與周圍骨組織的緊密接觸，還可在骨折愈合過程中，協(xié)同植入物與骨組織剪切力和骨折部位已形成的新骨共同促進植入物骨整合[51]。LMHFV或阿侖膦酸鹽均可明顯提高去卵巢大鼠的骨整合，與阿侖膦酸鹽相比，LMHFV的作用較小，故認為LMHFV和抗骨質(zhì)疏松藥物可能對植入物的骨整合有附加作用[52]。

在接受LMHFV治療的動物模型中，成骨相關基因Runt相關轉錄因子2、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2和OPG均上調(diào)，表明LMHFV可促進成骨細胞和礦化[53]。在LMHFV作用下，骨合成代謝的經(jīng)典Wnt/β聯(lián)蛋白通路中的β聯(lián)蛋白、Runt相關轉錄因子2表達明顯升高，而SOST蛋白表達明顯降低[54]。此外，RANKL mRNA水平顯著降低，其與破骨細胞的活性和分化與RANKL誘導結合有關[55]，故認為LMHFV可激活成骨細胞并抑制破骨細胞途徑，而骨植入物周圍由機械性振動刺激引起的骨形成機制仍需進一步研究。綜上所述，LMHFV通過促進成骨細胞生成和抗骨吸收作用改善雌激素和缺乏動物模型中鈦植入物的骨整合。

4 小 結

機械刺激被認為是骨骼重構和再生中必不可少的調(diào)節(jié)器。在細胞分子學方面，機械刺激能夠增強MSC和成骨細胞的增殖和成骨分化，ER信號轉導尤其在成骨細胞中起關鍵作用，Wnt/β聯(lián)蛋白信號轉導通路是介導LMHFV影響的重要機械敏感途徑。LMHFV還可誘導細胞骨架重構，這可能影響MSC的增殖和分化。LMHFV可能是改善骨愈合和植入物整合過程的一種有前景的治療策略。LMHFV的臨床應用需要充分認識其分子機制、不良反應及對患者的潛在益處，且其促進骨折愈合的作用、治療方案和安全性需要更多臨床研究的證實?？梢姡磥砣孕璨粩嗵剿鞑煌锪W刺激模式對不同隊列患者的精確和可控治療。