丁焓赟， 何序晨， 方 芳， 宋博文,2， 劇佳華,2， 劉家豐，胡 晉,2， 關(guān)亞靜,2， 胡偉民,2

(1.浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院， 杭州 310058；2.海南浙江大學(xué)研究院， 海南 三亞 572025)

玉米是我國(guó)三大糧食作物之一，面積和總產(chǎn)均居我國(guó)三大糧食作物之首，是人類和畜禽的重要食物來源，也是重要的工業(yè)和醫(yī)藥原料，與人民生活息息相關(guān)[1]。作為典型的喜溫C4植物，玉米對(duì)冷害比較敏感，且適應(yīng)能力差[2]。低溫脅迫會(huì)影響玉米種子萌發(fā)，延遲出苗時(shí)間，降低田間出苗率，抑制幼苗正常的生長(zhǎng)發(fā)育，極大地限制玉米栽培范圍和產(chǎn)量潛力[3-4]。

低溫脅迫對(duì)玉米生長(zhǎng)和發(fā)育期間的生理生化代謝有明顯影響。研究表明，低溫脅迫會(huì)導(dǎo)致玉米生物膜系統(tǒng)的損傷，這種損傷與自由基和活性氧引起的膜脂過氧化有關(guān)。丙二醛(MDA)是膜脂過氧化的重要產(chǎn)物之一，在低溫脅迫下，MDA的大量積累會(huì)使膜透性增加，從而破壞生物膜的完整性。因此，通過測(cè)定MDA含量可以大致了解膜脂過氧化程度，以間接推斷膜系統(tǒng)的損傷程度和植物的抗冷性[5-7]。低溫脅迫可導(dǎo)致植物細(xì)胞中活性氧(ROS)的產(chǎn)生和清除之間的平衡紊亂，可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解、膜損傷、酶失活等[8]。為應(yīng)對(duì)ROS的大量積累所造成的損傷，植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中形成了一套比較完善的活性氧清除系統(tǒng)，其中由過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)等組成的抗氧化酶系統(tǒng)，在清除ROS過程中發(fā)揮了重要的保護(hù)作用[9]。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累是植物在受到環(huán)境脅迫時(shí)一種普遍的代謝適應(yīng)現(xiàn)象。其中，可溶性糖可結(jié)合細(xì)胞內(nèi)的一些大分子形成氫鍵來穩(wěn)定細(xì)胞膜并幫助維持細(xì)胞內(nèi)滲透壓，進(jìn)而提高植物對(duì)溫度脅迫的耐受性[10]。脯氨酸(Pro)不僅具有滲透調(diào)節(jié)功能，還有助于穩(wěn)定亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，清除活性氧，以及在脅迫條件下緩沖細(xì)胞氧化還原電位，同時(shí)在緩解脅迫帶來的壓力時(shí)通過快速分解可以提供足夠的還原劑，以支持線粒體氧化磷酸化并產(chǎn)生ATP修復(fù)脅迫引起的損傷[11]。在多種環(huán)境脅迫下，植物體內(nèi)的Pro合成增加，降解減弱，從而積累Pro來提高植物的脅迫抗性[12]。

苗期是玉米生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，也是對(duì)低溫較為敏感的時(shí)期，此時(shí)遭遇低溫，會(huì)導(dǎo)致田間出苗率和幼苗整齊度下降，降低農(nóng)田經(jīng)濟(jì)效益，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)十分不利。我國(guó)長(zhǎng)江中下游地區(qū)玉米春播時(shí)間一般在3月中下旬，此時(shí)氣候不穩(wěn)定，苗期往往會(huì)受到連續(xù)幾天的低溫影響，并且這種現(xiàn)象所造成的危害，在甜玉米自交系上表現(xiàn)得尤為明顯。本試驗(yàn)采用抗冷型和冷敏感型材料各2份，在室內(nèi)培養(yǎng)箱3 ℃條件下進(jìn)行苗期5 d低溫脅迫處理，測(cè)定苗期葉片的生理生化變化和相關(guān)基因表達(dá)，研究和分析甜玉米自交系對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)機(jī)制，為抗性品種的鑒定和選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

在前期田間和室內(nèi)雙向鑒定的基礎(chǔ)上，選用抗冷型和冷敏感型甜玉米自交系各2份，其中抗冷型為11號(hào)(S 29-1-1-2，種質(zhì)來源：溫帶)和18號(hào)(S 40-4-3-1-2-3，種質(zhì)來源：溫帶×熱帶)；冷敏感型為56號(hào)(T 5-5-1-1-1-3-1，種質(zhì)來源：溫帶×亞熱帶)和69號(hào)(T 46-3-5-3，種質(zhì)來源：亞熱帶)，4個(gè)自交系均為浙江大學(xué)選育。

熒光定量PCR試驗(yàn)所用RNA提取試劑盒購(gòu)自北京華越洋生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit)購(gòu)自北京Takara公司；熒光定量試劑盒(AceQ qPCR SYBR Green Master Mix)購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1低溫處理及取樣

實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)培養(yǎng)。挑選健康、大小均勻的甜玉米種子，0.5%的次氯酸鈉溶液消毒5 min，清水洗凈后播于培養(yǎng)盒內(nèi)，每盒30粒，合并3盒為1個(gè)重復(fù)。將其分為低溫組和正常生長(zhǎng)組，每組3次重復(fù)，并置于25 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)芽。低溫處理參照石云素[13]的方法并略作修改。待玉米幼苗長(zhǎng)到2葉1心時(shí)，置于3 ℃培養(yǎng)箱中處理5 d，再置于25 ℃、12 h光照培養(yǎng)箱中恢復(fù)生長(zhǎng)3 d。分別于低溫處理0 d、1 d、5 d及恢復(fù)生長(zhǎng)1 d、3 d 時(shí)取樣進(jìn)行生理生化指標(biāo)測(cè)定；分別于低溫處理0 d、1 d、3 d、5 d及恢復(fù)生長(zhǎng)3 d時(shí)取樣，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱用于后續(xù)基因表達(dá)量的測(cè)定。取樣時(shí)均取幼苗同一部位葉片，所有指標(biāo)測(cè)量重復(fù)3次。

1.2.2生理生化指標(biāo)測(cè)定

采用蒽酮比色法[14]測(cè)定Pro含量；采用茚三酮顯色法[14]測(cè)定可溶性糖含量。

取0.2 g葉片在pH值為7.8的磷酸緩沖液(PBS)中冰浴研磨成勻漿，4 ℃，10 000 r/min離心15 min，棄沉淀，上清液即為待測(cè)酶液。SOD活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原法[15]；POD活性測(cè)定參照趙文賽[16]的方法并略作修改；CAT活性測(cè)定采用過氧化氫比色法[17]；APX活性測(cè)定采用抗壞血酸比色法[18]；谷胱甘肽還原酶(GR)活性測(cè)定參照Knorzer等[19]的方法并略作修改。

1.2.3熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)

以經(jīng)過低溫脅迫處理及正常生長(zhǎng)的玉米幼苗葉片為試驗(yàn)材料，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，并以此為模板，以ZmActin為內(nèi)參基因，用LightCycler?96熒光定量?jī)x進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)總體積20 μL，包含100 ng cDNA(1 μL)，7.4 μL ddH2O，上、下游引物各0.8 μL，10 μL SYBR?Green Master Mix。qPCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，共45個(gè)循環(huán)。

采用Primer 5.0設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，引物由杭州擎科梓熙生物技術(shù)公司合成。數(shù)據(jù)分析采用LightCycler?96 system軟件和2-ΔΔCT法。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物Table 1 Real-time quantitative PCR primers

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對(duì)甜玉米自交系苗期生長(zhǎng)的影響

由圖1可知，低溫處理前，4個(gè)甜玉米自交系幼苗均為2葉1心，長(zhǎng)勢(shì)良好，葉色濃綠。3 ℃低溫處理1 d后，各自交系幼苗均未發(fā)生顯著變化。低溫處理5 d后，11號(hào)自交系幼苗仍未發(fā)生明顯變化；18號(hào)自交系少部分幼苗葉片邊緣失水萎蔫皺縮，并伴有青黑色；而56號(hào)自交系部分幼苗葉片開始萎蔫下垂，胚芽鞘變?yōu)楹稚?9號(hào)自交系幼苗也出現(xiàn)葉片失水萎蔫的現(xiàn)象?；謴?fù)生長(zhǎng)1 d后的自交系相較于低溫處理第5天無(wú)明顯變化?；謴?fù)生長(zhǎng)3 d后，11號(hào)和18號(hào)自交系雖有部分幼苗葉色發(fā)黃，但植株已恢復(fù)正常生長(zhǎng)，葉片伸展，植株增長(zhǎng)；而56號(hào)和69號(hào)自交系葉片萎蔫失水嚴(yán)重，已全部枯死。由此可見，11號(hào)與18號(hào)自交系抗冷性較強(qiáng)，而56號(hào)與69號(hào)自交系抗冷性差。兩個(gè)敏感型材料相比，56號(hào)自交系對(duì)低溫脅迫更敏感，在恢復(fù)生長(zhǎng)3 d后基本干枯倒伏；69號(hào)自交系主要表現(xiàn)為葉片枯萎但莖稈大部分完好，只有部分幼苗出現(xiàn)倒伏情況。在后續(xù)生理生化指標(biāo)和基因表達(dá)分析取樣時(shí)，56號(hào)與69號(hào)自交系恢復(fù)生長(zhǎng)3 d后的樣品選取尚未完全死亡的幼苗葉片進(jìn)行分析。

圖1 低溫處理期間及恢復(fù)生長(zhǎng)后甜玉米自交系幼苗的生長(zhǎng)情況 Fig.1 Growth of sweet corn inbred line seedlings during low temperature treatment and after recovery

2.2 生理生化指標(biāo)

2.2.1低溫脅迫對(duì)玉米幼苗可溶性糖含量的影響

可溶性糖是植物抵抗低溫的重要保護(hù)性物質(zhì)，能降低冰點(diǎn)，提高原生質(zhì)保護(hù)能力，保護(hù)蛋白質(zhì)膠體不致遇冷變性凝聚。由圖2 A可以看出，11號(hào)和18號(hào)自交系在低溫處理早期可溶性糖含量基本不變，69號(hào)自交系幼苗可溶性糖含量略有下降。11號(hào)、18號(hào)自交系在低溫處理5 d后可溶性糖含量迅速上升，與處理前相比，分別上升88.1%和302.5%；69號(hào)自交系可溶性糖含量也有所升高，但僅上升30.8%?；謴?fù)生長(zhǎng)期間，11號(hào)、18號(hào)和69號(hào)自交系可溶性糖含量均有所下降，恢復(fù)生長(zhǎng)3 d比低溫處理5 d時(shí)分別下降了24.0%、61.5%、78.3%，但11號(hào)和18號(hào)自交系可溶性糖含量仍高于處理前的水平，而69號(hào)則顯著低于處理前的含量。56號(hào)自交系在整個(gè)低溫處理和恢復(fù)生長(zhǎng)階段可溶性糖含量均維持在較低水平，未出現(xiàn)較大幅度的變化。

注：圖中小寫字母表示同一自交系不同處理間數(shù)據(jù)的差異顯著性(p<0.05)。下同。 圖2 不同甜玉米自交系在低溫脅迫及恢復(fù)生長(zhǎng)期間可溶性糖(A)和Pro(B)含量的變化 Fig.2 Changes of soluble sugar(A)and proline(B)contents of different sweet corn inbred lines during low temperature stress and recovery of growth

2.2.2低溫脅迫對(duì)玉米幼苗Pro含量的影響

如圖2 B所示，11號(hào)自交系Pro含量在低溫處理期間表現(xiàn)為先迅速下降而后上升，至恢復(fù)生長(zhǎng)階段再次降低，總體來看，整個(gè)處理過程中Pro含量始終低于處理前的水平，恢復(fù)生長(zhǎng)第3天降幅為81.8%。18號(hào)、56號(hào)自交系在低溫處理期間Pro含量都逐漸上升，處理5 d后含量達(dá)到最高，與處理前相比分別上升了212.0%和208.0%；在恢復(fù)期18號(hào)和56號(hào)自交系的表現(xiàn)存在差異，18號(hào)自交系Pro含量持續(xù)下降，而56號(hào)自交系呈先降低后升高的趨勢(shì)。69號(hào)自交系Pro含量在低溫處理階段基本不變，恢復(fù)正常溫度后Pro含量迅速降低，其表現(xiàn)與冷敏感型56號(hào)自交系完全不同。

2.2.3低溫脅迫對(duì)玉米幼苗POD活性的影響

由圖3 A可以看出，11號(hào)自交系在低溫處理期和恢復(fù)生長(zhǎng)早期POD活性未發(fā)生顯著變化，在恢復(fù)生長(zhǎng)第3天則顯著升高，上升幅度為59.7%。18號(hào)自交系POD活性一直處于上升趨勢(shì)，恢復(fù)生長(zhǎng)第1天上升幅度達(dá)110.4%，恢復(fù)生長(zhǎng)第3天有所下降，但POD活性仍高于低溫處理前水平。56號(hào)自交系在低溫處理期間POD活性也持續(xù)上升，比處理前上升了65.2%，但在恢復(fù)生長(zhǎng)階段顯著降低，與低溫處理5 d時(shí)相比，恢復(fù)生長(zhǎng)第3天POD活性下降了43.0%，低于處理前水平。69號(hào)自交系POD活性在整個(gè)處理時(shí)期表現(xiàn)為持續(xù)下降的趨勢(shì)，恢復(fù)生長(zhǎng)第3天降幅達(dá)到82.1%。

圖3 不同甜玉米自交系在低溫脅迫及恢復(fù)生長(zhǎng)期間抗氧化酶活性的變化 Fig.3 Changes of antioxidant enzyme activities of different sweet corn inbred lines during low temperature stress and recovery of growth

2.2.4低溫脅迫對(duì)玉米幼苗SOD活性的影響

抗性不同的甜玉米自交系在低溫脅迫下SOD活性變化基本一致(圖3 B)。在低溫脅迫早期，SOD活性變化較小，而低溫脅迫5 d后4個(gè)甜玉米自交系SOD活性均顯著升高，與處理前相比分別上升153.2%、57.8%、116.7%和55.4%；但在恢復(fù)生長(zhǎng)階段，抗冷性不同的自交系之間表現(xiàn)出顯著差異，11號(hào)自交系SOD活性變化不顯著，18號(hào)自交系SOD活性略微下降，比低溫脅迫5 d時(shí)僅下降27.2%，而冷敏感型自交系56號(hào)和69號(hào)在恢復(fù)期SOD活性驟然下降，降幅分別達(dá)到71.1%和81.8%。

2.2.5低溫脅迫對(duì)玉米幼苗CAT活性的影響

抗冷型11號(hào)和18號(hào)自交系CAT活性變化與其POD活性變化相似(圖3 C)，11號(hào)自交系總體呈平緩上升的趨勢(shì)，18號(hào)自交系則表現(xiàn)為先升后降，最高上升95.3%。56號(hào)自交系CAT的初始活性較高，在低溫處理期間略微上升，而后在恢復(fù)生長(zhǎng)期迅速下降，最高降低了74.8%；69號(hào)自交系也存在相似的變化，恢復(fù)生長(zhǎng)期最高降低了80.3%，但與其他自交系相比，其CAT活性始終保持在較低水平。

2.2.6低溫脅迫對(duì)玉米幼苗APX活性的影響

如圖3 D所示，11號(hào)自交系在整個(gè)低溫處理及恢復(fù)生長(zhǎng)階段均呈現(xiàn)穩(wěn)步上升的趨勢(shì)，在恢復(fù)生長(zhǎng)第3天，其APX活性達(dá)到最高，比處理前上升了42.2%。18號(hào)自交系A(chǔ)PX活性在低溫處理第5天出現(xiàn)大幅度上升，與處理前相比上升了177.6%，隨后在恢復(fù)期開始下降，至恢復(fù)第3天回落至處理前活性水平。56號(hào)自交系的變化趨勢(shì)與18號(hào)自交系類似，在低溫處理第5天APX活性上升幅度為90.6%，但是在恢復(fù)期活性迅速下降且顯著低于處理前水平。69號(hào)自交系A(chǔ)PX活性與其他3個(gè)自交系相比，低溫處理期變化幅度不大，而恢復(fù)期表現(xiàn)與冷敏感型56號(hào)自交系相同，活性迅速下降。

2.2.7低溫脅迫對(duì)玉米幼苗GR活性的影響

由圖3 E可以看出，11號(hào)、18號(hào)和56號(hào)自交系在低溫處理階段GR活性持續(xù)上升，變化趨勢(shì)相似，而69號(hào)自交系則未發(fā)生顯著變化。在恢復(fù)期，56號(hào)和69號(hào)自交系GR活性大幅下降，恢復(fù)生長(zhǎng)第1天與低溫處理5 d時(shí)相比，降幅分別達(dá)到77.1%和84.2%，并顯著低于處理前水平；18號(hào)自交系在恢復(fù)生長(zhǎng)第3天回落至處理前水平；11號(hào)自交系在恢復(fù)期未發(fā)生顯著變化，與處理第5天相比，仍保持較高的GR活性。

2.3 相關(guān)基因表達(dá)

2.3.1低溫脅迫對(duì)玉米幼苗Pro合成和降解相關(guān)基因表達(dá)的影響

已有研究表明，Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase，P 5 CS)是谷氨酸途徑合成Pro的關(guān)鍵酶，而脯氨酸脫氫酶(Proline dehydrogenase，ProDH)是Pro降解的主要限速酶[20]。如圖4所示，18號(hào)自交系ZmP5CS表達(dá)量在低溫處理第1天小幅度上升，隨后略微下降，至恢復(fù)生長(zhǎng)第3天則顯著升高，比處理前增加102.6%；而56號(hào)自交系ZmP5CS表達(dá)量在低溫處理第1天小幅度降低，恢復(fù)生長(zhǎng)期沒有顯著變化，總體來看56號(hào)自交系ZmP5CS表達(dá)量在整個(gè)處理及恢復(fù)生長(zhǎng)階段變化趨勢(shì)較平穩(wěn)。18號(hào)和56號(hào)自交系ZmProDH表達(dá)量均呈先升后降的趨勢(shì)，不同的是18號(hào)、56號(hào)自交系ZmProDH表達(dá)量分別在低溫處理第3天和第5天達(dá)到峰值，與處理前相比增幅分別為280.3%和270.5%，隨后在恢復(fù)生長(zhǎng)第3天均迅速下降，顯著低于處理前水平，與峰值相比分別下降了92.4%和98%。

圖4 低溫脅迫下不同甜玉米自交系Pro合成和降解基因的表達(dá)Fig.4 Expression of proline synthesis and degradation genes in different sweet corn inbred lines under low temperature stress

2.3.2低溫脅迫對(duì)玉米幼苗抗氧化酶相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖5可以看出，抗冷型18號(hào)自交系SOD相關(guān)基因ZmSOD3表達(dá)量在低溫處理第1天顯著上升，隨后迅速回落至處理前的水平，低溫處理5 d又顯著升高，至恢復(fù)生長(zhǎng)第3天其表達(dá)量達(dá)到峰值，比處理前增加119.6%；而ZmSOD4表達(dá)趨勢(shì)完全不同，在低溫處理第1天其表達(dá)量顯著上升，隨后迅速下降，至低溫處理結(jié)束前一直保持較低水平，恢復(fù)期略有上升但仍顯著低于處理前水平；ZmSOD9表達(dá)趨勢(shì)與ZmSOD3相似，但表達(dá)量的首個(gè)峰值出現(xiàn)在低溫處理第3天，隨后開始回落，至恢復(fù)生長(zhǎng)第3天又顯著上升，比處理前增加411.0%。18號(hào)自交系CAT相關(guān)基因ZmCAT1和ZmCAT2表達(dá)趨勢(shì)相同，均在低溫處理第3天表達(dá)量達(dá)到峰值，與處理前相比增幅分別為279.8%和239.3%；而ZmCAT3隨著低溫處理時(shí)間增加，表達(dá)量顯著下降，但在恢復(fù)生長(zhǎng)第3天后大幅升高，并顯著高于處理前。APX相關(guān)基因ZmAPX2在低溫處理階段表達(dá)量未發(fā)生顯著變化，在恢復(fù)生長(zhǎng)第3天略有下降，比處理前降低35.4%。GR相關(guān)基因ZmGR表達(dá)趨勢(shì)與ZmCAT1和ZmCAT2相似，但其表達(dá)量在低溫處理第1天顯著升高，增幅為246.8%，之后迅速回落，至恢復(fù)生長(zhǎng)第3天又恢復(fù)到處理前的水平。

圖5 低溫脅迫下不同甜玉米自交系抗氧化酶相關(guān)基因的表達(dá) Fig.5 Expression of antioxidant enzymes related genes in different sweet corn inbred lines under low temperature stress

對(duì)于冷敏感型56號(hào)自交系，其ZmSOD3、ZmSOD9、ZmCAT1和ZmCAT2在低溫處理及恢復(fù)生長(zhǎng)階段整體表現(xiàn)為下降的趨勢(shì)，且表達(dá)量保持在較低水平；ZmSOD4表達(dá)量在低溫處理第1天顯著升高，上升幅度為182.0%，隨后顯著降低，但仍然高于處理前水平，到恢復(fù)生長(zhǎng)第3天卻急劇下降，基本檢測(cè)不到其表達(dá)量。ZmCAT3在低溫處理第1天表達(dá)量顯著下降，第3天又迅速回升，之后持續(xù)下降，至恢復(fù)生長(zhǎng)第3天表達(dá)量顯著低于處理前水平。而ZmAPX2表達(dá)量表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)，低溫處理第3天達(dá)到峰值，與處理前相比上升了78.2%，恢復(fù)生長(zhǎng)第3天又迅速下降，與處理前相比總降幅為80.2%。ZmGR表達(dá)量在整個(gè)低溫處理及恢復(fù)生長(zhǎng)階段都很低，基本檢測(cè)不到。

3 結(jié)論與討論

3.1 低溫脅迫對(duì)玉米幼苗生長(zhǎng)的影響

低溫是典型的環(huán)境脅迫因素之一，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育有重要的影響。一般認(rèn)為，低溫脅迫會(huì)使植物能量產(chǎn)生和物質(zhì)合成受阻，消耗增強(qiáng)，當(dāng)植物長(zhǎng)期處于低溫下就會(huì)造成饑餓狀態(tài)，嚴(yán)重影響植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育甚至導(dǎo)致死亡。本試驗(yàn)通過對(duì)4個(gè)不同抗性的甜玉米自交系進(jìn)行苗期3 ℃、5 d低溫處理發(fā)現(xiàn)，在低溫處理早期其生長(zhǎng)狀態(tài)均未發(fā)生顯著變化，但在低溫處理末期，抗冷型自交系仍保持正常生長(zhǎng)狀態(tài)，而冷敏感型自交系出現(xiàn)較為明顯的葉片萎蔫甚至下垂的現(xiàn)象；恢復(fù)生長(zhǎng)后抗冷型自交系幼苗已開始正常生長(zhǎng)僅有少部分葉色發(fā)黃，而56號(hào)和69號(hào)自交系絕大多數(shù)失水死亡。由此說明，低溫對(duì)植物體造成的傷害程度不僅取決于低溫的程度，還取決于低溫持續(xù)時(shí)間。低溫脅迫時(shí)間較短、程度較輕，會(huì)使細(xì)胞的生活力降低、植物的生長(zhǎng)停滯，如果低溫脅迫時(shí)間過長(zhǎng)或溫度過低，則可能延緩植物的生長(zhǎng)發(fā)育，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致植物死亡。

3.2 低溫脅迫對(duì)可溶性糖含量的影響

可溶性糖作為細(xì)胞主要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，在植物遭受低溫脅迫時(shí)可通過其含量的增加來提高細(xì)胞滲透勢(shì)，從而減緩細(xì)胞失水，提高植物的抗冷性。通過糖的代謝，可溶性糖產(chǎn)生其他代謝產(chǎn)物，保護(hù)細(xì)胞膜系統(tǒng)免受逆境傷害[21]。研究表明，可溶性糖的含量是冷馴化完成程度的標(biāo)志性指標(biāo)，與植物抗冷性呈正相關(guān)[22]。在本試驗(yàn)中，抗冷性不同的4個(gè)甜玉米自交系幼苗在低溫脅迫早期可溶性糖含量均未發(fā)生顯著變化，而隨著低溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，抗冷性強(qiáng)的11號(hào)和18號(hào)自交系可溶性糖含量顯著升高，而抗冷性弱的69號(hào)自交系可溶性糖含量?jī)H升高30.8%。由此可見，一般情況下，低溫會(huì)誘導(dǎo)玉米幼苗可溶性糖含量的升高，其積累的程度與抗冷性存在較強(qiáng)的相關(guān)性，這也與自交系幼苗在低溫脅迫下的生長(zhǎng)表現(xiàn)相一致。抗冷型自交系在恢復(fù)期可溶性糖含量下降緩慢，恢復(fù)生長(zhǎng)第3天可溶性糖含量仍高于處理前的水平；但冷敏感型自交系在恢復(fù)正常生長(zhǎng)溫度第1天，其可溶性糖含量急劇下降，并顯著低于處理前的水平，無(wú)法維持細(xì)胞滲透勢(shì)，從而導(dǎo)致細(xì)胞嚴(yán)重失水，形態(tài)上表現(xiàn)為失水萎蔫甚至枯死。

3.3 低溫脅迫對(duì)Pro代謝的影響

在逆境下Pro的積累主要包括三方面原因：一是Pro合成加強(qiáng)，二是Pro氧化作用受抑制，三是低溫抑制了蛋白質(zhì)合成，蛋白質(zhì)的分解大于合成，也就抑制了Pro滲入蛋白質(zhì)的過程[23]。已有研究表明，玉米游離Pro含量與抗冷性呈正相關(guān)[24]。在本試驗(yàn)中，除11號(hào)自交系外，其他3個(gè)自交系在低溫脅迫期間Pro含量均顯著上升，這與前人研究基本相符。雖然在多種非生物逆境脅迫下Pro的降解減弱或被抑制，但Pro降解過程在維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的平衡，以及提供脅迫恢復(fù)后植物恢復(fù)正常生長(zhǎng)的能量源方面有著重要作用[25]。因此，這可能是4個(gè)自交系在恢復(fù)生長(zhǎng)后Pro含量降低的主要原因，但56號(hào)自交系在恢復(fù)正常生長(zhǎng)第3天，Pro含量的異常升高可能與Pro降解途徑受阻等有關(guān)，而69號(hào)自交系在恢復(fù)生長(zhǎng)后幼苗失水萎蔫嚴(yán)重可能導(dǎo)致了Pro含量的急劇下降。

脅迫條件下Pro合成酶基因P5CS的表達(dá)量增加，降解酶基因ProDH的表達(dá)量降低[26]；而且脅迫條件下P 5 CS酶活性增加，ProDH酶活性降低，游離Pro的積累增加[27]。因此，目前比較一致的結(jié)論為：在多種非生物脅迫下，植物體內(nèi)的Pro合成增強(qiáng)，降解減弱，從而引起Pro的積累，提高植物對(duì)脅迫的抗性。本試驗(yàn)通過對(duì)甜玉米自交系幼苗葉片中ZmP5CS和ZmProDH的表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)，在低溫脅迫下，抗冷性強(qiáng)的18號(hào)自交系ZmP5CS的表達(dá)量略有上升，并且在恢復(fù)期顯著升高，而抗冷性弱的56號(hào)自交系ZmP5CS的表達(dá)量未發(fā)生較為明顯的變化；ZmProDH在18號(hào)和56號(hào)自交系中的表現(xiàn)則基本相似，均在低溫脅迫期間出現(xiàn)表達(dá)高峰，這一現(xiàn)象與前人研究不相符。不僅如此，對(duì)比測(cè)得的葉片Pro含量可以看出，Pro代謝基因的表達(dá)模式與實(shí)際Pro含量的變化趨勢(shì)并不一致，這可能與低溫脅迫影響Pro代謝途徑中關(guān)鍵酶的活性有關(guān)。此外，干旱和低溫均能活化Pro合成的2條途徑，且干旱脅迫下Pro的積累更依賴于鳥氨酸途徑[26-27]。因此，低溫對(duì)鳥氨酸途徑造成的影響或許也會(huì)導(dǎo)致這一現(xiàn)象發(fā)生。

3.4 低溫脅迫對(duì)抗氧化酶系統(tǒng)的影響

POD作為內(nèi)源活性氧清除劑，能夠在低溫逆境中清除體內(nèi)過量的H2O2，維持活性氧代謝的平衡，保持膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而減輕或消除傷害。本試驗(yàn)結(jié)果表明，抗冷性強(qiáng)的自交系在低溫脅迫期POD活性持續(xù)上升，尤其是18號(hào)自交系上升幅度達(dá)到了110.4%；抗冷性弱的56號(hào)自交系上升幅度只有65.2%。說明抗冷型自交系的POD活性更容易受到低溫誘導(dǎo)。在恢復(fù)期POD活性同樣處于較高的水平，這與馮玉磊等[28]、王曉楠等[29]的結(jié)論基本相同。

玉米中SOD同工酶主要是銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)、錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)和鐵超氧化物歧化酶(Fe-SOD)。其中SOD 3編碼線粒體Mn-SOD，SOD 4、SOD 9編碼細(xì)胞質(zhì)型Cu/Zn-SOD[30]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，4個(gè)甜玉米自交系中SOD活性在低溫脅迫初期均未發(fā)生顯著變化，但是隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，第5天的SOD活性均顯著升高，說明低溫脅迫5 d后玉米幼苗內(nèi)氧自由基含量有了較多的積累，植株開始通過增加SOD活性應(yīng)對(duì)低溫?fù)p傷產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)以清除多余的氧自由基。而在恢復(fù)期抗冷型和冷敏感型自交系表現(xiàn)出極大差異，抗冷性強(qiáng)的11號(hào)和18號(hào)自交系仍保持較高的SOD活性，但冷敏感型的56號(hào)和69號(hào)自交系SOD活性驟然下降，顯著低于處理前的水平，說明低溫脅迫所積累的傷害已經(jīng)對(duì)幼苗的正常生長(zhǎng)及生理代謝造成了嚴(yán)重影響，從而使SOD活性降低；相反，抗冷性強(qiáng)的自交系幼苗為了防止受到進(jìn)一步傷害而保持著較高的酶活性。從qPCR分析中可以看出，18號(hào)自交系ZmSOD3、ZmSOD4以及56號(hào)自交系ZmSOD4表達(dá)量在低溫脅迫初期顯著升高，說明在低溫脅迫初期幼苗就開始響應(yīng)低溫危害；而且ZmSOD3、ZmSOD4和ZmSOD9表達(dá)量出現(xiàn)峰值的時(shí)間為第1天至第3天，這與酶活性的趨勢(shì)略有不同，可能是因?yàn)閺幕蜣D(zhuǎn)錄至翻譯成蛋白質(zhì)這一過程需要其他的酶參與，而低溫對(duì)這些酶的活性存在一定影響，從而使得基因表達(dá)與酶活性表現(xiàn)之間存在一種滯后現(xiàn)象。在恢復(fù)生長(zhǎng)期SOD合成相關(guān)基因的表達(dá)量與酶活性的表現(xiàn)較為一致，尤其是冷敏感型56號(hào)自交系在恢復(fù)生長(zhǎng)末期基本檢測(cè)不到SOD合成相關(guān)基因的表達(dá)量，說明低溫已經(jīng)對(duì)幼苗造成不可逆的損傷。

CAT、APX、GR活性在各個(gè)自交系之間的表現(xiàn)趨勢(shì)大致相同，其中11號(hào)自交系酶活性水平持續(xù)上升，在恢復(fù)期依然保持較高的酶活性；18號(hào)自交系表現(xiàn)為先升后降，但在恢復(fù)期只有APX和GR活性回落到處理前水平，說明抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)在低溫脅迫階段參與了活性氧的清除。56號(hào)自交系的3種酶活性雖然在低溫處理期也顯著上升且酶活性水平較高，而在恢復(fù)期有明顯的驟然下降趨勢(shì)，這可能與恢復(fù)正常溫度后植株葉片萎蔫、細(xì)胞正常生理代謝活動(dòng)受阻等有關(guān)，相應(yīng)的酶活性也隨之驟降；同理，69號(hào)自交系在恢復(fù)階段酶活性降低的原因可能也是如此。從基因表達(dá)水平上看，18號(hào)自交系在低溫處理期CAT活性升高是ZmCAT1、ZmCAT2和ZmCAT3共同作用的結(jié)果，而在脅迫后的恢復(fù)期ZmCAT3表達(dá)量顯著上升，對(duì)后期酶活性的維持可能起著主導(dǎo)作用；ZmAPX2和ZmGR的表達(dá)趨勢(shì)與酶活性的變化大致相同。而56號(hào)自交系ZmCAT1一直保持較低的表達(dá)水平，ZmCAT2在低溫處理第1天顯著上升，ZmCAT3在低溫處理早期卻顯著下降，低溫處理第3天又顯著上升，隨后顯著下降，因此CAT活性升高可能先后與ZmCAT2和ZmCAT3有較為密切的關(guān)系；ZmAPX2在56號(hào)自交系中的表達(dá)與酶活性表現(xiàn)基本一致，而ZmGR則基本檢測(cè)不到其表達(dá)，與酶活性表現(xiàn)存在較大出入，可能與轉(zhuǎn)錄和翻譯后的一系列調(diào)控有關(guān)。除此之外，基因表達(dá)與酶活性峰值出現(xiàn)差異的原因可能與SOD類似。

總的來說，在低溫脅迫1 d后玉米自交系的部分抗氧化酶活性開始產(chǎn)生變化，在處理5 d時(shí)變化最為顯著，與Burnett等[31]的研究基本相符。同時(shí)，結(jié)合抗氧化酶活性變化以及基因表達(dá)水平變化可以發(fā)現(xiàn)，抗冷型自交系在低溫脅迫下抗氧化酶基因的表達(dá)量整體高于冷敏感型自交系，表明抗冷型自交系在低溫逆境時(shí)能建立更強(qiáng)的抗氧化防御機(jī)制來清除活性氧，從而保護(hù)植物細(xì)胞免受毒害。

自交系幼苗為了應(yīng)對(duì)低溫脅迫，通過提高細(xì)胞可溶性糖及Pro含量，以維持正常滲透勢(shì)及氧化還原狀態(tài)的平衡，并提供脅迫解除后植株正常生長(zhǎng)所需的能量源，同時(shí)也需要多種抗氧化酶共同參與清除活性氧。因此，從響應(yīng)機(jī)制來看，可溶性糖與Pro的積累以及多種抗氧化酶的共同參與可能是玉米幼苗抗冷性形成的重要途徑，同時(shí)恢復(fù)期也是其響應(yīng)機(jī)制的關(guān)鍵時(shí)期。