石如如， 石鳳翎， 徐 舶

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼草栽培、加工及高效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 呼和浩特 010011)

苜蓿是世界上最重要的飼料作物之一，它是一種高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的多年生豆科植物，有“牧草之王”的美譽(yù)[1]。但種質(zhì)資源貧乏與遺傳基礎(chǔ)漸趨狹窄是制約我國苜蓿產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。因此，當(dāng)務(wù)之急是培育一批國產(chǎn)苜蓿新品種，加大高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆品種的推廣力度。

目前，我國利用雜種優(yōu)勢(shì)得到多種具有優(yōu)良性狀的紫花苜蓿雜交品種[2]，如草原1號(hào)、草原2號(hào)、草原3號(hào)雜花苜蓿等。不同紫花苜蓿品種雜交，其F1代雜種能表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢(shì)。Sakiroglu等[3]將抗寒性的秋眠紫花苜蓿與半秋眠紫花苜蓿雜交，發(fā)現(xiàn)雜種表現(xiàn)出產(chǎn)量的雜種優(yōu)勢(shì)。雜種優(yōu)勢(shì)利用的實(shí)質(zhì)是配合力育種，而正確選擇父母本是苜蓿育種成功的重要因素之一[4]。配合力是雜種優(yōu)勢(shì)利用中篩選強(qiáng)優(yōu)勢(shì)組合的主要因素，只有選育出高配合力的親本，才能組配出強(qiáng)優(yōu)勢(shì)的雜交組合，因此了解親本農(nóng)藝性狀的配合力將有助于更有效地選配優(yōu)良親本。隨著DNA分子標(biāo)記迅速發(fā)展，國內(nèi)外學(xué)者在玉米[5]、水稻[6]、高粱[7]等作物中利用雜交親本遺傳距離來預(yù)測(cè)雜種優(yōu)勢(shì)，并闡明親本遺傳距離與子代雜種優(yōu)勢(shì)的相關(guān)關(guān)系[8]。關(guān)于苜蓿親本主要農(nóng)藝性狀的配合力及與雜種優(yōu)勢(shì)之間的相關(guān)關(guān)系也有大量研究。陳海玲等[9]對(duì)8個(gè)苜蓿雄性不育系的配合力和遺傳力進(jìn)行分析，篩選出3個(gè)雄性不育系的一般配合力較好，可作優(yōu)良親本；薛曉蘭等[10]對(duì)6個(gè)苜蓿雄性不育株系與7個(gè)苜蓿品種的配合力進(jìn)行研究，證明分枝數(shù)和株高是影響苜蓿雜交組合牧草產(chǎn)量?jī)?yōu)勢(shì)形成的主要性狀;王虹等[11]對(duì)16個(gè)苜蓿優(yōu)良株系組合雜種一代的產(chǎn)量和品質(zhì)一般配合力的分析和評(píng)價(jià)，篩選出2個(gè)一般配合力高的株系與6個(gè)一般配合力中等的株系。楊青川等[12]對(duì)107個(gè)苜蓿耐鹽單株的耐鹽性一般配合力進(jìn)行測(cè)定，再將配合力高的單株相互雜交，在兩次選擇的基礎(chǔ)上再混合選擇，得到了70個(gè)雜交后的耐鹽苜蓿新材料。

為提高二倍體苜蓿強(qiáng)優(yōu)勢(shì)雜交組合的選育效率，在崔楠[13]、徐舶等[14]研究基礎(chǔ)上，本研究以花藥組織培養(yǎng)的同源四倍體苜蓿的單倍體與二倍體扁蓿豆進(jìn)行雜交，使用SRAP標(biāo)記檢測(cè)親本間的遺傳距離，并進(jìn)一步探索其與農(nóng)藝性狀配合力之間的關(guān)系，以期為苜蓿雜交育種中親本選配及雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)選用3份通過花藥組織培養(yǎng)單倍體苜蓿材料，2份扁蓿豆材料(表1)，按照不完全雙列雜交設(shè)計(jì)配制10個(gè)雜交組合(F1)。

表1 親本材料名稱及來源Table 1 Name and source of parent materials

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究選用的5個(gè)親本、10個(gè)雜交組合材料于2019年在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所國家多年生牧草資源圃(位于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)沙爾沁)試驗(yàn)基地種植。其中，小區(qū)面積3 m×6 m,株行距均為50 cm，單株育苗移栽。小區(qū)土壤肥力與管理措施保持一致，與一般大田相同。本試驗(yàn)于材料生長第二年的初花期測(cè)定親本及其雜交組合第一茬單株地上生物量、株高、分枝數(shù)、節(jié)間長、節(jié)間數(shù)、中間小葉長和寬等表型性狀，并計(jì)算各性狀的配合力與雜種優(yōu)勢(shì)效應(yīng)。

1.2.2SPAR標(biāo)記

采用改良CTAB法提取各親本基因組DNA。按照Li和Quiros[15]公布的SPAR標(biāo)記上游引物和下游引物6個(gè)，共合成36對(duì)組合，從中篩選出多態(tài)性好，條帶清晰的引物組合用于遺傳距離的分析。PCR反應(yīng)體系 (20 μL)為[16]：1 μL 的DNA模板約30 ng,2×TaqPCR MasterMix 10 μL,上游引物(10×)和下游引物(10×)各1 μL，ddH2O 7 μL。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性1 min，35 ℃復(fù)性1 min,72 ℃延伸 1 min,5個(gè)循環(huán)；94 ℃變性 1 min，50 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 7 min， 4 ℃保存?zhèn)溆谩．a(chǎn)物于8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，電泳結(jié)束后用銀染法顯色。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SAS 9.0軟件對(duì)田間數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；雜種優(yōu)勢(shì)以中親雜種優(yōu)勢(shì)(H)表示：

H=[F1-(P1+P2)/2]/[ (P1+P2)/2]×100%

根據(jù)各引物擴(kuò)增譜帶的結(jié)果，建立0、1統(tǒng)計(jì)表(相同遷移位置上有帶的記為1，無帶的記為0)，然后利用NTsys 2.10 軟件計(jì)算遺傳距離。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本間的遺傳距離分析

親本間遺傳距離分析結(jié)果如表2所示，遺傳距離在0.089 7～0.662 1之間，遺傳距離最大的組合是CY-35×ZB(0.662 1)，遺傳距離最小的組合是CY-35×CY-5(0.089 7)。在各雜交組合中，共有6個(gè)雜交組合的遺傳距離大于平均距離(0.429 0)，表明親本間的遺傳差異較大。

表2 親本材料遺傳距離Table 2 Genetic distances between the parental materials

表3 各性狀的配合力方差分析Table 3 Variance analysis on combining ability of each trait

表4 5個(gè)親本材料農(nóng)藝性狀GCA效應(yīng)值Table 4 General combining ability values for agronomic traits in the 5 parental materials

2.2 配合力分析

2.2.1各性狀配合力方差分析

對(duì)雜交組合間的株高、分枝數(shù)、單株產(chǎn)量等7個(gè)性狀的配合力進(jìn)行方差分析，結(jié)果(表3)表明，區(qū)組間除葉寬差異顯著外(p>0.05)，其余性狀區(qū)組間均無顯著差異(p<0.05)，而組合間僅有節(jié)間數(shù)與葉長無顯著差異(p<0.05)，其余性狀均有顯著差異(p>0.05)，表明5個(gè)親本間存在遺傳差異，可進(jìn)行進(jìn)一步配合力分析。

對(duì)親本間的GCA以及雜交組合間的SCA方差分析表明，P1中的株高、單株產(chǎn)量的GCA達(dá)到了顯著水平(p>0.05)，P2中節(jié)間數(shù)、節(jié)間長的GCA有顯著水平(p>0.05)，P1×P2的SCA方差中僅有節(jié)間長達(dá)顯著水平(p>0.05)。由此可見，節(jié)間長主要受P2的一般配合力和組合間的特殊配合力影響，說明該性狀遺傳主要受加性效應(yīng)和非加性效應(yīng)共同影響；而株高、節(jié)間數(shù)、單株產(chǎn)量主要受親本的一般配合力影響，其遺傳主要受加性效應(yīng)影響。

2.2.2親本的GCA效應(yīng)分析

由表4可見，GCA在不同的性狀間存在明顯的差異，說明各個(gè)親本在不同性狀上受基因加性效應(yīng)的影響水平不同。其中，XJ-3、CY-35和ZB株高與單株生物量效應(yīng)值均為正值，CY-35的兩個(gè)性狀效應(yīng)值最高，說明利用CY-35更容易配制出株高與產(chǎn)量均較高的雜交組合。 XJ-3和ZB節(jié)間長GCA 值為負(fù)值，其余均為正值。ZB節(jié)間數(shù)和葉長的GCA在5個(gè)親本中較優(yōu)，表明ZB不僅可以顯著提高后代的節(jié)間數(shù)，同時(shí)在增加葉長方面具有顯著的正向作用，是個(gè)優(yōu)良的親本。CY-5分枝數(shù)的GCA達(dá)0.95，為5個(gè)親本中最大，說明利用CY-5中決定分枝數(shù)的基因加性效應(yīng)最好，雜交后代中更容易選育出多分枝后代材料。各個(gè)親本在7個(gè)性狀上均有不同程度的加性效應(yīng)，相同親本不同性狀的GCA效應(yīng)值表現(xiàn)出的較大差異,說明各親本各性狀的加性效應(yīng)作用程度不同。

2.2.3組合SCA效應(yīng)分析

各雜交組合的SCA值均存在較大差異(表5)。10個(gè)雜交組合中，株高SCA效應(yīng)值為正效應(yīng)的組合有5個(gè)，其中較優(yōu)的組合為CY-35×HB、CY-35×ZB、CY-5×XJ-3、XJ-3×CY-5；分枝數(shù)變幅為-1.28～0.40，具有正向SCA效應(yīng)值的組合數(shù)4個(gè)，其中較優(yōu)的組合為XJ-3×CY-5、CY-5×ZB，SCA效應(yīng)值均在0.30以上；節(jié)間數(shù)與節(jié)間長SCA效應(yīng)值為正值的有6個(gè)，節(jié)間數(shù)較高的組合為CY-35×XJ-3、CY-5×XJ-3，SCA效應(yīng)值均在1.35以上；節(jié)間長較優(yōu)的組合是CY-35×HB、CY-5×XJ-3，SCA效應(yīng)值均在1.0以上；單株產(chǎn)量變幅為-0.05～0.04，具有正向SCA效應(yīng)值的組合數(shù)5個(gè)，其中較高的組合是XJ-3×CY-5、CY-35×CY-5。葉長與葉寬SCA效應(yīng)值均為正值的組合有CY-5×HB、CY-35×ZB。

表5 10個(gè)組合農(nóng)藝性狀SCA效應(yīng)值Table 5 Special combining ability effect values of agronomic traits in 10 combinations

綜合分析可看出，在10個(gè)雜交組合中，XJ-3×CY-5單株生物量GCA及株高、分枝數(shù)、節(jié)間數(shù)、葉寬的SCA均較高，表明XJ-3×CY-5為最優(yōu)組合；其次是CY-35×HB和CY-5×XJ-3兩個(gè)組合，株高GCA較高，其中CY-35×HB的分枝數(shù)、節(jié)間長、單株產(chǎn)量SCA較高，CY-5×XJ-3節(jié)間數(shù)、節(jié)間長，葉長SCA較高，且這些親本的多個(gè)指標(biāo)也具有較大的GCA值，表明上述雜交組合在對(duì)應(yīng)性狀上有較大突破潛力，可以作為優(yōu)良組合加以利用。

2.3 雜種優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)

10個(gè)雜交組合各性狀的雜種優(yōu)勢(shì)差異較大(表6)，其中單株產(chǎn)量的雜種優(yōu)勢(shì)變異幅度最大，為-32.48%～81.93%，CY-35×HB組合在單株產(chǎn)量、節(jié)間長、葉長三個(gè)性狀上雜種優(yōu)勢(shì)都表現(xiàn)最高。XJ-3×HB組合在株高上雜種優(yōu)勢(shì)最高，為45.63%；XJ-3×CY-5、CY-35×CY-5、CY-5×XJ-3組合在分枝數(shù)上雜種優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)正向優(yōu)勢(shì)，其余組合都為負(fù)向優(yōu)勢(shì)；節(jié)間數(shù)除XJ-3×ZB、CY-35×CY-5組合表現(xiàn)為負(fù)向優(yōu)勢(shì)外，其余組合都為正向優(yōu)勢(shì)。組合XJ-3×CY-5、CY-35×XJ-3、CY-5×XJ-3有6個(gè)性狀呈正向優(yōu)勢(shì)。

表6 苜蓿10個(gè)雜交組合雜種優(yōu)勢(shì)Table 6 Heterosis for each trait in 10 cross combinations of alfalfa單位：%

2.4 遺傳距離與配合力、雜種優(yōu)勢(shì)的相關(guān)性

對(duì)苜蓿各性狀雜種優(yōu)勢(shì)、配合力與親本間遺傳距離進(jìn)行相關(guān)性分析(結(jié)果見表7)。在苜蓿7個(gè)性狀中，單株地上生物量、葉長及葉寬的雜種優(yōu)勢(shì)與GCA呈顯著相關(guān)，株高、節(jié)間數(shù)、節(jié)間長的雜種優(yōu)勢(shì)與SCA呈顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.680以上。遺傳距離僅與節(jié)間數(shù)的GCA呈顯著的正相關(guān)，與其他性狀的SCA、GCA均無顯著的相關(guān)性，此外，遺傳距離與葉寬的雜種優(yōu)勢(shì)呈顯著的負(fù)相關(guān)(γ=-0.758)，與其他性狀相關(guān)性不顯著，這表明親本間的遺傳距離與配合力對(duì)后代的雜種優(yōu)勢(shì)并沒有直接影響。

表7 各性狀的遺傳距離與配合力、雜種優(yōu)勢(shì)的相關(guān)性Table 7 Correlation of genetic distance for each trait with combining ability and hybrid advantage

3 討 論

配合力分析是親本組配雜交組合最有效的一種方法，被廣泛應(yīng)用于小麥、玉米[17]等作物。一般配合力主要由基因的加性效應(yīng)決定，它是指某一親本品種和其他若干品種雜交后，在某個(gè)數(shù)量性狀上雜交后代所表現(xiàn)的平均值[18]。能夠穩(wěn)定遺傳的材料，親本性狀一般配合力較高，性狀向后代傳遞的能力也較強(qiáng)[19]。一般來說，特殊配合力較高的雜交組合，親本的一般配合力效應(yīng)值也較高，但陳小龍等[20]，Kimbeng等[21]研究認(rèn)為，一般配合力與特殊配合力高無明顯的對(duì)應(yīng)關(guān)系。本研究表明，雙親具有較低的一般配合力所組配的雜交組合的特殊配合力也不一定低，而一般配合力高的親本所組配雜交組合的特殊配合力不一定高；例如XJ-3和CY-5單株生物量的一般配合力很低，而XJ-3×CY-5組配的特殊配合力很高，CY-5與HB分枝數(shù)的一般配合力最高，而CY-5×HB特殊配合力卻很低。本研究對(duì)苜蓿與扁蓿豆各組合的配合力進(jìn)行方差分析，株高、節(jié)間數(shù)、單株地上生物量主要受加性基因控制，僅有節(jié)間長同時(shí)受加性基因和非加性基因共同影響。本研究還發(fā)現(xiàn)，雜交組合具有較高的特殊配合力，則至少有一個(gè)親本的一般配合力較高，如株高組合CY-35×HB的特殊配合力為最高，親本CY-35的一般配合力為親本中最大，而HB一般配合力效應(yīng)值較小。這與陳森等[22]、吳立東[23]的結(jié)論相同；因此在實(shí)際育種中，既要考慮親本的一般配合力，同時(shí)也要重視組合的特殊配合力。同一親本材料分別為父母本時(shí)在組合中的性狀表現(xiàn)不同，如CY-5為父本時(shí)，參與組配雜交組合平均干草產(chǎn)量為253.5 g/株，雜種優(yōu)勢(shì)均表現(xiàn)為正向優(yōu)勢(shì)，組合XJ-3×CY-5分枝數(shù)的效應(yīng)值為0.316 7，是正效應(yīng)，而為母本時(shí)雜種優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)為負(fù)向優(yōu)勢(shì)，CY-5×XJ-3分枝數(shù)的效應(yīng)值為-0.350 0,是負(fù)效應(yīng)，因此CY-5更適合作為父本材料。對(duì)于同一性狀，同一父本與不同母本所組配的雜交組合的特殊配合力效應(yīng)值也存在差異。比如XJ-3×HB株高的效應(yīng)值為0.238 9，呈正效應(yīng)，而CY-5×HB株高的效應(yīng)值為-0.861 1，呈負(fù)效應(yīng)。這與苑少華等[24]、宋旭東等[25]的結(jié)論相同。因此，配合力效應(yīng)值必然會(huì)受到性狀間的互作效應(yīng)的影響，在雜交種組配上，要根據(jù)育種目標(biāo)綜合考慮所有重要性狀，只有找到各平衡點(diǎn)時(shí)，才能確定最優(yōu)雜交組合，這種根據(jù)親本所具備的優(yōu)缺點(diǎn)有針對(duì)性地進(jìn)行組配組合，可以提高育種效率。

雜種優(yōu)勢(shì)是植物界中一種基本的生物學(xué)現(xiàn)象，它的基礎(chǔ)是兩個(gè)親本間的遺傳差異，其特征是在一定的范圍內(nèi)雜種的表現(xiàn)優(yōu)于其父母本，而優(yōu)勢(shì)的大小取決于雙親的遺傳差異和性狀的互補(bǔ)，差異越大雜種優(yōu)勢(shì)越明顯[26]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者利用SSR和SRAP分子標(biāo)記等方法分析親本間的遺傳距離預(yù)測(cè)雜種優(yōu)勢(shì)，但結(jié)論均不一致。Lee等[27]和姚艷梅等[28]將分子標(biāo)記技術(shù)研究玉米自交系和甘藍(lán)型油菜等，眾多類似例子發(fā)現(xiàn)遺傳距離與雜種優(yōu)勢(shì)間存在相關(guān)性，然而SSR分子標(biāo)記用于大豆遺傳多樣性的分析研究中，親本間雜種優(yōu)勢(shì)相關(guān)程度難以預(yù)測(cè)[28]。劉宏偉等[29]利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)18個(gè)雜種小麥進(jìn)行遺傳差異分析，發(fā)現(xiàn)遺傳距離不能預(yù)測(cè)雜種小麥的雜種優(yōu)勢(shì)；本研究結(jié)果表明，SRAP標(biāo)記遺傳距離除了葉寬外與其他性狀均無相關(guān)性，這表明分子標(biāo)記估算遺傳距離具有一定的局限性，除了可以預(yù)測(cè)葉寬的雜種優(yōu)勢(shì)，其他性狀的雜種優(yōu)勢(shì)都難以預(yù)測(cè)。烏云塔娜等[30]也得到了類似的結(jié)果，因此，如何提高分子標(biāo)記技術(shù)在二倍體苜蓿雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)中的準(zhǔn)確性仍是一個(gè)難題。同時(shí)，這也是未來苜蓿雜種優(yōu)勢(shì)研究的一個(gè)重要方向，有待開展。

4 結(jié) 論

雜交組合XJ-3×CY-5和CY-35×HB在多個(gè)指標(biāo)性狀上都表現(xiàn)為較高的SCA效應(yīng)值，且其親本的GCA值也較高，單株生物量雜種優(yōu)勢(shì)也較強(qiáng)，可作為優(yōu)良雜交組合加以利用。結(jié)合配合力分析可知，雜交組合XJ-3×CY-5和CY-35×HB在各性狀雜種優(yōu)勢(shì)上均表現(xiàn)較優(yōu)，是后期雜交育種的首選組合。說明通過各性狀配合力的分析及雜種優(yōu)勢(shì)的規(guī)律可以組配出強(qiáng)優(yōu)勢(shì)的雜交組合，但以SRAP遺傳距離還不足以準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)雜種優(yōu)勢(shì)。