白楊 史冀華 張水軍

原發(fā)性肝癌、肝硬化等嚴重威脅著人民的生命健康，肝移植是目前治療這些嚴重肝病的重要手段。在肝移植過程中，不可避免地會發(fā)生肝組織缺血，缺血肝組織在重新獲得血流灌注及氧供后，細胞功能結構不能及時恢復，反而較缺血時加重，導致細胞死亡、組織壞死、器官進一步惡化的綜合征，稱為肝臟缺血-再灌注損傷（hepatic ischemia-reperfusion injury，HIRI），嚴重制約肝移植的臨床治療效果。

根據(jù)發(fā)生階段和原因的不同，HIRI可分為熱缺血損傷和冷缺血損傷。熱缺血損傷一般發(fā)生在肝切除、心臟死亡供者供肝肝移植以及肝缺血性休克期間，以肝實質細胞損傷為主，可導致肝臟甚至多器官衰竭[1]。冷缺血損傷常發(fā)生在供肝冷保存階段，常見于肝竇內皮細胞損傷和微循環(huán)障礙[2]。

HIRI的病理生理過程復雜，發(fā)生機制尚未完全闡明，目前認為HIRI與鈣超載、氧化應激損傷、酸中毒、內毒素損傷、補體激活等機制相關[3]。當前認為在熱缺血損傷中，缺血、缺氧會直接導致肝實質細胞損傷。在冷缺血損傷中，內皮細胞損傷是HIRI的始動因素，可引起肝臟枯否細胞激活、中性粒細胞浸潤、血小板激活、細胞因子釋放，觸發(fā)局部無菌炎癥反應，導致血管持續(xù)收縮、微循環(huán)障礙，甚至肝功能障礙[4]。程序性細胞死亡是一種依賴于特定分子機制的細胞死亡形式，可以被藥物或基因調控，包括細胞凋亡、鐵死亡、壞死性凋亡、細胞焦亡、多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（poly adenosine-diphosphate-ribose polymerase，PARP）-1依賴性細胞死亡等，現(xiàn)已成為HIRI的研究熱點，本文就肝臟缺血-再灌注過程中程序性細胞死亡方式的研究進展予以綜述。

1 細胞凋亡

1972年，Kerr等[5]首先提出了細胞凋亡的概念，用來描述一種形態(tài)上與細胞壞死截然不同的細胞死亡形式。其主要的形態(tài)學特征為細胞體積縮小，連接消失，細胞質密度增加；線粒體膜電位消失，通透性改變；核質濃縮，核膜核仁破碎，DNA降解成為180～200 bp的片段；胞膜內側的磷脂酰絲氨酸外翻，形成胞膜結構完整的凋亡小體。根據(jù)起始階段啟動途徑的不同，凋亡可分為內源性細胞凋亡和外源性細胞凋亡[6-7]。內源性細胞凋亡是由細胞內微環(huán)境改變引發(fā)的一種程序性細胞死亡形式，如內質網應激、DNA損傷、活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）超載、有絲分裂缺陷或者微管改變等[6,8]。細胞微環(huán)境異常引發(fā)的刺激導致線粒體外膜上B細胞淋巴瘤（B cell-lymphoma，Bcl）-2基因家族促凋亡蛋白的寡聚化，形成蛋白脂質孔道，增加線粒體外膜通透性，導致促凋亡因子從線粒體膜間隙釋放到胞漿中，促使半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase）-3、6、7、9的活化?；罨腃aspase進一步導致DNA片段化、磷脂酰絲氨酸暴露和凋亡小體的形成，引發(fā)細胞凋亡。外源性細胞凋亡是由細胞膜受體檢測到的細胞外微環(huán)境的異常所引發(fā)的細胞凋亡，通常由腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）家族成員觸發(fā)，包括TNF本身、人凋亡相關因子配體（FasL）和TNF相關凋亡誘導配體（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）等[9]。死亡受體與配體結合后募集銜接蛋白和起始蛋白原，形成死亡誘導信號復合物，進而激活Caspase，引發(fā)下游級聯(lián)反應，導致細胞凋亡。Caspase-8和Caspase-10也可以在復合體內自我激活，并直接激活Caspase-3，進一步導致DNA降解和細胞凋亡[10]。

細胞凋亡是目前HIRI過程中研究最多的細胞死亡方式，HIRI會促進凋亡，使肝細胞再生受阻，最終導致原發(fā)性肝衰竭和移植后移植物長期功能障礙。研究表明，缺血階段損傷主要表現(xiàn)為細胞壞死，再灌注階段損傷主要表現(xiàn)為細胞凋亡，并與缺血時間、程度和再灌注情況有關[11]。在冷缺血期間，凋亡主要發(fā)生在非實質細胞，在熱缺血和再灌注后，實質細胞和非實質細胞均可發(fā)生細胞凋亡。HIRI時，細胞凋亡是一個不斷發(fā)生的動態(tài)過程，細胞表面分子受到誘導因子刺激后將信號傳入細胞，形成級聯(lián)式信號轉導，通過啟動其自身內部的基因表達，最后導致細胞死亡。

研究發(fā)現(xiàn)抑制凋亡可達到保護肝功能的目的。Caspase-3的激活是凋亡細胞DNA降解的前提，Cursio[12]發(fā)現(xiàn)抑制這些蛋白水解酶的激活可明顯減輕HIRI。加入外源性環(huán)磷酸腺苷可以明顯減少肝細胞凋亡[13]，應用超氧物歧化酶等抗氧化劑也可減少自由基的產生，顯著減少細胞凋亡[14]。對于凋亡相關基因的干擾抑制同樣能達到減輕HIRI的目的。其它如一氧化氮等在肝移植過程中對肝臟也起到了一定的保護作用。

2 自噬及自噬依賴性細胞死亡

1963年，de Duve[15]首次提出并描述了細胞自噬現(xiàn)象。1992年，Takeshige等[16]利用酵母突變體確定了參與自噬過程的基因，奠定和推進了自噬的研究進展。自噬是一種受調控的細胞分解代謝過程[17]，負責在生物合成過程中清除長壽蛋白、受損細胞器和畸形蛋白質，維持細胞內環(huán)境穩(wěn)定和能量平衡[18]。根據(jù)細胞物質運到溶酶體內的途徑不同，自噬分為宏自噬、微自噬以及分子伴侶介導的自噬。在自噬過程中，由雙層膜囊泡構成的自噬小體可吞噬細胞內容物質，與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解吞噬內容物質[19]。自噬通過對細胞內物質的降解和再循環(huán)，維持了細胞自身的新陳代謝，對細胞存活和恢復內部穩(wěn)態(tài)起到了重要作用[20]。自噬依賴性細胞死亡是一種受調控的細胞死亡方式，僅取決于自噬機制，需要通過相關手段抑制自噬可阻止細胞死亡來確認，同時需排除凋亡、壞死等細胞死亡機制。自噬依賴性細胞死亡方式的標準過于嚴格，目前相關報道較少。

在正常肝臟中，自噬維持在一個較低水平，以維持肝臟的穩(wěn)態(tài)。大部分研究發(fā)現(xiàn)肝臟缺血-再灌注后，自噬水平增加[21-23]。HIRI可以激活磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）通路和腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）通路，通過Beclin-1通路激活自噬，肝臟通過自噬降解細胞內物質，維持能量水平并且清除受損的細胞器和蛋白質，促進肝細胞存活。而在嚴重的肝臟缺血性損傷期間，過度的自噬可能會破壞必需的蛋白質和細胞器，導致細胞凋亡和壞死[24]。然而，自噬在HIRI的作用尚存在很大爭議[25]，缺血-再灌注后肝臟的自噬水平增加還是減少以及自噬對肝臟起保護還是損傷作用仍有待闡明。關于HIRI中自噬的研究結果存在差異可能與自噬評價方法不同、缺乏特異性的自噬激動劑或抑制劑等有關。

研究顯示，減少自噬可以有效減輕HIRI。在供肝冷保存液中加入自噬抑制劑渥曼青霉素和PI3K/Akt通路特異性抑制劑LY294002抑制自噬小體的形成和成熟，可以緩解肝功能障礙和降低受體病死率[24]。使用常溫機械灌注的供肝，可以減少肝細胞自噬的水平，增加三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）生成，提高供肝質量[26]。

3 鐵死亡

2012年，Dixon等[27]在研究Erastin通過RAS基因突變誘導細胞死亡機制時發(fā)現(xiàn)一種鐵離子介導的新型細胞程序性死亡方式，并根據(jù)其特征將這種特殊的細胞死亡方式稱為鐵死亡。當細胞受到刺激時，引發(fā)細胞內鐵超載及脂質過氧化，胞內谷胱甘肽（glutathione，GSH）耗竭，谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）4活性降低，脂質過氧化物不能被還原反應代謝，從而積聚在胞內，引起線粒體明顯萎縮，膜密度增加，線粒體嵴減少伴有嵴丟失和外膜破裂，導致鐵死亡[28]。

鐵死亡參與了HIRI病理生理過程[29]。HIRI可上調鐵死亡標志物環(huán)加氧酶和脂質過氧化水平。鐵超載是HIRI的一個新的危險因素，在小鼠模型中，高鐵飲食增加機體鐵負荷，可以加重HIRI[29]。鐵死亡主要涉及鐵穩(wěn)態(tài)和脂質過氧化代謝的遺傳改變，但具體調控機制及其與其他細胞死亡方式是否具有協(xié)同作用有待進一步研究。

研究發(fā)現(xiàn)抑制鐵死亡可以減輕HIRI。Yamada等[29]發(fā)現(xiàn)鐵死亡特異性抑制劑鐵抑制素-1、Liproxstatin-1和α-生育酚可明顯減輕肝臟炎癥反應，通過去鐵胺的鐵螯合作用也可以減輕HIRI。目前研究表明鐵死亡參與了HIRI，調控鐵死亡可干預HIRI，因此明確鐵死亡具體機制及下游調控機制，有望為HIRI的治療提供新的研究思路和治療策略。

4 壞死性凋亡

2005年，Degterev等[30]提出了壞死性凋亡的概念，用來描述一種在細胞凋亡受抑制的情況下，激活死亡受體依然能誘導細胞死亡的新型細胞死亡形式。壞死性凋亡可通過多種不同的死亡受體激活，包括TNF受體（TNF receptor，TNFR）1、人凋亡相關因子配體受體（Fas）、Z-DNA結合蛋白（Z-DNA binding protein，ZBP）1或病原體識別受體等[31]。死亡受體激活是否誘導凋亡或壞死性凋亡取決于受體相互作用蛋白激酶（receptor interacting protein kinase，RIPK）1和RIPK3。Caspase-8激活后裂解RIPK1和RIPK3，逆轉平衡導致凋亡，Caspase-8受到抑制后將導致RIPK1/RIPK3復合物的組裝，形成壞死小體，壞死小體催化混合譜系激酶結構域樣假激酶（mixed lineage kinase domain-like pseudokinase，MLKL） 磷酸化，導致MLKL聚合物形成后轉移到胞膜，使胞膜分解，增加胞膜通透性，細胞質和細胞器普遍腫脹，細胞內容物被釋放到微環(huán)境中，導致壞死性凋亡。

研究表明，在HIRI的病理生理過程中，特別是冷缺血階段，會導致壞死性凋亡的發(fā)生。Zhong等[32]發(fā)現(xiàn)，HIRI后RIPK3和MLKL表達水平顯著上調，且老齡小鼠壞死性凋亡比年輕小鼠更明顯。Lin等[33]發(fā)現(xiàn)喂食高脂肪食物的小鼠在HIRI后顯示出RIPK3和MLKL表達增加，表明脂肪變性的肝臟更容易發(fā)生壞死性凋亡。

研究表明，在HIRI情況下，壞死性凋亡特異性抑制劑Nec-1可有效抑制ROS的產生，減輕炎癥反應，且與發(fā)生肝臟脂肪變性的野生型小鼠相比，特異性敲除MLKL小鼠的肝臟損傷程度更輕[34]。臨床有大量因脂肪變性而廢棄的供肝，壞死性凋亡的轉化研究可能有助于減輕脂肪變性肝臟的損傷程度，使這些邊緣供肝成為潛在的候選移植物。

5 細胞焦亡

2001年，Brennan等[35]提出了細胞焦亡的概念，用來描述一種由Caspase-1激活介導的依賴于焦孔素（Gasdermin D，GSDMD）蛋白家族成員的新型程序性細胞死亡方式。細胞焦亡在形態(tài)學上兼具壞死和凋亡的特征。根據(jù)啟動途徑的不同，細胞焦亡可分為Caspase-1依賴的經典途徑和Caspase-4、5、11依賴的非經典途徑[36]。當細胞受到外界各種刺激時，可以迅速識別病原體相關分子模式和損傷相關分子模式，從而激活胞內Caspase-1的活性，啟動細胞焦亡經典途徑。在以革蘭陰性菌表面脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）為代表的各種感染因素的刺激下，LPS可以胞吞形式進入細胞與Caspase-4、5、11前體特異性結合并將其活化，啟動細胞焦亡非經典途徑?；罨腃aspase進一步引發(fā)細胞核固縮、染色質DNA斷裂，同時Caspase激活后裂解GSDMD，裂解后的GSDMD片段會直接誘導細胞膜穿孔、破裂?；罨腃aspase還通過剪切白細胞介素（interleukin，IL）-1β和IL-18前體，形成具有活性的IL-1β和IL-18，并通過穿孔破碎的細胞膜釋放到細胞外引發(fā)局部和全身炎癥反應[37]。研究表明，Caspases引發(fā)的級聯(lián)反應是調控細胞死亡或炎癥的中心環(huán)節(jié)[38]。

研究表明，HIRI可激活Caspase-1依賴的細胞焦亡經典途徑，活化的Caspase-1在再灌注后1 h表達增多，并一直持續(xù)至再灌注后6 h，激活炎癥反應通路[39]。HIRI還會激活Caspase-11依賴的細胞焦亡非經典途徑。再灌注時，腸道內革蘭陰性菌可隨血液由肝門移位入肝釋放LPS，激活枯否細胞的胞內因子核因子（nuclear factor，NF）-κB，促進Caspase-11的轉錄與翻譯；另一方面，LPS以胞吞形式進入枯否細胞，與Caspase-11在胞內結合，并將其活化，啟動細胞焦亡非經典途徑[40]。

抑制細胞焦亡可以有效減輕肝臟炎癥反應。Hua等[41]研究發(fā)現(xiàn)，GSDMD基因敲除可保護枯否細胞免受HIRI誘導的細胞焦亡。在小鼠HIRI模型中也證實抑制Caspase-1、11可減少IL-1β和IL-18釋放，減輕HIRI。先天免疫細胞的焦亡加重了HIRI，針對焦亡通路的靶點研究可能為臨床提供新的治療策略。

6 PARP-1依賴性細胞死亡

2009年，David等[42]在腦細胞中發(fā)現(xiàn)了一種依賴PARP-1的細胞死亡方式，并命名為Parthanatos，即PARP-1依賴性細胞死亡。在形態(tài)學上，PARP-1依賴性細胞死亡兼具有細胞凋亡和壞死的一些特征。環(huán)境變化或DNA損傷引起的PARP-1過度激活后會造成多聚二磷酸腺苷核糖（poly adenosine-diphosphateribose，PAR）產物的聚集，導致線粒體通透性的增加，引起凋亡誘導因子（apoptosis-inducing factor，AIF）從線粒體釋放并攜帶巨噬細胞遷移抑制因子進入細胞核，最終剪切染色體DNA，產生15～50 kb的DNA片段，導致細胞死亡[43]。Caspase在PARP-1依賴性細胞死亡過程中被激活，且Caspase抑制劑并不能阻止這個過程，但PARP抑制劑及沉默或敲除PARP-1可有效阻止。

研究表明HIRI可以激活PARP-1依賴性細胞死亡通路。PARP-1是肝臟炎癥反應的關鍵介質，HIRI可顯著誘導PARP-1上調并募集中性粒細胞至肝臟，促使炎癥反應的發(fā)生[44]。但目前PARP-1依賴性細胞死亡的調控機制以及下游機制尚不明確，PARP-1激活是如何誘導線粒體釋放AIF尚不清楚。抑制PARP-1依賴性細胞死亡可減輕HIRI。應用PARP-1抑制劑5-氨基異喹啉酮可減少中性粒細胞浸潤，減少血管細胞黏附分子的表達，保存內皮完整性；特異性敲除PARP-1可使肝臟免受LPS誘導的休克及缺血性損傷[44]。明確PARP-1依賴性細胞死亡具體機制及上游調控機制，將會為HIRI提供新的研究思路和治療策略。

7 結 語

HIRI是影響患者肝臟外科手術后肝功能及生存率的重要因素，程序性細胞死亡是HIRI的重要特征之一，新型細胞死亡形式的發(fā)現(xiàn)極大地提高了我們對于HIRI病理生理學的理解。在缺血-再灌注期間，程序性細胞死亡可以呈現(xiàn)出不同的作用，不同的細胞死亡方式在HIRI中相互調控的關系需要進一步探索。溶酶體細胞死亡、NETotic cell death、Entotic cell death等新型細胞死亡形式在HIRI中的作用也尚未見報道，亟待進一步的研究?，F(xiàn)今各種細胞死亡的抑制劑已經進入臨床試驗，然而使用時仍需解決許多問題。但是隨著研究的不斷深入，各種類型的細胞死亡的抑制劑可能會進一步發(fā)展，并普及運用到臨床當中，減少HIRI，提高肝移植成功率，改善受者預后。