郭文文 袁圓 魏華鋒 羅豪 李靈玉 呂興華

缺血-再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）是指缺血組織或器官血液供應(yīng)恢復(fù)導(dǎo)致的再灌注損傷，其特點是發(fā)生氧化應(yīng)激、炎癥和細(xì)胞凋亡[1]。在器官移植、創(chuàng)傷性休克、外科手術(shù)、血栓等發(fā)生血液循環(huán)障礙時，均會出現(xiàn)IRI，嚴(yán)重時可引起多器官功能障礙綜合征，病死率極高。缺血和隨后的再灌注引起受影響組織器官的各種代謝改變，缺血期影響細(xì)胞三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）水平和細(xì)胞內(nèi)pH值，通過損害ATP酶依賴的離子運輸，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)和線粒體鈣水平增加（Ca2+超載）。ATP的缺乏也會破壞細(xì)胞調(diào)節(jié)機制，導(dǎo)致細(xì)胞器和質(zhì)膜的裂解。盡管再灌注是挽救缺血組織所必需的，但會加速活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生，導(dǎo)致促炎細(xì)胞的形成、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、細(xì)胞內(nèi)離子和pH穩(wěn)態(tài)的改變，進一步加重組織損傷[2]。

瞬時受體電位陽離子通道蛋白6（transient receptor potential canonical，TRPC）6是一種受體激活的非選擇性陽離子通道，在整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織中均有表達(dá)[3]。已有研究表明TRPC6是IRI發(fā)病機制中上調(diào)的差異表達(dá)基因，提示其可能是治療IRI的新靶點[4]。因此，本文對TRPC6在IRI中的研究進展做一簡要總結(jié)，以期為改善器官移植過程中IRI提供參考。

1 TRPC6的概述及功能

瞬時受體電位（transient receptor potential，TRP）通道是一組主要位于多種細(xì)胞質(zhì)膜上的離子通道，對陽離子具有較大的非選擇性滲透[5]。哺乳動物TRP通道家族共有28個成員，分為6個亞家族：TRPA、TRPC、TRPM、TRPML、TRPP和TRPV，彼此之間具有一定的結(jié)構(gòu)相似性[6]。TRP通道是感覺信號的重要媒介，對細(xì)胞功能和信號通路有顯著影響。編碼TRP通道的基因突變是導(dǎo)致人類幾種遺傳性疾病（TRP通道?。┑脑颍@些疾病影響心血管、腎臟、骨骼和神經(jīng)系統(tǒng)[6]。TRPC是TRP家族中一組由受體控制的Ca2+滲透非選擇性陽離子通道。哺乳動物TRPC的7個成員，根據(jù)其氨基酸序列和功能相似性，可進一步分為4個亞群（TRPC1、TRPC2、TRPC4/5和TRPC3/6/7），具有廣泛的細(xì)胞功能和生理作用[7]。其中TRPC6在胎盤、心臟、肺、胰腺、腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)和大腦的許多區(qū)域高度表達(dá)[2]，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+，參與調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激，跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移、趨化、吞噬和細(xì)胞因子釋放的免疫應(yīng)答[8-9]。

2 TRPC6與缺血-再灌注損傷

2.1 TRPC6與腎缺血-再灌注損傷

腎IRI是一種以腎功能受損為特征的嚴(yán)重綜合征，與慢性腎病的高發(fā)生率相關(guān)，并可能發(fā)展為終末期腎病，導(dǎo)致多器官衰竭而增加病死率[10]。已有研究表明，氧化應(yīng)激、Ca2+超載和線粒體功能障礙是IRI期間細(xì)胞損傷和凋亡的關(guān)鍵因素。因此，減輕Ca2+超載誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，可促進腎小管上皮細(xì)胞完整性和功能的恢復(fù)[11]。TRPC6是一種非選擇性Ca2+通道，是維持正常腎功能的重要蛋白，對腎IRI有保護作用[12-13]。

Hou等[14]研究發(fā)現(xiàn)腎IRI后TRPC6表達(dá)增加，導(dǎo)致Ca2+過度內(nèi)流，減輕腎小管上皮細(xì)胞的保護性自噬，從而增加IRI作用下的細(xì)胞凋亡。TRPC6敲除增強了自噬水平，減輕了線粒體功能障礙和細(xì)胞凋亡，顯著降低蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracelluar regulated protein kinase，ERK）1/2的磷酸化水平。這些發(fā)現(xiàn)提示敲除TRPC6可通過降低Ca2+超載，參與下調(diào)磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/Akt和 ERK信號，顯著改善腎IRI。Shen等[13]研究結(jié)果顯示，腎IRI后HK-2細(xì)胞的凋亡和壞死明顯增加，TRPC6表達(dá)顯著上調(diào)，誘導(dǎo)受體相互作用蛋白（receptorinteracting protein，RIP）1、多聚二磷酸腺苷核糖聚合 酶（poly adenosine-diphosphate-ribose polymerase，PARP）-1和沉默信息調(diào)節(jié)因子（sirtuin）-2蛋白的表達(dá)，用壞死性凋亡抑制劑necrostatin-1（Nec-1）治療后，可以顯著抑制IRI誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死性凋亡。而敲除TRPC6進一步增強了IRI誘導(dǎo)的RIP1表達(dá)上調(diào)，逆轉(zhuǎn)了IRI誘導(dǎo)的PARP-1的表達(dá)，但對IRI后sirtuin-2的表達(dá)沒有影響，表明TRPC6參與了IRI后的壞死性凋亡。進一步使用TRPC6激動劑OAG后，顯著減輕了IRI后壞死性凋亡，然而使用TRPC6抑制劑SKF96365后，細(xì)胞壞死性凋亡加重，提示TRPC6可能通過阻斷腎IRI誘導(dǎo)的壞死性凋亡，在腎IRI中發(fā)揮保護作用。該課題組進一步研究發(fā)現(xiàn)TRPC6為微小核糖核酸（microRNA，miR）-26a的直接靶基因，miR-26a不僅與缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor，HIF）-α作用形成正反饋環(huán)，而且還直接抑制TRPC6活性，首次證明Nec-1可通過抑制壞死性凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥等途徑有效保護腎IRI，并可能是通過HIF-1α/miR-26a/TRPC6/PARP-1信號通路發(fā)揮作用[15]。

2.2 TRPC6與心肌缺血-再灌注損傷

心肌IRI在急性心肌梗死、心臟驟停、經(jīng)皮冠狀動脈介入治療和心臟手術(shù)中較常見，其病死率較高。在心肌IRI過程中，線粒體中Ca2+積累可導(dǎo)致線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）的激活。mPTP激活后，線粒體迅速膨脹并釋放凋亡和壞死因子，激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteine aspartic acid protease，Caspase）依賴性和非依賴性的細(xì)胞死亡，從而引起心肌功能障礙。因此，減少Ca2+進入，切斷Ca2+超載是減輕心肌IRI的一種有效方法[16]。已有研究表明，使用SKF96365或敲除TRPC6可以保護心肌H9c2細(xì)胞免受缺氧-復(fù)氧損傷[17]。

Yang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，七氟醚預(yù)處理可上調(diào)間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）中的TRPC6、HIF-1α、CXC趨化因子受體（CXC chemokine receptor，CXCR）4和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達(dá)，以及缺氧-復(fù)氧條件下MSC中VEGF的釋放，通過小干擾核糖核酸（small interfering RNA，siRNA）敲除TRPC6可逆轉(zhuǎn)這一過程。此外，與缺氧-復(fù)氧組比較，MSC移植組和七氟醚預(yù)處理的MSC移植組小鼠再灌注后3 d左心室射血分?jǐn)?shù)、左心室短軸縮短率明顯改善，梗死面積減小，血清乳酸脫氫酶、心肌肌鈣蛋白I水平降低，血清白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-10水平顯著升高，IL-1β和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α水平顯著降低，表明七氟醚預(yù)處理通過激活TRPC6調(diào)節(jié)的HIF-1α/CXCR4/VEGF軸，促進MSC誘導(dǎo)的血管生成，改善損傷小鼠左心室收縮功能，減輕心肌梗死和炎癥，增強對心肌IRI的保護作用。Ramez等[19]研究發(fā)現(xiàn)，即使是短期的有氧運動訓(xùn)練也可以顯著提高血漿Klotho水平，而Klotho是一種抗衰老蛋白，可抑制心肌IRI過程中TRPC6的表達(dá)，減小梗死面積，保護心臟免受IRI，可作為治療和預(yù)防心肌IRI的靶點。

2.3 TRPC6與腦缺血-再灌注損傷

腦IRI是指缺血性腦卒中患者缺血區(qū)域恢復(fù)血流后并不能恢復(fù)缺血區(qū)組織功能，反而加重了缺血區(qū)損傷和功能障礙的現(xiàn)象，具有發(fā)生率高、致殘率高、病死率高的特點[20]。Ca2+超載是腦IRI的關(guān)鍵因素，大量Ca2+內(nèi)流可導(dǎo)致線粒體功能障礙和ROS的產(chǎn)生，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)自由基生成，最終導(dǎo)致氧化應(yīng)激和神經(jīng)元凋亡[21]。越來越多的證據(jù)表明，TRPC6在腦IRI中發(fā)揮重要作用[22]。TRPC6作為Ca2+內(nèi)流的調(diào)節(jié)因子，參與神經(jīng)元存活、突觸形成、神經(jīng)元生長引導(dǎo)和感覺傳導(dǎo)[23]。增加TRPC6的表達(dá)可保護缺血神經(jīng)元，抑制TRPC6的表達(dá)可誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，因此TRPC6已成為缺血性腦卒中潛在的治療靶點[21]。

Liu等[24]研究了TRPC6在氧糖剝奪細(xì)胞模型和大腦中動脈閉塞小鼠腦卒中模型中的作用，發(fā)現(xiàn)在IRI時TRPC6顯著下調(diào)，HYP99（選擇性TRPC6激動劑）可減輕缺血后小鼠腦梗死病變、減少星形細(xì)胞凋亡及皮質(zhì)中IL-6和IL-1β的釋放，而SKF96365則加重了損傷。此外，TRPC6的過表達(dá)降低了IRI誘導(dǎo)的Ca2+進入星形膠質(zhì)細(xì)胞，減輕星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡、細(xì)胞毒性、炎癥反應(yīng)和核因子（nuclear factor，NF）-κB磷酸化，表明TRPC6可作為一個潛在的靶點，在IRI中降低星形膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和凋亡，進而減輕缺血性腦損傷。Wang等[25]通過建立大鼠中動脈閉塞IRI模型和皮層神經(jīng)元氧糖剝奪模型，探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow stromal cell，BMSC）聯(lián)合奧拉西坦治療急性腦IRI的療效，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療組TRPC6表達(dá)增加，神經(jīng)元細(xì)胞死亡減少，梗死面積縮小，缺血腦組織的功能恢復(fù)顯著改善，提示TRPC6在BMSC和奧拉西坦聯(lián)合治療中發(fā)揮重要作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)BMSC在TRPC6通路的激活中發(fā)揮作用，奧拉西坦可以通過抑制TRPC6降解來保護TRPC6神經(jīng)元存活通路的完整性，表明TRPC6神經(jīng)元存活通路在BMSC聯(lián)合奧拉西坦治療急性腦IRI的保護作用中發(fā)揮了重要作用。

2.4 TRPC6與肺缺血-再灌注損傷

肺IRI在肺移植、急性肺栓塞術(shù)后較常見，常引起急性肺損傷，可導(dǎo)致死亡。肺IRI通常導(dǎo)致微血管內(nèi)皮的大規(guī)模損傷、肺水腫和嚴(yán)重的器官功能障礙，其與氧化應(yīng)激、Ca2+超載、炎癥反應(yīng)等有關(guān)[26]。最近的研究表明，TRPC6在肺中高表達(dá)，Ca2+通過TRPC6進入對增加內(nèi)皮細(xì)胞通透性和損害肺血管屏障功能至關(guān)重要[27]。

Weissmann等[28]研究發(fā)現(xiàn)，TRPC6是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX）2產(chǎn)生ROS的一個靶點，OAG顯著增強了野生型小鼠肺IRI后的血管通透性，TRPC6敲除小鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞中Ca2+的水平降低，從而保護受損肺組織。在野生型和NOX2缺陷小鼠肺IRI后，野生型小鼠肺血管通透性增強，肺重量顯著增加，毛細(xì)血管過濾系數(shù)增加，而NOX2缺陷小鼠肺組織幾乎完全不受影響，表明NOX2和TRPC6在小鼠肺IRI的過程中具有不可或缺的作用。另有研究發(fā)現(xiàn)SH045（選擇性TRPC6抑制劑）能減少小鼠離體肺組織的水腫，治療肺IRI引起的水腫[29]。因此，TRPC6可作為治療肺IRI的一個有效靶點。

2.5 TRPC6與視網(wǎng)膜缺血-再灌注損傷

已有研究發(fā)現(xiàn)TRPC6在哺乳動物視網(wǎng)膜中高表達(dá)，表明TRPC6參與了視網(wǎng)膜正常生理功能的調(diào)節(jié)[30]。Wang等[31]研究發(fā)現(xiàn)TRPC6信使核糖核酸（messenger RNA，mRNA）和蛋白在大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層選擇性富集，視網(wǎng)膜缺血60 min可誘導(dǎo)TRPC6 mRNA和蛋白升高，再灌注后24 h達(dá)到峰值。TRPC6激動劑可顯著提高視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活率，抑制劑可降低視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞細(xì)胞密度。進一步研究發(fā)現(xiàn)，阻斷TRPC6后腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子前體在24 h內(nèi)增加，表明TRPC6的保護作用可能是通過腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子依賴途徑介導(dǎo)的。

3 TRPC6靶向藥物在IRI中的治療前景

IRI可引起一系列嚴(yán)重的臨床問題，目前尚無有效的解決辦法。TRPC6是Ca2+可滲透的非選擇性陽離子質(zhì)膜通道，作為治療IRI潛在靶點而獲得了相當(dāng)大的關(guān)注[22]。TRPC6是開發(fā)治療IRI藥物的一個很有前途的分子靶點，關(guān)于調(diào)節(jié)TRPC6活性的藥物已有大量研究，具有巨大的臨床應(yīng)用潛力。

3.1 金絲桃素及其衍生物

金絲桃素是貫葉連翹的提取物，具有神經(jīng)保護和抗抑郁樣特性[32]。在不同的嚙齒動物缺血性卒中模型中，金絲桃素已被證明能促進卒中后神經(jīng)和血管生成[33]。Lin等[34]研究發(fā)現(xiàn)金絲桃素及其衍生物可以特異性激活TRPC6，抑制鈣蛋白酶（calpain）介導(dǎo)的TRPC6降解，進而通過RAS/MEK/ERK和鈣調(diào)蛋白/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅳ途徑增加環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP response element-binding protein，CREB）的磷酸化，參與缺血性腦卒中后的神經(jīng)保護。但是金絲桃素被認(rèn)為與細(xì)胞色素P450（cytochrome P450，CYP）3A4的誘導(dǎo)有關(guān)，表明它可能存在不良反應(yīng)和藥物間的相互作用，且其不易合成，光照不穩(wěn)定，對胃腸道有刺激性，這些不良反應(yīng)可能限制使用金絲桃素作為TRPC6激動劑[35]。

3.2 白藜蘆醇

白藜蘆醇存在于葡萄、漿果、花生和其他植物中，是具有抗氧化和免疫調(diào)節(jié)活性的天然化合物之一，被認(rèn)為是TRPC6的間接正調(diào)節(jié)劑。在大鼠腦IRI模型中，白藜蘆醇通過抑制鈣蛋白酶活性，可顯著減小腦梗死面積，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[36-37]。Li等[38]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可通過降低谷胱甘肽過氧化物酶4和鐵蛋白重鏈1的表達(dá)，增強轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1的表達(dá)，減輕氧化應(yīng)激和鐵死亡，減輕心肌IRI。另有研究表明白藜蘆醇和槲皮素聯(lián)合治療可以減輕心臟組織損傷和減小梗死面積，發(fā)揮心臟保護作用[39]。此外白藜蘆醇對腹主動脈瘤破裂IRI模型誘導(dǎo)的肝、肺損傷發(fā)揮保護作用[40-41]，并可通過多種途徑減輕視網(wǎng)膜、脊髓IRI[42-43]。盡管白藜蘆醇通常被認(rèn)為是無毒的治療藥物，但高劑量白藜蘆醇可抑制CYP3A4活性，從而抑制藥物代謝清除，增加藥物的生物利用度和毒性，因而在臨床中應(yīng)避免高劑量使用產(chǎn)生的不利影響[44]。

3.3 哌嗪類衍生物

Sawamura等[45]發(fā)現(xiàn)了一組基于哌嗪類化合物的TRPC3/6/7強效激動劑，在受體操作模式下發(fā)揮作用，對不同的通道亞型具有不同的選擇性。曲美他嗪（trimetazidine）是一種哌嗪類衍生物，作為抗心絞痛藥物已廣泛應(yīng)用于臨床[46]。Chen等[47]發(fā)現(xiàn)曲美他嗪可通過靶向Gasdermin D（GSDMD）抑制焦亡，減輕心肌IRI。另有研究證明曲美他嗪具有抗氧化作用，通過隔離脂質(zhì)過氧化發(fā)生改善腎IRI[48]。沃替西?。╲ortioxetine）是治療抑郁癥的新藥，是小分子哌嗪類硫化物，Emam等[49]首次證實了沃替西汀是一種有效的神經(jīng)保護劑，可通過抑制氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕腦IRI。阿魏酸哌嗪（piperazine ferulate）目前已用于各類伴有鏡下血尿和高凝狀態(tài)的腎小球疾病，以及冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、腦梗死、脈管炎等的輔助治療。Lei等[50]發(fā)現(xiàn)阿魏酸哌嗪可通過抑制NOD樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體活化和焦亡，減輕大鼠心肌IRI。然而哌嗪類衍生物作為大多數(shù)TRPC6激動劑，可與TRPC3和TRPC7發(fā)生交叉反應(yīng)，限制了它們作為特異性TRPC6調(diào)節(jié)劑的使用[45]。

此外幾種內(nèi)源性物質(zhì)如甘油二酯、溶血磷脂酰膽堿和花生四烯酸的代謝物20-羥-二十烷四烯酸已被證實可激活TRPC6，然而它們對IRI的作用及機制仍需進一步研究[35]。TRPC6在結(jié)構(gòu)上與TRPC3和TRPC7相似，因此大多數(shù)化合物不能選擇性地作用于這3種異構(gòu)體中的任何一種，這使得開發(fā)高選擇性和特異性TRPC6新型藥物變得困難。此外，一些TRPC6調(diào)節(jié)劑對其他細(xì)胞靶點具有交叉反應(yīng)性，也限制了它們的應(yīng)用[35]。

4 小結(jié)與展望

綜上所述，TRPC6在機體各個組織器官中均表達(dá)，在維持細(xì)胞正常生物學(xué)功能中發(fā)揮重要作用，以TRPC6為靶點的化合物可能具有作為預(yù)防和治療IRI的新型藥物的臨床潛力。然而TRPC6在人體組織中廣泛分布，應(yīng)用TRPC6的激動劑和拮抗劑可能會帶來一些系統(tǒng)性的不良反應(yīng)。因此，在研究開發(fā)以TRPC6為靶點的新型藥物之前，需要充分考慮上述因素。目前關(guān)于TRPC6在IRI中的研究取得了很大進展，然而有關(guān)TRPC6在IRI中的調(diào)節(jié)作用和確切機制仍有待進一步研究，以實現(xiàn)基礎(chǔ)研究向臨床研究轉(zhuǎn)化，為IRI的靶向治療提供新的思路。