張陽 楊金偉 李興德 馬雪嬌 張函舒 宋滄桑

目前，器官移植是治療終末期疾病的有效手段。雖然近幾年來免疫抑制藥的研發(fā)以及免疫療法的創(chuàng)新使得移植器官存活率得到了一定的提升，但是器官移植術(shù)后所產(chǎn)生的排斥反應(yīng)仍然是導(dǎo)致移植器官功能異常甚至失功的主要因素之一。排斥反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制至今尚未完全清楚，因此，深入研究器官移植排斥反應(yīng)的相關(guān)分子機(jī)制對克服這一難題具有重要意義。

近年來，微小核糖核酸（microRNA，miRNA，miR）因其在細(xì)胞生物學(xué)活動(dòng)中發(fā)揮的調(diào)控作用逐漸成為研究熱點(diǎn)，其異常表達(dá)與人類多種疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，如癌癥、免疫系統(tǒng)疾病等[1-2]。miR-155作為近年來被廣泛研究的miRNA，被發(fā)現(xiàn)具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)功能，因而被器官移植領(lǐng)域所關(guān)注[3]。隨著相關(guān)研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)miR-155表達(dá)水平和功能狀態(tài)可能與排斥反應(yīng)的發(fā)生密切相關(guān)，可能成為克服機(jī)體排斥反應(yīng)的新靶點(diǎn)。因此，本文通過總結(jié)miR-155與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)研究來進(jìn)一步闡述miR-155在器官移植排斥反應(yīng)的作用，進(jìn)而為miRNA作為器官移植的治療靶點(diǎn)提供新的思路。

1 miR-155的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

成熟的miR-155是由大約20 個(gè)堿基所構(gòu)成的單鏈非編碼RNA。參與其編碼的宿主基因?yàn)槲挥谌祟?1號染色體的MIRHG155，該基因最初也被稱為B細(xì)胞非編碼基因簇（B-cell integration cluster，BIC），由3個(gè)外顯子構(gòu)成，在其第3個(gè)外顯子中含有約1 500 bp的初級miR-155轉(zhuǎn)錄本，最終合成成熟的miR-155。成熟的miR-155具有兩種形式即miR-155-5p和miR-155-3p，由于miR-155-5p是主要的生物活性形式，因此大多數(shù)的研究主要集中在miR-155-5p。miR-155轉(zhuǎn)錄本在細(xì)胞核內(nèi)先由RNA聚合酶生成初級miR-155 （pri-miR-155），而后經(jīng)核酸內(nèi)切酶3（Drosha）剪切后形成發(fā)卡樣結(jié)構(gòu)的前體miR-155（pre-miR-155），之后由出核因子Exportin 5將前體miR-155輸出到細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞質(zhì)中前體miR-155進(jìn)一步被另一種核酸內(nèi)切酶Dicer加工成約20個(gè)堿基的雙鏈RNA。其中miR-155-5p整合到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體中，引導(dǎo)沉默復(fù)合體與其靶信使核糖核酸（messenger RNA，mRNA）結(jié)合，miR-155-3p則被降解。

2 miR-155的生物學(xué)特性

miR-155主要以5’端的種子序列（6～8個(gè)堿基）通過不完全的堿基互補(bǔ)配對方式與靶mRNA的3’端非翻譯區(qū)（3’-untranslated region，3’UTR）結(jié)合，從而抑制靶mRNA的蛋白編碼功能或直接導(dǎo)致其降解，即在轉(zhuǎn)錄后翻譯水平抑制靶基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)自身的生物學(xué)特性。由于miR-155功能行使的特殊性，也就決定了其能夠調(diào)控多種基因的表達(dá)，從而調(diào)控體內(nèi)多種生命進(jìn)程如細(xì)胞分化增殖、信號傳導(dǎo)以及免疫應(yīng)答等。

2.1 穩(wěn)定性

有學(xué)者已經(jīng)證實(shí)內(nèi)源性血漿miRNA在血漿樣本中性質(zhì)穩(wěn)定，分別在室溫和凍融循環(huán)的條件下仍能維持活性，對核糖核酸酶具有抗性，這可能是由于miRNA在細(xì)胞內(nèi)合成后通過外泌體、微泡、凋亡小體等多種途徑跨膜運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外，其外膜結(jié)構(gòu)對內(nèi)部的miRNA分子產(chǎn)生了保護(hù)效應(yīng)[4]。

2.2 易于被檢測

在人體多種體液中的miR-155均能夠被定量檢測，其中在移植領(lǐng)域中可采用的檢測樣本包括移植物組織、血漿、尿液以及外周血單核細(xì)胞等[5]。其中血液具有易獲得性、保存方便以及非侵入性等優(yōu)勢，通常作為臨床試驗(yàn)檢測樣本的首選。目前檢測miR-155的方法主要包括逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）、Northern印跡雜交和原位雜交技術(shù)。

3 miR-155對器官移植排斥反應(yīng)的免疫調(diào)控

排斥反應(yīng)是復(fù)雜的免疫現(xiàn)象，機(jī)體的固有免疫應(yīng)答和特異性免疫應(yīng)答協(xié)同參與了移植排斥反應(yīng)。在受者接受移植后，最先引發(fā)的是機(jī)體的固有免疫應(yīng)答，引起供體的炎癥反應(yīng)，因此導(dǎo)致組織損傷，進(jìn)而誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答。miR-155在活化的B細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）中高度表達(dá)[6-8]。同時(shí)，miR-155在人體內(nèi)參與多種免疫調(diào)控路徑，包括炎癥介質(zhì)的調(diào)控、CD4+T細(xì)胞的分化、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）和CD8+T細(xì)胞的功能以及B細(xì)胞的分化和抗體的形成[9]。由此可見，miR-155在免疫細(xì)胞發(fā)育和免疫應(yīng)答中起著關(guān)鍵作用。

3.1 miR-155對固有免疫的調(diào)節(jié)作用

固有免疫是機(jī)體在出生后已擁有的非特異性防御功能，巨噬細(xì)胞是固有免疫中的主要效應(yīng)細(xì)胞，其在器官移植排斥反應(yīng)的啟動(dòng)和效應(yīng)階段中都發(fā)揮著極其關(guān)鍵的作用。巨噬細(xì)胞參加固有免疫應(yīng)答的方式包括吞噬病原體、釋放炎癥因子、輔助其他的免疫細(xì)胞等。miR-155對炎癥的發(fā)展具有促進(jìn)作用，有研究報(bào)道，Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）作為固有免疫系統(tǒng)受體之一, 在啟動(dòng)細(xì)胞固有免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要的作用，miR-155能夠激活TLR家族成員，如TLR4的活性[10]，從而發(fā)揮促進(jìn)炎癥發(fā)展的作用，并且已經(jīng)有研究證實(shí)敲除巨噬細(xì)胞的miR-155能夠誘導(dǎo)其對TLR相關(guān)配體低反應(yīng)性的產(chǎn)生[11]。另一方面，miR-155能夠抑制細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制蛋白 1（suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1）、SH2肌醇聚磷酸酯-5-磷酸酶（SH2-containing inositol polyphosphate 5-phosphatase，SHIP1）等負(fù)調(diào)控因子的表達(dá)而發(fā)揮調(diào)控炎癥發(fā)展的作用[12-14]。另外，miR-155能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞抗原提呈作用，Li等[15]通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-155能夠通過抑制SOCS1的表達(dá)，增強(qiáng)枯否細(xì)胞的抗原提呈作用，增加主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）Ⅱ和共刺激分子的表達(dá)，并通過Janus激酶（Janus kinase，JAK）/信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）信號通路誘導(dǎo)促炎的輔助性T細(xì)胞（helper T cell，Th）1相關(guān)細(xì)胞因子干擾素（interferon，IFN）-γ的表達(dá)。有研究表明miR-155能夠調(diào)控巨噬細(xì)胞M2極化，而M2型巨噬細(xì)胞在誘導(dǎo)器官移植術(shù)后免疫耐受中具有重要作用。Teng等[16]發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)傳遞anti-miR-155能夠?qū)⒕奘杉?xì)胞極化為M2表型，并抑制炎癥的發(fā)生。Li等[17]也同樣發(fā)現(xiàn)敲除miR-155能夠誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)增高，一氧化氮合酶（M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物）表達(dá)降低。

DC是固有免疫和特異性免疫的橋梁細(xì)胞，能攝取、加工、提呈抗原，啟動(dòng)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。有研究表明在人源單核細(xì)胞來源的DC成熟過程中，miR-155水平顯著提高，下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子脾病灶形成病毒整合位點(diǎn)原癌基因（spleen focus forming virus proviral integration oncogene 1，SPI1）（PU.1）的表達(dá)并減少DC細(xì)胞表面2型跨膜凝集素受體的水平[18]。Van Aelst等[19]通過對小鼠心臟移植模型進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，miR-155對SPI1具有抑制作用，可能通過抑制SPI1的RNA翻譯過程從而促進(jìn)DC向T細(xì)胞提呈抗原，并促進(jìn)白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6的信號傳導(dǎo)。miR-155可直接控制重要的信號傳導(dǎo)分子轉(zhuǎn)化生長因子-β-活化激酶 1 結(jié)合蛋白 2（transforming growth factor-β-activated kinase 1-binding protein 2，TAB2）的水平。有研究證明，在成熟的人類DC中，miR-155靶向TAB2 的3’UTR，因此可能在DC激活的晚期對TLR/IL-1信號通路施加負(fù)反饋控制，從而抑制了 IL-1β的產(chǎn)生以及DC的自分泌功能[20]。

3.2 miR-155對特異性免疫的調(diào)節(jié)作用

T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫在整個(gè)排斥反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，急性排斥反應(yīng)與T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫效應(yīng)密切相關(guān)。CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞所介導(dǎo)的排斥反應(yīng)是T細(xì)胞參與的器官移植排斥反應(yīng)的主要類型。CD4+T細(xì)胞參與器官移植排斥反應(yīng)的細(xì)胞亞群主要包含Th1、Th2、Th17和Treg 4種，目前大部分關(guān)于器官移植的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究主要發(fā)現(xiàn)miR-155表達(dá)影響T細(xì)胞分化的亞型主要為Th1、Th17。Zhang等[21]發(fā)現(xiàn)，在miR-155敲除小鼠的慢性排斥反應(yīng)模型中IFN-γ、IL-17A和Foxp3表達(dá)水平降低，Th1、Th17表現(xiàn)出低活性。同時(shí)該研究還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，對CD4+T細(xì)胞進(jìn)行miR-155敲除后，導(dǎo)致Th17極化特征的缺失，miR-155通過抑制Th17的SOCS1和轉(zhuǎn)錄因子c-Maf表達(dá)，從而調(diào)控Th17的分化[21]。CD8+T細(xì)胞也稱為細(xì)胞毒T細(xì)胞，在器官移植排斥反應(yīng)中其活化后介導(dǎo)的移植物損害也日益成為器官移植領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠的移植物抗宿主反應(yīng)中miR-155敲除后導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞的增殖活性減弱[22]。但由于目前對于器官移植排斥反應(yīng)中miR-155與CD8+T細(xì)胞相關(guān)調(diào)控機(jī)制的研究仍比較缺乏，尚需更多實(shí)驗(yàn)予以驗(yàn)證。

恒定自然殺傷T細(xì)胞（invariant natural killer T cell，iNKT）是T細(xì)胞的一個(gè)獨(dú)特亞群，同時(shí)具備自然殺傷細(xì)胞和T細(xì)胞特征。在特異性免疫中，由于其具有相對恒定的T細(xì)胞抗原受體（T cell receptor，TCR），因此其在外來抗原的刺激下活化后能夠產(chǎn)生大量的Th1和Th2相關(guān)的細(xì)胞因子，從而調(diào)控Th1/Th2分化以及調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞的功能。近來研究發(fā)現(xiàn)，miR-155作為一個(gè)關(guān)鍵的表觀遺傳調(diào)節(jié)因子，可協(xié)調(diào)多種信號通路和轉(zhuǎn)錄程序，精確調(diào)節(jié)iNKT發(fā)育和功能譜系，上調(diào)miR-155會(huì)導(dǎo)致iNKT發(fā)育中斷[23]。

Treg在控制免疫反應(yīng)和介導(dǎo)免疫耐受中具有非常重要的作用。miR-155對Treg的功能具有調(diào)節(jié)作用。有研究報(bào)道，通過抑制miR-155和蛋白prenylation所構(gòu)成的反饋環(huán)從而調(diào)節(jié)Th17和Treg之間的平衡能夠減輕急性移植物抗宿主病[6]。研究表明miR-155對Treg具有調(diào)控作用，小鼠心臟移植后注射間充質(zhì)干細(xì)胞可以逆轉(zhuǎn)miR-155表達(dá)的增高，從而導(dǎo)致Th1/Th2平衡改變和Treg表達(dá)上調(diào)[24]，表明miR-155極有可能參與了對Treg分化的調(diào)控從而介導(dǎo)排斥反應(yīng)的發(fā)生。

B細(xì)胞作為體液免疫中最為重要的淋巴細(xì)胞，同樣也在器官移植排斥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。先前的研究報(bào)道，miR-155在B細(xì)胞活化時(shí)通過作用于PU.1，使得轉(zhuǎn)錄因子Pax5表達(dá)下調(diào)，從而使得漿細(xì)胞形成受到抑制[25]。Arbore 等[9]進(jìn)一步證實(shí)了miR-155可以通過調(diào)節(jié)B細(xì)胞、漿母細(xì)胞的存活和增殖，從而控制抗體的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)抗體轉(zhuǎn)化，進(jìn)而控制濾泡外免疫反應(yīng)的程度。另外miR-155可能通過影響SHIP、活化誘導(dǎo)型胞嘧啶脫氨酶（activation-induced cytidine decminase，AID）等靶點(diǎn)來介導(dǎo)B細(xì)胞的增殖與活性[26-27]，其具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究來闡明。

4 miR-155在器官移植排斥反應(yīng)中的應(yīng)用前景

移植物活組織檢查（活檢）一直作為臨床診斷移植排斥反應(yīng)的金標(biāo)準(zhǔn)，但其作為一種侵入性的診斷方法存在手術(shù)意外風(fēng)險(xiǎn)高、可重復(fù)性差和抽樣誤差等問題，并不適用于實(shí)時(shí)監(jiān)測早期移植排斥反應(yīng)的發(fā)生。而miR-155具有穩(wěn)定性、易于被檢測的特性以及免疫特性決定了其作為移植排斥反應(yīng)潛在的生物標(biāo)志物的可能。許多研究都認(rèn)為miR-155對于診斷及預(yù)測移植術(shù)后排斥反應(yīng)發(fā)生均具有較高的特異度和靈敏度[28-31]。在近5年的臨床研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miR-155在腎、肝、心臟和肺移植等不同器官移植受者中，其表達(dá)水平與移植排斥反應(yīng)的發(fā)生有著緊密的聯(lián)系[28-29,30-35]。Soltaninejad等[36]通過對腎移植排斥反應(yīng)與非排斥反應(yīng)患者的移植物活檢樣本以及外周血單核細(xì)胞的miR-155表達(dá)水平進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，排斥反應(yīng)患者活檢樣本的miR-155表達(dá)水平均較非排斥反應(yīng)患者升高，同時(shí)該研究的受試者工作特征曲線分析也表明，通過利用移植物活檢樣本中的miR-155表達(dá)水平可以預(yù)測排斥反應(yīng)的發(fā)生。有研究對可能介導(dǎo)排斥反應(yīng)的器官特異性和跨器官生物標(biāo)志物進(jìn)行了系統(tǒng)評價(jià)，表明在移植受者的排斥反應(yīng)中，miR-155是表達(dá)增加的生物標(biāo)志物[37]。miR-155作為一種非侵入性的生物標(biāo)志物對于器官移植排斥反應(yīng)的診斷相關(guān)研究意義重大。

雖然已知循環(huán)體液中的miRNA有望成為器官移植排斥反應(yīng)中的新型生物標(biāo)志物，但在臨床中的應(yīng)用仍然具有不確定性。首先，目前多數(shù)研究都是基于小規(guī)模樣本以及病例對照研究設(shè)計(jì)，缺乏大規(guī)模的臨床實(shí)踐；其次，雖然miRNA的提取以及定量技術(shù)目前已經(jīng)很便利，但是目前提取、定量等相關(guān)的實(shí)驗(yàn)方法和內(nèi)參基因均未制定統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，因而使得不同機(jī)構(gòu)的檢測結(jié)果不具備可比性，因此雖然miR-155具有非常高的應(yīng)用潛力，但目前還不能將其視為馬上能應(yīng)用于器官移植排斥反應(yīng)的診斷工具，而且即使在臨床診斷時(shí)，還需要多種特異性的miRNA聯(lián)合應(yīng)用以提高靈敏度和特異度。

5 小結(jié)與展望

綜上所述，miR-155在器官移植排斥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展中扮演了極其重要的角色。miR-155作為一個(gè)參與先天性免疫和獲得性免疫的重要miRNA分子，其在器官移植術(shù)后介導(dǎo)免疫細(xì)胞分化、相關(guān)細(xì)胞因子的調(diào)控等作用已經(jīng)被越來越多的研究所證實(shí)。隨著對miR-155在器官移植排斥反應(yīng)中的作用研究逐步深入，其參與器官移植排斥反應(yīng)的免疫調(diào)控機(jī)制將逐步闡明，相信在不久的將來miR-155有望成為用于臨床診斷排斥反應(yīng)和藥物治療的新靶點(diǎn)，為新型免疫抑制藥開發(fā)和排斥反應(yīng)治療提供新思路。