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3個茶樹品種WOX基因家族的進化及密碼子偏好性比較

2022-11-30 01:02王占軍吳子琦王朝霞歐祖蘭蔡倩文徐忠東張照亮
關(guān)鍵詞:密碼子擬南芥茶樹

王占軍,吳子琦,王朝霞,歐祖蘭,李 杰,蔡倩文,徐忠東,張照亮

(1.合肥師范學院生命科學學院,安徽 合肥 230601;2.安徽農(nóng)業(yè)大學茶樹生物學與資源利用國家重點實驗室,安徽 合肥 230036)

隨著近年來測序技術(shù)飛速發(fā)展,茶樹(Camelliasinensis)‘云抗10號’(Camelliasinensisvar.assamicacv.Yunkang 10,簡稱CSA)[1]、‘舒茶早’(Camelliasinensisvar.sinensiscv.Shuchazao,簡稱CSS)[2]和‘云南野生古茶DASZ’(云南省發(fā)現(xiàn)的野生茶樹地方品種,簡稱DASZ)[3]等品種的高質(zhì)量全基因組相繼公開,為茶樹研究提供了大量基因信息,然而,這些基因卻因缺少茶樹轉(zhuǎn)基因體系、難以通過生物技術(shù)育種改良茶樹品質(zhì)[4]。組織培養(yǎng)是植物轉(zhuǎn)基因中常用的技術(shù),但是,茶樹組培體系卻受限于“有限的品種”“經(jīng)驗式的探索”和“體系不穩(wěn)定”等諸多因素,極大地制約了優(yōu)良品質(zhì)或遺傳背景清晰的茶樹品種組培體系的建立,進而限制了通過組培體系構(gòu)建茶樹轉(zhuǎn)基因體系的研究。

WUSCHEL-related homeobox(WOX)蛋白是一類調(diào)控植物生長發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄因子,包括WUS和WOX 1~14共15個成員[5-6];其中,WUS基因是模式植物愈傷組織向不定芽分化的關(guān)鍵驅(qū)動器,增加WUS基因的表達量能有效促進擬南芥愈傷組織分化為不定芽[7];而WUS缺失突變體即使被置于不定芽誘導培養(yǎng)基中,也無法實現(xiàn)其愈傷組織向不定芽分化,WOX5和WOX11也參與模式植物組培過程中不定芽分化的調(diào)控[8]。值得關(guān)注的是,茶樹組培是否存在模式植物WOX基因的調(diào)控機制,能否通過茶樹WOX基因調(diào)控目標茶樹品種的組培,進而實現(xiàn)構(gòu)建茶樹轉(zhuǎn)基因體系的理想目標。然而,關(guān)于茶樹WOX基因的研究,僅有‘舒茶早’全基因組中鑒定WOX基因家族并揭示其適應(yīng)環(huán)境的表達特征[9],其基因功能研究仍進展緩慢。

密碼子中,編碼同一氨基酸的不同密碼子互稱同義密碼子;同義密碼子編碼同種蛋白質(zhì)時使用頻率不同的現(xiàn)象即密碼子使用偏好性[10]。轉(zhuǎn)基因時,如外源基因的密碼子與受體基因組的密碼子偏好性不同,會誘發(fā)甲基化造成所轉(zhuǎn)基因沉默或表達量低[11],因此,針對目標基因的偏好性分析及其為適應(yīng)宿主密碼子偏好性的優(yōu)化與改造,成為轉(zhuǎn)基因研究的重要前提[12]。茶樹密碼子偏好性研究多集中于CsICE1[13]、CsCBF1[14]和CsSAD[15]等單基因,而茶樹基因家族的密碼子偏好性研究卻鮮見報道。本研究基于上述3個茶樹品種全基因組數(shù)據(jù),運用生物信息學方法鑒定3個茶樹品種的WOX基因家族序列,對它們進行系統(tǒng)發(fā)育分析與密碼子的使用模式、使用頻率及偏好性變異來源比較研究,以期為利用茶樹WOX基因構(gòu)建茶樹轉(zhuǎn)基因體系提供重要參考信息。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

從茶樹基因組數(shù)據(jù)庫(www.plantkingdomgdb.com/tea_tree/)、TPIA數(shù)據(jù)庫(http://pcsb.ahau.edu.cn:8080/CSS/)和Figshare數(shù)據(jù)庫(https://figshare.com/search?q=DASZ)分別獲得‘云抗10號’(CSA)[2]、‘舒茶早’(CSS)[3]和‘云南野生古茶樹DASZ’(DASZ)[4]的CDS及氨基酸序列。

1.2 茶樹WOX基因成員鑒定及生信分析方法

下載Homeodomain(PF00046)的隱馬爾科夫模型[16],使用HMMER3.0軟件對3個茶樹品種的氨基酸序列進行檢索(E值<1×10-10)[17]。從TAIR數(shù)據(jù)庫下載擬南芥WOX基因的氨基酸序列;以擬南芥WOX蛋白為源序列,分別在3個茶樹品種數(shù)據(jù)庫中進行BLASTP檢索(E值<1×10-10)[17]。刪除上述方法收集的冗余序列,使用CDD、SMART和Pfam驗證候選序列結(jié)構(gòu)域的完整性,最終獲得目標序列。運用ExPASy鑒定序列理化性質(zhì)[18];利用Cell-PLoc 2.0進行亞細胞定位預測[19]。運用ClustalX 2.1比對3個茶樹品種及擬南芥WOX蛋白全長序列,基于比對結(jié)果使用MEGA X軟件以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(P-distance模式,Bootstrap檢驗1 000次)。綜合進化分析和BLASTP比對結(jié)果命名3個茶樹品種的WOX基因成員。

1.3 密碼子偏好性比較分析方法

1.3.1 堿基組成分析

使用TBtools工具分別從上述茶樹數(shù)據(jù)庫中提取茶樹WOX基因ID號對應(yīng)的CDS序列;利用Perl語言編寫的腳本計算CDS序列密碼子的GC1(表示同義密碼子中第一下標數(shù)字位的相應(yīng)堿基含量。下同。)、GC2和GC3含量及3個位置的平均GC含量。

1.3.2 同義密碼子相對使用度(RSCU)和同義密碼子相對使用頻率(RFSC)計算

同義密碼子相對使用度(relative synonymous codon usage,RSCU)是指某一密碼子的實際使用頻率與無偏好影響下預期使用頻率的比值,它能直接反映密碼子的偏好性程度。由CodonW 1.4.2程序分析獲得RSCU值(URSCU),若URSCU>1,則實際使用頻率高于其他同義密碼子;若URSCU=1,則實際使用頻率與其他同義密碼子相等[20]。同義密碼子相對使用頻率(relative frequency of synonymous codon,RFSC)是某一密碼子與該密碼子對應(yīng)的氨基酸在樣本中的實際觀察值的比值。用CodonW 1.4.2程序計算RFSC值(fRFSC),當某密碼子fRFSC大于同義密碼子平均使用頻率的1.5倍或60%時,表明該密碼子偏好性較強、視為高頻密碼子[21]。

1.3.3 密碼子使用頻率比較

密碼子使用頻率是指某密碼子使用個數(shù)占該生物編碼序列總密碼子個數(shù)的千分比[22]。將3個茶樹品種WOX基因分別與CSA、CSS和4種模式植物[擬南芥(Arabidopsisthaliana)、煙草(Nicotianatabacum)、毛果楊(Populustrichocarpa)、水稻(Oryzasativa)]基因組進行密碼子使用頻率比較,探究密碼子使用是否有差異;當使用頻率比值介于0.5~2.0時,說明兩者的密碼子偏好性相似度較高,宜選為基因表達受體;反之,不宜選為基因表達受體[23]。

1.3.4 密碼子使用模式影響因素分析

有效密碼子數(shù)(effective number of codons,ENc)是某密碼子與其同義密碼子平均使用頻率間的差異,其值越低密碼子使用偏好越強[24],GC3s表示同義密碼子中第3位的G+C含量。ENc-GC3s圖以GC3s和ENc值為橫縱坐標,分析堿基組成與密碼子偏好性的關(guān)系。當突變壓是影響密碼子使用模式主因時,ENc值位于或圍繞預期曲線位置;反之,若自然選擇等因素決定密碼子使用模式,ENc值則遠離預期曲線。

奇偶偏好性分析(parity rule 2 plot,PR2-plot)是以G3/(G3+C3)和A3/(A3+T3)作橫縱坐標繪制散點圖,G/(G+C)表示PR2偏好類型中GC-偏倚的值,A/(A+T)表示AT-偏倚的值,圖的中心代表序列內(nèi)核苷酸組成跟隨PR2的點,與中心的距離和方向代表PR2偏差的程度與方向,離中心越遠偏倚程度越強[25]。根據(jù)A、T、G、C在圖中的占比,推測堿基突變在堿基變異中的影響程度。若密碼子使用僅受突變壓影響,理論上密碼子第3位堿基A/T和G/C的使用頻率相等;否則,密碼子偏好受自然選擇及其他因素影響。

由此可見,概念分析法可幫助譯者準確理解法律術(shù)語原語的含義,而比較法則可用于檢驗?zāi)繕苏Z譯文含義是否與源語含義一致。若采用貼近適用者的法律術(shù)語翻譯策略,譯者應(yīng)特別注意在翻譯時除遵循內(nèi)涵對等的原則外,更應(yīng)注意外延含義的對等。

中性分析(neutrality plot)能定量分析突變壓和自然選擇等其他因素對密碼子偏好的影響程度[26]。以GC12值(GC1和GC2的平均值)為縱坐標,以GC3為橫坐標制作散點圖,每個點代表了特定物種的每個WOX基因,繪制回歸曲線。回歸方程的斜率表示突變壓影響密碼子使用偏好的程度?;貧w曲線斜率為0時,表明GC12與GC3之間變異差異大,密碼子偏好完全受自然選擇影響;斜率為1時,說明GC12與GC3變異差異相似,突變壓為影響密碼子偏好的主因,自然選擇的影響力缺失或很弱;且曲線斜率越靠近0或1,密碼子偏好性的影響因素越靠近自然選擇或突變壓。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹WOX基因家族鑒定及進化分析

2.1.1 基因成員鑒定與序列分析

本研究最終從CSA、CSS和DASZ中分別鑒定出11、18、13個WOX成員,共計42個WOX成員。理化性質(zhì)分析和亞細胞定位結(jié)果詳見表1,蛋白質(zhì)氨基酸長度在118~916之間,最長和最短蛋白都屬于DASZ;預測等電點介于5.09~9.94,蛋白分子質(zhì)量在13 333.89~102 942.02 ku之間;所有茶樹WOX蛋白不穩(wěn)定系數(shù)均大于40,屬于不穩(wěn)定蛋白;3個茶樹品種的42個WOX蛋白親水性指數(shù)均為負數(shù),表明它們皆是親水性蛋白;脂溶性系數(shù)均高于40,表示它們均屬于熱穩(wěn)定蛋白。亞細胞定位結(jié)果顯示,42個WOX蛋白均位于細胞核內(nèi)。這與Chang等[27]揭示的12個核桃WOX蛋白亞細胞定位結(jié)果一致。

表1 3個茶樹品種WOX基因家族信息Table 1 The information of WOX gene families in three Camellia sinensis cultivars

2.1.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

擬南芥、CSA、CSS、DASZ的WOX蛋白的系統(tǒng)進化樹見圖1。按照Graaff等[28]分類規(guī)則,3個茶樹品種的42個WOX蛋白可分為現(xiàn)代進化支(WUS clade)、古老進化支(ancient clade)和中間進化支(intermediate clade),該分類結(jié)果與擬南芥WOX蛋白進化研究結(jié)果相似[29]?,F(xiàn)代進化支包括24個茶樹WOX成員,其中CSA有7個,由擬南芥WOX蛋白的進化關(guān)系將其分為5個亞類,分別命名為CsaWUS、CsaWOX1、CsaWOX3、CsaWOX4、CsaWOX5;CSS包含10個,也分為5個亞類,分別命名為CssWUS、CssWOX1、CssWOX2、CssWOX3、CssWOX4;DASZ包含7個,可分為4個亞類,分別命名為DaszWOX1、DaszWOX2、DaszWOX4、DaszWOX5。中間進化支包含13個茶樹WOX成員,其中CSA有4個,CSS有5個,DASZ有4個,均可分為WOX8、WOX9和WOX11這3個亞類。古老進化支含5個茶樹WOX成員,CSS有3個,DASZ有2個,都屬于WOX13亞類。由圖1可知,同一進化支內(nèi)CSA與DASZ的親緣關(guān)系較近。

圖1 擬南芥與3個茶樹品種WOX基因的進化分析Fig.1 Phylogenetic analyses of WOX gene families in Arabidopsis thaliana and three Camellia sinensiscultivars

2.2 3個茶樹品種密碼子偏好性分析

2.2.1 堿基組成

表2 3個茶樹品種WOX基因CDS序列的GC值Table 2 GC values of WOX gene families in three Camellia sinensis cultivars 單位:%

2.2.2 RSCU和RFSC結(jié)果分析與密碼子使用頻率比較

從3個茶樹品種WOX基因密碼子的URSCU與fRFSC(表3)可知,CSA、CSS、DASZ的WOX基因中URSCU>1的密碼子分別有30、32、29個,其中密碼子以A/T結(jié)尾的分別有22、23、24個,占偏好密碼子總數(shù)的73.33%、71.88%、82.76%;3者共有的偏好密碼子有25個,其中A/T結(jié)尾的密碼子共20個。分析高頻密碼子發(fā)現(xiàn),CSA中高頻密碼子有7個(TTG、GTT、CCT、CCA、AAG、AGA、AGG),其中A/T 結(jié)尾的有4個(GTT、CCT、CCA、AGA);CSS和DASZ各有10個高頻密碼子(TTG、GTG、CCT、CCA、TAA、CAC、CAA、AAG、AGA、AGG;TTG、GTT、TCT、CCT、CCA、ACT、GCT、AAG、AGA、AGG),A/T結(jié)尾的分別有5個(CCT、CCA、TAA、CAA、AGA)和7個(GTT、TCT、CCT、CCA、ACT、GCT、AGA)。3個茶樹品種的高頻密碼子中A/T結(jié)尾密碼子占比均≥50%;它們共有A/T結(jié)尾高頻密碼子3個(CCT、CCA和AGA),CSA與DASZ共有高頻密碼子7個(TTG、GTT、CCT、CCA、AAG、AGA、AGG)。在高頻密碼子使用模式上,CSA與DASZ相似度較高。綜上所述,盡管3個茶樹品種在密碼子使用模式上有一定差異,但均偏好使用A/T結(jié)尾的密碼子。

3個茶樹品種WOX基因與6種植物間密碼子使用頻率比較結(jié)果(表4)可知,其中,CsaWOX與CSA和CSS的全基因組密碼子相比均存在1個差異密碼子(皆為編碼Ala的GCG);CssWOX與CSA有1個差異密碼子(編碼TER的TAG),但與CSS存在1個差異密碼子(編碼TER的TAA),結(jié)合表3發(fā)現(xiàn),TAA是CssWOX的高頻密碼子,因此對目標基因的表達效率影響大;DaszWOX與CSA和CSS比較均在編碼TER的TAG密碼子上存在明顯差異;結(jié)果表明3個茶樹品種WOX基因在選擇CSA和CSS為轉(zhuǎn)基因受體材料時,個別密碼子需優(yōu)化處理。

表3 3個茶樹品種WOX基因密碼子的URSCU和fRFSCTable 3 URSCU and fRFSC of codons of WOX gene families in three Camellia sinensis cultivars

3個茶樹品種WOX基因與擬南芥密碼子使用頻率相比,比值≤0.5或≥2.0分別有7、4和2個;與煙草相比,密碼子使用模式差異較大的分別有4、2和2個;與毛果楊相比,3個茶樹品種均有6個密碼子與其使用模式差異大。與水稻相比,密碼子使用模式差異較大分別有13、12和12個。由此可知,4種模式植物中,煙草與3個茶樹品種的密碼子使用頻率比較的差異最小,水稻的差異最大。3個茶樹品種WOX基因與毛果楊比較,編碼Leu的CTA、CTG,編碼Pro的CCC和編碼TER的TAA都是差異較大的密碼子。在與水稻的比較中,編碼Leu的CTG,編碼Val的GTC,編碼Pro的CCG,編碼Thr的ACT、ACG,編碼Ala的GCC、GCG和編碼Gln的CAA均為差異較大的密碼子。綜上,煙草是3個茶樹品種WOX基因的最佳異源表達受體,水稻最不適宜作為其基因異源表達受體。

表4 3個茶樹品種WOX基因與6種植物的密碼子使用頻率比較Table 4 A comparison of codon usage frequency between WOX gene families in three C. sinensis cultivars and six plants

表4(續(xù))

A.擬南芥Arabidopsisthaliana;N.煙草Nicotianatabacum;P.毛果楊Populustrichocarpa;O.水稻Oryzasativa。

A-C.ENc-GC3s圖;D-F.PR2-plot作圖;G-I.中性分析圖 neutrality plot。圖2 3個茶樹品種WOX基因密碼子變異來源分析圖Fig.2 An analysis of the source of codon variations in WOX gene families in three Camellia sinensis cultivars

2.2.3 密碼子變異來源分析

用ENc和GC3s相關(guān)性圖探究影響密碼子使用偏好的主要因素,其中標準曲線反映了無選擇壓力時二者關(guān)系(圖2)。由圖2A-2C可知,3個茶樹品種WOX基因的ENc-GC3s圖較相似,其中,CSS與DASZ的基因分布情況最相似,均多位于預期曲線下,而CSA中有2個基因落點高于預期曲線,其余9個基因落在曲線下。故3個茶樹品種的大部分基因位于預期曲線下。表明影響3個茶樹品種密碼子使用偏好模式的主因是自然選擇等其他因素,堿基突變壓對密碼子使用偏好存在一定影響,但影響力遠小于自然選擇等其他因素。

PR2偏倚分析通過探究密碼子第3位上A/T與G/C之間的使用情況來確定影響密碼子使用偏好模式的主因。觀察圖2D-2F發(fā)現(xiàn),DASZ中多數(shù)基因分布于右下區(qū)域,說明在DASZ的CDS序列第3位密碼子上T的使用頻率高于A,G的使用頻率高于C;CSS和CSA中大部分基因分布在左下,表明它們密碼子第3位上T的使用頻率高于A,C的使用頻率高于G。由此可見,3個茶樹品種A/T和G/C在密碼子第3位上的使用頻率存在差異,說明其密碼子偏好性不僅受堿基突變壓的影響,還受自然選擇和其他因素影響。

GC12和GC3的中性分析可定量評估突變壓和自然選擇對密碼子使用模式的影響程度(圖2G-2I)。3個茶樹品種WOX基因中性分析回歸直線的斜率分別為0.065 6、0.013 7和-0.029 1,表明堿基突變壓占3個茶樹品種密碼子使用模式6.56%、1.37%和2.91%,自然選擇等因素分別占93.44%、98.63%和97.09%;表示自然選擇等其他因素在3個茶樹品種密碼子使用偏好模式中占主導作用,而堿基突變壓對密碼子使用偏好的影響較小,這與ENc-GC3s和PR2-plot分析結(jié)果高度一致。

3 討 論

本研究利用生物信息學方法在3個茶樹品種中共鑒定出42個WOX基因成員(CSA11個,CSS18個,DASZ13個);其中CSS中鑒定結(jié)果與Wang等[9]研究結(jié)果一致。系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)3個茶樹品種WOX基因可分為3個大支,且每個大支都包含3個茶樹品種WOX成員,表明WOX家族在進化過程中保守性較強;現(xiàn)代進化支包括WUS和WOX1-5,中間進化支包含WOX8、WOX9、WOX11,古老進化支只存在WOX13一個亞類。研究結(jié)果與毛白楊(Populustomentosa)[30]和番茄(Solanumlycopersicum)[31]的進化結(jié)果相似。但是,并未在3個茶樹品種中發(fā)現(xiàn)WOX6、WOX10、WOX12和WOX14這4個亞家族,說明茶樹與擬南芥的WOX基因在進化過程中存在差異。

盡管3個茶樹品種在品種上存在差異,但研究結(jié)果表明它們的密碼子使用模式相似性極高,即均存在密碼子使用偏倚。堿基組成分析結(jié)果顯示3個茶樹品種WOX基因的GC含量均低于A/T含量,且都偏好A/T結(jié)尾。這與茶樹CsICE1[13]、CsCBF1[14]、CsSAD[15]3個單基因的密碼子偏好性和兩種茶樹全基因組[32](CSA和CSS)的密碼子使用偏好研究結(jié)果均一致;Wang等[33]對3種麻瘋樹全基因組的密碼子使用偏好分析也出現(xiàn)類似結(jié)果。從系統(tǒng)進化、GC含量和高頻密碼子使用模式的角度分析,3個茶樹品種中CSA與DASZ的相似度較高,推測它們的親緣關(guān)系更近。此外,在密碼子變異來源研究中,PR2-plot分析結(jié)果表明3個茶樹品種WOX基因密碼子偏好性不僅受堿基突變壓影響,還受自然選擇和其他因素共同影響,且在蘋果(Maluspumila)的奇偶偏好性分析中也出現(xiàn)相似結(jié)果[34];ENc-GC3s繪圖定性分析了影響3個茶樹品種WOX基因密碼子使用偏好模式的主要因素,即自然選擇等其他因素,堿基突變壓對密碼子使用偏好影響力小于自然選擇等其他因素,Song等[35]對蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)研究也有類似觀點;中性繪圖定量分析結(jié)果顯示自然選擇等其他因素在3個茶樹品種WOX基因密碼子使用偏好模式中占主導作用,這與油棕(Elaeisguineensis)的中性分析結(jié)果[36]吻合。密碼子變異來源分析結(jié)果表明,多種因素影響3個茶樹品種WOX基因的密碼子使用偏好模式,其中自然選擇等其他因素起決定作用。同時,3個茶樹品種WOX基因與CSA、CSS及4種模式生物的密碼子使用頻率比較發(fā)現(xiàn),3個茶樹品種WOX基因轉(zhuǎn)CSA和CSS時個別密碼子需優(yōu)化,煙草與3個茶樹品種的密碼子使用頻率比較的差異最小,即煙草是3個茶樹品種WOX基因的最佳異源表達受體。而在煙草WOX基因中,NtWOX5在根尖和根特異性表達,對維持干細胞的穩(wěn)定性起著重要作用,NtWOX3基因在根和幼嫩葉片中表達量較高[37]。

茶樹在我國具有重要的經(jīng)濟價值,本研究鑒定出3個茶樹品種WOX基因成員,發(fā)現(xiàn)3個茶樹品種WOX在進化過程中存在較強保守性,揭示茶樹WOX基因密碼子的使用特征,借此可提高某些外源基因在茶樹中的表達效率,并探究了它們的密碼子偏好模式及其影響因素。研究結(jié)果為利用茶樹WOX基因構(gòu)建茶樹轉(zhuǎn)基因體系提供重要參考信息,以期利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對茶樹中特殊重要性狀基因進行分子實驗,從而對茶樹的遺傳改良實施更深入的研究。

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