趙靜溶，徐友強(qiáng)，朱華，李微微，陳曦，王紅安，李秀婷*

（1.北京工商大學(xué) 食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100048；2.北京工商大學(xué) 食品與健康學(xué)院，北京 100048；3.北京華都釀酒食品有限責(zé)任公司，北京 102212）

白酒是世界著名的六大蒸餾酒之一，也是中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品的重要組成部分[1]。白酒分為12種香型，其中濃香型白酒占白酒市場份額的70%以上，窖香濃郁、香味協(xié)調(diào)，是傳統(tǒng)發(fā)酵白酒的典型代表[2]。濃香型白酒生產(chǎn)過程中很多環(huán)節(jié)仍延續(xù)粗放的經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｊ剑勗煨实颓也煌萎a(chǎn)品穩(wěn)定性差，限制了濃香型白酒品質(zhì)的提升，其內(nèi)在科學(xué)實(shí)質(zhì)是傳統(tǒng)釀造工藝過程中核心功能微生物以及風(fēng)味物質(zhì)形成機(jī)制不明晰。研究表明，濃香型白酒中酯類物質(zhì)是重要的風(fēng)味成分，其中以己酸乙酯為代表的小分子脂肪酸乙酯是濃香型白酒的關(guān)鍵風(fēng)味化合物[1]。大量研究證實(shí)，白酒釀造過程中微生物源酯合成酶催化酸醇酯化反應(yīng)生成酯類物質(zhì)是濃香型白酒乙酯合成主要途徑[1]，由此可知，厘清釀造過程中脂肪酸乙酯的合成與產(chǎn)酯微生物及酯合成相關(guān)酶類之間的相互關(guān)系，闡明其有效合成的內(nèi)在規(guī)律，可在一定程度上解析濃香型白酒風(fēng)味品質(zhì)改善的根本原因。作者擬從濃香型白酒中乙酯類風(fēng)味物質(zhì)的種類、含量以及香氣貢獻(xiàn)度、產(chǎn)酯微生物、微生物源酯合成酶、酯合成酶結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制以及其分子改造進(jìn)行綜合分析，以期為解析濃香型白酒風(fēng)味乙酯化合物有效合成規(guī)律進(jìn)而提升產(chǎn)品品質(zhì)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)與科學(xué)參考。

1 濃香型白酒風(fēng)味乙酯種類、含量、香氣貢獻(xiàn)度

1.1 濃香型白酒風(fēng)味乙酯種類

濃香型白酒乙酯類物質(zhì)豐富多樣，賦予其水果香、花香以及甜味等香氣[3]。到目前為止，共發(fā)現(xiàn)風(fēng)味乙酯114種（見表1），其中直鏈乙酯有18種，支鏈乙酯有10種，不飽和乙酯有26種，羥基乙酯有11種，羰基乙酯有18種，二乙酯有9種，環(huán)乙酯有3種，芳香乙酯有19種。雖然乙酯種類多樣，但并非所有的乙酯對(duì)濃香型白酒的風(fēng)味都至關(guān)重要，還需根據(jù)其含量和香氣貢獻(xiàn)度鑒定其對(duì)風(fēng)味的重要性。

表1 濃香型白酒風(fēng)味乙酯化合物種類Table 1 Types of ethyl ester flavor substances in strong-flavor Baijiu

續(xù)表1

1.2 濃香型白酒風(fēng)味乙酯質(zhì)量濃度

濃香型白酒中乙酯物質(zhì)含量的差異是濃香型白酒區(qū)別于其他香型白酒，形成獨(dú)特風(fēng)格品質(zhì)的一個(gè)重要原因。白酒中的乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯和乳酸乙酯4種乙酯對(duì)白酒的風(fēng)味具有重要作用，是白酒中的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)[19]。濃香型白酒中己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯質(zhì)量濃度分別為400.0～7 606.0、25.4～1 773.0、4.4～1 067.0、45.0～622.0 mg/L[7-8，10，12，20]，可以看出己酸乙酯質(zhì)量濃度遠(yuǎn)高于其他3種酯，說明濃香型白酒是以己酸乙酯作為主體復(fù)合香的白酒。隨著分析技術(shù)的發(fā)展，除傳統(tǒng)意義上的四大乙酯，濃香型白酒中還存在一些前期研究未引起重視的對(duì)風(fēng)味有顯著影響的乙酯類物質(zhì)，比如一些含量在百毫克范圍內(nèi)的乙酯物質(zhì)（見表2），由于含量相對(duì)較高，因此對(duì)濃香型白酒酒體風(fēng)格的呈現(xiàn)具有不可或缺的作用。其他乙酯類物質(zhì)雖然含量相對(duì)較低（見表2），但是可能由于其閾值相對(duì)較低，在濃香型白酒的呈香呈味過程中仍具有一定的貢獻(xiàn)。因此，酯類物質(zhì)對(duì)風(fēng)味的重要性，還需根據(jù)酯的香氣貢獻(xiàn)度加以判定。

表2 濃香型白酒風(fēng)味乙酯化合物質(zhì)量濃度Table 2 Content of ethyl ester flavor substances in strong-flavor Baijiu

1.3 濃香型白酒風(fēng)味乙酯香氣貢獻(xiàn)度

香氣貢獻(xiàn)度是影響感官的重要指標(biāo)。酯類的香氣貢獻(xiàn)度主要取決于兩個(gè)參數(shù)：氣味活性值（odor activity values，OAV）和風(fēng)味稀釋 （flavor dilution，F(xiàn)D）因子。一般OAV大于1.0的酯被認(rèn)為對(duì)香氣有貢獻(xiàn)。濃香型白酒中香氣貢獻(xiàn)度最大的是己酸乙酯，其次是辛酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、2-甲基丙酸乙酯、4-甲基戊酸乙酯、3-苯丙酸乙酯、癸酸乙酯（見表3），說明濃香型白酒中己酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯等小分子脂肪酸乙酯對(duì)濃香型白酒的風(fēng)味至關(guān)重要，各酯之間相互協(xié)調(diào)，對(duì)濃香型白酒的典型風(fēng)味特征的呈現(xiàn)具有重要影響。白酒發(fā)酵過程中原料的帶入、發(fā)酵過程中的化學(xué)轉(zhuǎn)化以及微生物的代謝作用是酯類物質(zhì)合成的途徑，其中復(fù)雜的微生物菌群生長代謝是酯類風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生的主要途徑[21]。因此，對(duì)具有催化合成脂肪酸乙酯能力的核心功能微生物進(jìn)行分析，對(duì)挖掘酯合成微生物提供一定的參考。

表3 濃香型白酒風(fēng)味乙酯類物質(zhì)香氣貢獻(xiàn)度Table 3 Aroma contribution of ethyl ester flavor substances in strong-flavor Baijiu

2 濃香型白酒釀造過程催化風(fēng)味乙酯合成的重要微生物

研究表明，濃香型白酒發(fā)酵過程中共報(bào)道508種微生物，其中細(xì)菌335種、真菌62種、酵母菌78種、古生菌15種、放線菌18種[1]。值得注意的是，盡管在濃香型白酒中發(fā)現(xiàn)了大量微生物，但許多微生物的功能仍有待確定。由于脂肪酸乙酯是濃香型白酒中一類重要的呈香呈味物質(zhì)，對(duì)具有催化合成脂肪酸乙酯能力的核心功能微生物進(jìn)行總結(jié)，可以為濃香型白酒發(fā)酵過程中酯類風(fēng)味物質(zhì)代謝合成提供參考。具有脂肪酸乙酯合成功能的微生物包括細(xì)菌、霉菌和酵母菌等[22]。目前微生物可以通過以下4個(gè)途徑實(shí)現(xiàn)酯化反應(yīng)[23]（見圖1）：利用酸醇酯化反應(yīng)生成酯，如圖1（a）所示；利用半縮醛脫氫生成酯，如圖1（b）所示；利用單加氧酶催化2-酮類物質(zhì)生成酯，如圖1（c）所示；利用醇?；D(zhuǎn)移酶催化酯合成，如圖1（d）所示。白酒發(fā)酵過程中，醛酮類物質(zhì)含量極低，并不是白酒酯合成的主要途徑；酵母菌來源的醇酰基轉(zhuǎn)移酶催化酯合成多為清香型白酒產(chǎn)酯主要途徑[24]。而白酒發(fā)酵過程中含有大量的醇和有機(jī)酸，微生物來源酶催化酸醇酯化反應(yīng)對(duì)于發(fā)酵過程中酯合成起到重要貢獻(xiàn)作用，也是濃香型白酒小分子脂肪酸乙酯風(fēng)味酯合成的主要途徑（見圖1（a））。

圖1 微生物的乙酯代謝合成途徑Fig.1 Microbial metabolic pathways for synthesizing ethyl esters

近期相關(guān)細(xì)菌和霉菌源酯合成酶催化酸醇酯化反應(yīng)的研究為濃香型白酒發(fā)酵過程酯的合成提供了重要依據(jù)。白酒中細(xì)菌來源產(chǎn)酯微生物主要有伯克霍爾德氏菌 （Burkholderria sp.）、芽孢桿菌（Bacillus sp.）、擬桿菌（Bacterium sp.）、梭狀芽孢桿菌 （Bacillus fusiformis）、葡萄球菌（Staphylococcus sp.）、血紅鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas sanguinis）等[22]。例如菌株Burkholderia pyrrocinia B1213可以催化乙酸乙酯的合成，其所產(chǎn)酯合成酶BpFae也具有較好的產(chǎn)酯能力[25]。白酒中霉菌來源的產(chǎn)酯微生物主要有黑曲霉（Aspergillus niger）、根霉（Rhizopus sp.）、毛 霉 （Mucor sp.）、 煙 灰 色 曲 霉（Aspergillus fumigatus）、紫色紅曲霉（Monascus purpureus）、紅色紅曲霉（Monascus ruber）等[22]。研究發(fā)現(xiàn)菌株黑曲霉CGMCC3.4309具有水相體系高酯合成能力，優(yōu)化后的菌株可以有效合成戊酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯，轉(zhuǎn)化率分別為7.87%、29.20%、94.80%、85.20%[26]。此外，還有一株紫色紅曲霉來源的菌株YJX-8在優(yōu)化條件下，酯合成酶的酶活力達(dá)（1.177±0.009）U/mL[27]。也有研究證實(shí)根霉發(fā)酵可產(chǎn)酯合成酶，在一定條件下能夠催化己酸與乙醇反應(yīng)生成己酸乙酯，經(jīng)優(yōu)化條件后合成的己酸乙酯可達(dá)2 302 mg/dL[28]。

相關(guān)白酒源微生物，均具有在發(fā)酵體系或者酯合成反應(yīng)的水相體系以脂肪酸和乙醇為前體，催化合成脂肪酸乙酯的能力，表明白酒源發(fā)酵體系中存在不同于經(jīng)典的有機(jī)相反應(yīng)體系催化酯合成的酶資源，可以在水相體系條件下催化脂肪酸乙酯的合成。一株紫色紅曲霉YJX-8來源的酯合成酶LIP05具有水相體系酯合成的能力，去除酶的蓋子結(jié)構(gòu)酶活力提升，但是并未對(duì)其催化機(jī)制進(jìn)行解析[27]。目前對(duì)水相體系酶催化合成脂肪酸乙酯的報(bào)道較少，酶的催化機(jī)制并不明晰。因此對(duì)具有酯合成能力的相關(guān)酶類進(jìn)行系統(tǒng)性分析，將有助于為新型水相體系酯合成酶資源的挖掘與利用提供參考。

3 濃香型白酒風(fēng)味乙酯合成相關(guān)酶類

白酒發(fā)酵過程中存在大量微生物的生長代謝，是推動(dòng)物料轉(zhuǎn)化的核心動(dòng)力。具有產(chǎn)酯能力的微生物分泌的酯合成酶催化白酒酯類風(fēng)味物質(zhì)的合成是濃香型白酒發(fā)酵過程產(chǎn)酯重要途徑[27]。研究表明酯合成酶主要來源于酯酶，屬于水解酶類（hydrolases，EC3）。根據(jù)國際酶學(xué)委員會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)，酯酶全部列在酯鍵亞類條目（EC3.1），其中水解羧酸酯鍵的酶劃為EC3.1.1。羧酸酯酶中研究較多的是脂肪酶（EC3.1.1.3）、酯酶（EC3.1.1.1）和角質(zhì)酶（EC3.1.1.74）[29-30]。該類酶均屬于α/β水解酶家族，可以催化酯鍵的斷裂和生成，但在酶的催化特性方面存在一定的差異。

脂肪酶屬于α/β水解酶家族，是一種催化長鏈?；视停；滈L度≥10個(gè)碳原子）水解和合成的羧酸酯酶，在洗滌劑、食品、皮革、造紙、化妝品和生物能源等領(lǐng)域中發(fā)揮著重要作用[31-32]。在熱力學(xué)有利條件下（比如低水分活度的條件）脂肪酶可以催化多種合成反應(yīng)，可分為酯化反應(yīng)和酯交換反應(yīng)兩大類[33]。研究發(fā)現(xiàn)在動(dòng)物、植物和微生物中均存在脂肪酶，而大多數(shù)研究和工業(yè)中使用的脂肪酶都是從微生物中獲得的。假絲酵母、黑曲霉、根霉、假單胞菌、鏈霉菌和堿假單胞菌是一些產(chǎn)脂肪酶能力較強(qiáng)的菌株[34]。根據(jù)底物性質(zhì)的差異，酯酶與脂肪酶的不同之處在于其可以催化中短鏈?；视停；滈L度＜10個(gè)碳原子）水解和合成?；诎被峤M成和蛋白質(zhì)表面靜電分布可以對(duì)二者進(jìn)行區(qū)分[35]，也可以比較在可溶性酯的水解過程中兩種酶的Km值，通常脂肪酶的Km值高于酯酶的Km值[36]。角質(zhì)酶通常催化角質(zhì)聚合物中酯鍵的水解，同時(shí)也可以水解長鏈和短鏈甘油三酯，但是不需要界面激活作用，與脂肪酶和酯酶具有相似的特性，是目前已知的脂肪酶和酯酶中結(jié)構(gòu)最小的蛋白質(zhì)，可以降解植物角質(zhì)，屬于絲氨酸酯酶，也可以看作是酯酶和脂肪酶之間的過渡蛋白質(zhì)，能催化酯聚合物和甘油三酸酯的酯鍵水解。其來源廣泛，許多真菌和細(xì)菌中都存在角質(zhì)酶，其中研究最廣泛的是真菌角質(zhì)酶[37]。

4 酯合成酶結(jié)構(gòu)及催化機(jī)制

酶結(jié)構(gòu)是探索酶功能特性，解析酶催化機(jī)制以及酶理性設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)。目前對(duì)于酯合成酶結(jié)構(gòu)的研究多聚焦于酶的核心催化結(jié)構(gòu)域和蓋子結(jié)構(gòu)，此外催化活性中心、氧陰離子洞、底物通道以及關(guān)鍵的底物結(jié)合位點(diǎn)也成為解析酯合成酶催化機(jī)制的核心內(nèi)容。

4.1 酯合成酶結(jié)構(gòu)

研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)酯合成酶屬于α/β水解酶家族，其結(jié)構(gòu)主要分為兩個(gè)部分，一個(gè)是核心催化結(jié)構(gòu)域，也叫α/β水解酶折疊結(jié)構(gòu)域，另一個(gè)是蓋子結(jié)構(gòu)[38-39]。圖2所示為酯酶FAEs的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，該酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)即為標(biāo)準(zhǔn)的α/β水解折疊酶的結(jié)構(gòu)[40]。催化結(jié)構(gòu)域由α-螺旋圍繞著8個(gè)β-折疊組成，且除第2個(gè)β-折疊為反向平行，其余折疊均嚴(yán)格平行排列，為酶的活性位點(diǎn)提供了一個(gè)穩(wěn)定的支架。蓋子結(jié)構(gòu)由一些小的α-螺旋組成，位于酶的活性中心之上，其構(gòu)象的開閉控制著底物進(jìn)出催化活性中心，是大多數(shù)酯合成酶特有的結(jié)構(gòu)域[41]。大部分酯合成酶的催化結(jié)構(gòu)域較相似，均是經(jīng)典的α/β-折疊結(jié)構(gòu)，差異主要在于α-螺旋和β-折疊的數(shù)量（見表4）[42-71]。例如酯酶EprEst催化結(jié)構(gòu)域由5個(gè)α-螺旋圍繞7個(gè)β-折疊組成，其中第1個(gè)折疊β1和其他折疊β2～β7反向平行排列，且該結(jié)構(gòu)域與蓋子結(jié)構(gòu)之間形成催化裂縫[42]。與其不同的是，酯酶TtEst的催化結(jié)構(gòu)域由序列的1～29和200～275構(gòu)成，表現(xiàn)為6個(gè)α-螺旋圍繞8個(gè)β-折疊，且第2個(gè)β-折疊與其他折疊反向平行[43]。蓋子結(jié)構(gòu)、輔酶因子、催化活性中心、氧陰離子洞、底物通道或底物結(jié)合位點(diǎn)的差異是造成酯合成酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)差異的一個(gè)重要原因，也是影響酶催化特性的重要因素。

表4 酯酶結(jié)構(gòu)特征及催化特性Table 4 Structural characteristics and catalytic properties of esterase

圖2 酯酶FAEs蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)Fig.2 Structure of esterase FAEs

續(xù)表4

4.1.1 蓋子結(jié)構(gòu)大多數(shù)酯合成酶的蓋子結(jié)構(gòu)由α-螺旋和β-折疊組成（見表4）。不同酶的蓋子結(jié)構(gòu)具有不同的特點(diǎn)，主要表現(xiàn)在組成蓋子結(jié)構(gòu)的α-螺旋和β-折疊的數(shù)量的多少、蓋子結(jié)構(gòu)的有無，以及蓋子結(jié)構(gòu)中配位的金屬離子和蓋子結(jié)構(gòu)位置的不同。酯酶SABP2的蓋子結(jié)構(gòu)由3個(gè)α-螺旋和3個(gè)β-折疊組成[44]（見圖3（a）），而酯酶PnbE的蓋子結(jié)構(gòu)由5個(gè)α-螺旋組成[47]（見圖3（b））。 酯酶Cbotu_EstA的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)解析表明，該蛋白質(zhì)的氨基酸殘基236～303以及殘基334～378組成蓋子結(jié)構(gòu)，其中N末端的殘基28～63形成一個(gè)“臂”，包裹在該蓋子結(jié)構(gòu)上，并且發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中存在一個(gè)Zn2+結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)調(diào)節(jié)蓋子結(jié)構(gòu)構(gòu)象的改變具有重要作用，同時(shí)也是影響酶熱穩(wěn)定性的一個(gè)重要因素[58]（見圖3（c））。假單胞菌（Pseudomonas sp.）來源的脂肪酶PML中存在由α-螺旋構(gòu)成的兩個(gè)蓋子結(jié)構(gòu)Lid1和Lid2，當(dāng)Ca2+存時(shí)，Lid1被打開，進(jìn)而啟動(dòng)Lid2的打開，行使酶的催化功能[72]（見圖3（d））。此外，蓋子結(jié)構(gòu)在靈活性方面也表現(xiàn)出差異，脂肪酶PEL的蓋子結(jié)構(gòu)和催化活性區(qū)域之間形成一個(gè)“空腔”，且晶體的蓋子結(jié)構(gòu)完全無序，說明其蓋子結(jié)構(gòu)非常靈活[71]（見圖3（e））。不同的是，在脂肪酶AFLB中，蓋子結(jié)構(gòu)由一段Loop環(huán)構(gòu)成，蓋子上的氨基酸殘基Cys273和Cys281之間形成二硫鍵，限制了蓋子的移動(dòng)[68]（見圖3（f））。來源于球形馬拉色菌（Malassezia globosa）的脂肪酶SMG1的蓋子結(jié)構(gòu)呈一個(gè)Loop環(huán)構(gòu)象，而非α-螺旋構(gòu)象，該結(jié)構(gòu)的移動(dòng)并不會(huì)激活酶的催化功能，但是結(jié)構(gòu)中存在的兩個(gè)殘基Asp278和Asn102可以激活該酶，是負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)脂肪酶活性和非活性狀態(tài)的門控機(jī)制的關(guān)鍵位點(diǎn)[73]（見圖3（g））。與此類似，脂肪酶Mrlip1在行使催化功能時(shí)蓋子結(jié)構(gòu)上的殘基Thr101和Thr107以及“flap”區(qū)域的殘基Gln282和Phe278引起構(gòu)象變化，是負(fù)責(zé)打開和關(guān)閉Mrlip1 DAG脂肪酶活性口袋的門控機(jī)制的關(guān)鍵位點(diǎn)[74]。某些酶的蓋子結(jié)構(gòu)中存在鹽橋，例如脂肪酶ReLip蓋子結(jié)構(gòu)氨基酸殘基Arg291和Glu118之間存在一個(gè)鹽橋，這種鹽橋在其他具有蓋子結(jié)構(gòu)的脂肪酶中不保守，且鹽橋的存在意味著疏水囊對(duì)大體積溶劑具有更高的保護(hù)作用，這可能與ReLip對(duì)有機(jī)溶劑的高耐受性有關(guān)，與其他脂肪酶相比，ReLip的蓋子也具有一種罕見的性質(zhì)，即含有5種酸性氨基酸，這有助于增加該酶在酸性條件下的耐受性[75]。研究發(fā)現(xiàn)還存在一些非常特殊的不含有蓋子結(jié)構(gòu)的酯酶，對(duì)于SGNH家族的酯酶，其結(jié)構(gòu)中不含有蓋子結(jié)構(gòu)和“nucleophile elbow”，且不具有典型的保守五肽序列，其保守序列表現(xiàn)為GDSL。如酯酶CrmE10由12個(gè)α-螺旋和5個(gè)β-折疊組成，不含有蓋子結(jié)構(gòu)[45]（見圖3（h））。

圖3 不同酯酶及其蓋子結(jié)構(gòu)Fig.3 Different esterases and their respective lid structures

4.1.2 輔酶因子研究證實(shí)，少數(shù)酯合成相關(guān)酶類在催化過程中需要輔酶參與催化過程。革蘭氏陰性菌許多酶的折疊和細(xì)胞定位依賴于伴侶和分泌系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)，其中脂肪酶特異性折疊酶Lif作為一種膜結(jié)合的立體伴侶，存在一個(gè)小的結(jié)構(gòu)域MD1，該結(jié)構(gòu)可以緊密結(jié)合并介導(dǎo)脂肪酶LipA的折疊[76]。來源于假單胞菌（Pseudomonas sp.）和洋蔥伯克霍爾德氏菌（Burkholderia cepacia）的脂肪酶折疊過程中存在一個(gè)巨大的障礙而無法自發(fā)正確折疊，研究發(fā)現(xiàn)這類脂肪酶中往往存在一個(gè)脂肪酶特異折疊酶，該類蛋白質(zhì)為脂肪酶的立體分子伴侶，幫助脂肪酶越過折疊過程中的能量障礙，為其獲得正確構(gòu)象提供必要空間信息[77]。類似的研究表明伯克霍爾德氏菌來源（Burkholderia glumae）脂肪酶表達(dá)需要一個(gè)伴侶基因Lif來幫助其折成有活性的構(gòu)象，且必須同時(shí)表達(dá)LipA和Lif才能獲得有活性的脂肪酶[78]。此外還存在一些自身抑制酶活性的結(jié)構(gòu)，例如華根霉（Rhizopus chinensis）來源脂肪酶N端片段（NTPS）是蛋白質(zhì)分泌和折疊所必需的一個(gè)結(jié)構(gòu)，但是該結(jié)構(gòu)通過與脂肪酶的蓋子結(jié)構(gòu)和催化結(jié)構(gòu)域形成保守的相互作用來抑制活性，說明NTPS是一種酶的內(nèi)部競爭性抑制劑[79]。

4.1.3 催化活性中心催化活性中心是酶催化的關(guān)鍵區(qū)域，目前主要通過結(jié)構(gòu)測定以及序列比對(duì)的方法以確定酶的催化活性中心。酯合成相關(guān)酶類的催化活性中心即催化三聯(lián)體通常由Ser-His-Asp/Glu組成（見表4）。其中Ser是親核性殘基，位于保守的五肽序列“GX1SX2G”中，His是質(zhì)子受體/供體，Asp則作為穩(wěn)定組氨酸的殘基。Ser的氧原子和His的氮原子之間形成氫鍵以穩(wěn)定親核殘基Ser的構(gòu)象，而His和Asp的側(cè)鏈則通過位于β-折疊的羧基邊緣的氫鍵來穩(wěn)定。脂肪酶CALB的晶體結(jié)構(gòu)解析表明該酶具有經(jīng)典的催化三聯(lián)體Ser105-His224-Asp187[80]，與此類似，脂肪酶T1的晶體結(jié)構(gòu)解析，表明該酶的催化三聯(lián)體為Ser113-His358-Asp317[81]。激素敏感脂肪酶家族的酯酶E40催化三聯(lián)體為Ser145-His269-Glu239，其中Glu239區(qū)別于其他酯酶催化三聯(lián)體中殘基Asp[54]。通常該類酶具有保守五肽序列“GX1SX2G”，然而存在某些酶雖然表現(xiàn)為經(jīng)典的催化三聯(lián)體形式，但其保守序列卻有所不同。例如酯酶CrmE10的催化三聯(lián)體為Ser29-His181-Asp178，但其保守序列為“GDSL”[45]；脂肪酶PfL1催化三聯(lián)體為Ser129-His372-Asp330，而保守序列為“AX1SX2G”[65]，脂肪酶L2保守序列也為“AX1SX2G”型[69]。此外，還存在某些酯酶的催化活性中心并不表現(xiàn)為經(jīng)典的催化三聯(lián)體形式。例如首次發(fā)現(xiàn)SGNH家族的脂肪酶SrLip活性位點(diǎn)位于疏水結(jié)合袋入口前，且催化活性中心由Ser10和His216殘基組成催化二聯(lián)體，其中Ser10的氧原子和His216的氮原子之間形成氫鍵，親核的Ser10位于α1螺旋內(nèi)，His216位于殘基192～211形成的Loop環(huán)的下方，殘基211～213存在一個(gè)“轉(zhuǎn)向”，使殘基Asn213（相當(dāng)于其他水解酶催化三聯(lián)體中的Asp）遠(yuǎn)離催化位點(diǎn)，表現(xiàn)出該酶以催化二聯(lián)體作為活性中心[82]；酯酶EprEst的催化活性中心為Ser85-Asp109-Ser214-His242構(gòu)成的催化四聯(lián)體形式，具有保守的五肽序列“GHSMG”，位于β4和α3之間形成“nucleophilic elbow”，而其他3個(gè)活性殘基位于不同的Loop區(qū)內(nèi)，這4個(gè)殘基通過氫鍵和鹽橋作用進(jìn)行穩(wěn)定，殘基Ser85的氧原子通過氫鍵與His242的氮原子相互作用，His242的氮原子與Asp109的氧原子相互作用形成鹽橋，而Asp109的側(cè)鏈氧原子與Ser214相互作用形成氫鍵，構(gòu)成穩(wěn)定的催化四聯(lián)體活性中心[42]。酶的催化活性中心突變后通常會(huì)使酶失活，但也有一些較為有趣的發(fā)現(xiàn)，例如以來源于南極假絲酵母的脂肪酶B（CALB）作為帶有Ser-His-Asp催化三聯(lián)體的脂肪酶模型，通過定向進(jìn)化得到具有Cys-His-Asp催化三聯(lián)體的高活性半胱氨酸脂肪酶，催化效率較野生型提高40倍[83]。

4.1.4 氧陰離子洞酯合成酶的蓋子結(jié)構(gòu)覆蓋在酶的催化活性中心，阻止了底物與活性中心的接觸。當(dāng)位于油水界面時(shí)，會(huì)產(chǎn)生“界面激活”現(xiàn)象，使蓋子結(jié)構(gòu)發(fā)生構(gòu)象變化，蓋子結(jié)構(gòu)被打開，活性中心暴露出來，底物進(jìn)入活性中心并與之結(jié)合，酶催化活性顯著提升。在酶的“蓋子”打開的同時(shí)，氧陰離子洞也隨之形成。氧陰離子洞是酶活性中心“口袋”附近的催化元件，位于絲氨酸羥基周圍0.3～0.5 nm，在大多數(shù)情況下由來自兩個(gè)主鏈酰胺結(jié)合羰基氧形成的氫鍵來穩(wěn)定四面體中間產(chǎn)物[26]。氧陰離子洞主要表現(xiàn)為3種類型：GGG（X）、G（X）和Y類。其中G（X）類主要包括細(xì)菌和真菌脂肪酶、角質(zhì)酶、磷脂酶和非血紅素過氧化物酶。GGG（X）類主要包括細(xì)菌酯酶、真菌羧酸酯酶、激素敏感脂肪酶、乙酰膽堿酯酶和硫酯酶等[84]。表4所示為部分已知晶體結(jié)構(gòu)的酯酶的氧陰離子洞，其中酯酶EH3、RmEstB、TmelEST2-3具有保守的氧陰離子洞序列HGGG，酯酶E40、E53、Est22具有保守的HGG序列，而其他酯酶則表現(xiàn)為各自特有的氧陰離子洞序列。酯酶Est4序列分析發(fā)現(xiàn)該酶含有一個(gè)GGG（X）型的氧陰離子洞[85]。酯酶EstBP7的序列分析發(fā)現(xiàn)該酶氧陰離子洞表現(xiàn)為Gly-Gly-Thr，是一種罕見的氧陰離子洞[86]。研究表明紅球菌來源的脂肪酶LipR氧陰離子洞表現(xiàn)為Y型，并將這種Y型氧陰離子洞改造為常見的GGG（X）型，發(fā)現(xiàn)改造之后酶活力完全喪失，表明LipR的Y型氧陰離子洞是維持酶活性的重要結(jié)構(gòu)[87]。

4.1.5 底物通道和底物結(jié)合位點(diǎn)酶催化的過程中存在底物進(jìn)入到反應(yīng)區(qū)域和產(chǎn)物從反應(yīng)區(qū)域釋放的通道，即為底物通道或底物結(jié)合口袋。底物到達(dá)酶的催化活性區(qū)域是催化的第一步，對(duì)酶催化過程有著重要影響，甚至有可能成為整個(gè)酶催化效率的決定性因素。因此，底物通道是酶催化的關(guān)鍵性區(qū)域。此外，一些底物結(jié)合位點(diǎn)對(duì)于酶行使催化功能具有關(guān)鍵作用，也是酶催化的關(guān)鍵位點(diǎn)。

底物通道的表面通常由疏水性氨基酸組成，并與疏水性底物之間形成相互作用。通常底物通道在疏水相互作用的區(qū)域、形狀、大小、口袋深度以及氨基酸的理化性質(zhì)方面有所不同。如表4所示，酯酶EH3的底物通道由3個(gè)通道組成，分別為醇通道、?；ǖ酪约爸ф滜；ǖ?，3個(gè)通道大部分由來自蓋子結(jié)構(gòu)和催化結(jié)構(gòu)域的疏水性殘基組成，其中?；ǖ烙蓺埢鵐115、Y223、W228、L246、I244和L260組成，醇通道由疏水殘基F26、L56、M59、M60和M63組成[81]。酯酶RmEstA和RmEstB結(jié)構(gòu)分析表明其底物結(jié)合口袋從蛋白質(zhì)表面延伸到催化殘基Ser164約1.1 nm的距離，呈“漏斗狀”，被4個(gè)α-螺旋和Loop環(huán)包圍，而RmEstA的底物結(jié)合口袋則是一條貫穿整個(gè)酶的通道，該通道的入口被5個(gè)α-螺旋和Loop環(huán)包圍，表明不同酯酶的底物通道大小、形狀不同[52]。酯酶TmelESTs的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)以及催化機(jī)制解析得出該酶的底物結(jié)合口袋由兩個(gè)大小不同的通道組成，從親核殘基Ser190延伸到蛋白質(zhì)的外表面，呈“隧道狀”，其中大的通道有兩個(gè)底物入口，內(nèi)表面由疏水性和極性殘基排列，而另一個(gè)小的通道是?；孜锝Y(jié)合通道，內(nèi)表面由疏水性氨基酸排列[55]。研究表明脂肪酶Yju3p的底物入口通道主要由來自蓋子結(jié)構(gòu)的疏水殘基和催化結(jié)構(gòu)域的殘基組成，且底物在兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間充當(dāng)一個(gè)“楔子”作用[62]。酯酶EprEst的蓋子結(jié)構(gòu)和催化結(jié)構(gòu)域在其界面上形成一個(gè)細(xì)長的底物結(jié)合口袋，從催化中心延伸到蛋白質(zhì)表面，其中6個(gè)芳香氨基酸殘基參與了底物和通道入口的形成[42]。酯酶E53催化活性口袋由7個(gè)α-螺旋和4個(gè)β-折疊組成，催化口袋呈“L”形，該區(qū)域包括3個(gè)部分：一個(gè)是催化中心區(qū)域，一個(gè)是底物通道入口，一個(gè)是底物結(jié)合口袋末端區(qū)域[57]。酯酶EstDL136則具有一個(gè)相對(duì)較淺的底物結(jié)合口袋，這是因?yàn)橛?個(gè)殘基Trp86、Met211和Trp215聚集在活性位點(diǎn)的底部，使得口袋相對(duì)較小，因此其最適底物為乙酸對(duì)硝基苯酯而不是丁酸對(duì)硝基苯酯，而在同源家族的其他酯酶中，該位點(diǎn)處會(huì)被其他側(cè)鏈較小的氨基酸取代，活性口袋較大，因而表現(xiàn)出對(duì)長鏈底物的偏好性，說明活性口袋大小與其底物偏好性有密切關(guān)系[53]。

4.2 酯合成酶催化機(jī)制

不同來源的酯合成酶在催化合成酯類物質(zhì)時(shí)具有相似的催化機(jī)制，其中酯酶遵循經(jīng)典的Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)方程，具有相對(duì)開放的活性位點(diǎn)，而脂肪酶則需要“界面激活”作用，即水不溶性底物（如三酰甘油、脂肪和其他不溶性底物）的羧基酯鍵在水和低水介質(zhì)中的水解反應(yīng)，遵循酶吸附到非均相界面并隨后增強(qiáng)脂解活性，定義為“界面活化”[88]。該類酶在行使催化功能時(shí)需要經(jīng)歷蓋子結(jié)構(gòu)構(gòu)象的改變，當(dāng)酶的蓋子結(jié)構(gòu)打開，底物分子進(jìn)入酶的催化活性中心，如圖4（a）和圖4（b）所示。絲氨酸的側(cè)鏈羥基氧原子親核攻擊底物的羧基碳原子，電子轉(zhuǎn)移到底物的羧基氧原子上生成氧負(fù)離子，并與氧陰離子洞的氫原子形成氫鍵，維持酶-底物復(fù)合物的穩(wěn)定性；絲氨酸殘基的氧原子和底物之間形成共價(jià)鍵產(chǎn)生四面體過渡態(tài)1，如圖4（b）和圖4（c）所示。隨后，釋放水分子形成?；z氨酸，如圖4（c）和圖4（d）所示。醇進(jìn)入催化活性中心，醇氧原子攻擊?；z氨酸的羰基碳原子，形成四面體過渡態(tài)2，如圖4（e）所示。最后，四面體過渡態(tài)2的碳原子與醇的氧原子形成共價(jià)鍵，絲氨酸側(cè)鏈羥基氧原子與底物碳原子之間的共價(jià)鍵被打破，實(shí)現(xiàn)酯化反應(yīng)，如圖4（f）所示[26]。

圖4 酶催化酯化反應(yīng)機(jī)制Fig.4 Mechanism of esterification reaction catalyzed by enzyme

明晰酯合成酶催化機(jī)制對(duì)于指導(dǎo)生產(chǎn)過程中小分子脂肪酸乙酯的有效合成具有十分重要的作用。近年來，許多研究者聚焦于結(jié)構(gòu)分析實(shí)現(xiàn)分子改造，通過提升酯酶的催化活性及其穩(wěn)定性，來獲得性能品質(zhì)更優(yōu)的酯酶，實(shí)現(xiàn)底物的高效轉(zhuǎn)化以及產(chǎn)物的有效合成。

5 酯合成酶的分子改造

目前，酯合成酶的分子改造多聚焦于結(jié)構(gòu)、催化活性中心以及與活性中心緊密聯(lián)系的底物通道等酶蛋白結(jié)構(gòu)區(qū)域，其中蓋子結(jié)構(gòu)的去除以及替換、蓋子結(jié)構(gòu)上的氨基酸殘基以及底物通道或者底物結(jié)合位點(diǎn)處的關(guān)鍵氨基酸殘基等點(diǎn)突變均為分子改造和催化機(jī)制研究的重要內(nèi)容。表5中總結(jié)了目前酯酶的蓋子結(jié)構(gòu)以及關(guān)鍵位點(diǎn)突變改造的相關(guān)研究[27，89-102]。現(xiàn)有的大量研究通過酯酶形成氫鍵的氨基酸殘基、氫鍵距離、疏水相互作用以及空間位阻等來分析酶催化的分子機(jī)制，進(jìn)而采用去除或者替換蓋子結(jié)構(gòu)的分子改造方法來實(shí)現(xiàn)酶作用效率和應(yīng)用性能的提升。

表5 酯酶分子改造研究文獻(xiàn)Table 5 References in esterase molecular modification

6 結(jié) 語

風(fēng)味酯類物質(zhì)的組成和比例對(duì)濃香型白酒的感官品質(zhì)具有重要影響，其中脂肪酸乙酯因種類豐富和相對(duì)含量高，對(duì)酒體的感官品質(zhì)的貢獻(xiàn)尤為突出，而濃香型白酒釀造過程中的各類微生物對(duì)于酯類物質(zhì)的生成十分關(guān)鍵。作者在分析濃香型白酒脂肪酸乙酯風(fēng)味貢獻(xiàn)基礎(chǔ)上，系統(tǒng)總結(jié)了釀造過程酯合成相關(guān)的重要微生物以及相關(guān)酯合成酶的種類、序列、結(jié)構(gòu)特征等，分析探討了酯合成酶的催化機(jī)制以及相關(guān)酶的分子改造研究現(xiàn)狀，在一定程度上為明晰濃香型白酒釀造過程中小分子脂肪酸乙酯的有效合成途徑提供了新的視角和思路。然而，需要特別關(guān)注的是，濃香型白酒釀造過程中，尤其是在酒醅固態(tài)發(fā)酵階段，酒醅含水量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為53%～58%[32]，微生物與酶生長與作用的重要特征之一是處于水相體系中，這與現(xiàn)有的微生物來源酶催化酯合成在有機(jī)介質(zhì)條件下的理論與機(jī)制存在較為顯著的區(qū)別。因此，進(jìn)一步深入探討水相體系酯合成酶催化生成酯類化合物的相關(guān)分子機(jī)制，不僅能夠?yàn)榭茖W(xué)認(rèn)知濃香型白酒風(fēng)味酯的合成途徑提供新的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，更可為解析濃香型白酒風(fēng)味化合物有效合成規(guī)律進(jìn)而提升產(chǎn)品品質(zhì)提供科學(xué)參考。