肖衛(wèi)華，郭田華*，于小靜，程曉輝

（1.遂川縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村產(chǎn)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，江西 吉安，343900；2.中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心；3.吉林省牧業(yè)信息中心）

小反芻獸疫（Peste des Petits Ruminants，PPR）是由小反芻獸疫病毒（Peste des Petits Ruminants Virus，PPRV）引起的一種急性接觸性傳染病，主要感染山羊、綿羊和野生小反芻動(dòng)物。PPR是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定的法定報(bào)告動(dòng)物疫病，由于可能對(duì)多個(gè)國家的經(jīng)濟(jì)、貿(mào)易和糧食安全造成破壞性影響，聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）將PPR列為跨界動(dòng) 物 疾 病(Transboundary Animal Disease，TAD)[1]。2015年FAO和OIE聯(lián)合啟動(dòng)了《小反芻獸疫全球控制和根除戰(zhàn)略》，計(jì)劃將于2030年根除PPR。該戰(zhàn)略分為四個(gè)階段，分別為評(píng)估階段、控制階段、根除階段和根除后階段。

PPR是威脅發(fā)展中國家養(yǎng)羊業(yè)健康發(fā)展的重要因素之一，1942年在非洲西海岸象牙海岸（科特迪瓦）首次發(fā)現(xiàn)PPR，隨后向非洲東部擴(kuò)散至蘇丹、埃塞俄比亞等國家。1987年傳入亞洲，1999年傳播至歐洲（圖1）[2]。2007年7月，我國西藏阿里地區(qū)首次發(fā)生PPR疫情，當(dāng)時(shí)針對(duì)疫情實(shí)施了全國監(jiān)測(cè)計(jì)劃，由于西藏地區(qū)的天然地理隔離屏障以及紫外線強(qiáng)烈等環(huán)境因素，沒有發(fā)生大規(guī)模的傳播。直至2013年11月在新疆維吾爾族自治區(qū)伊犁州又暴發(fā)了PPR疫情，此次疫情傳播至全國22個(gè)省市自治區(qū)[3]。我國暴發(fā)的兩次疫情中病毒分離株與鄰國Ⅳ系的分離株關(guān)系密切，但不在同一分支[4]。我國將PPR列為一類動(dòng)物疫病。

圖1 全球暴發(fā)PPR疫情暴發(fā)時(shí)間軸

1 病原學(xué)

1.1 病毒分類地位與分子結(jié)構(gòu)

PPRV屬于副黏病毒科、麻疹病毒屬。與牛瘟病毒（RPV）、麻疹病毒（MV）、犬瘟熱病毒（CDV）等同屬其他病毒有密切的抗原關(guān)系。PPRV為單股負(fù)鏈有囊膜的RNA病毒，病毒粒子呈圓形或橢圓形，直徑介于400~500nm之間。電鏡下觀察到PPRV囊膜厚度約8~15nm，囊膜上有兩種長度在8.5~14.5nm之間糖蛋白纖突。根據(jù)開放閱讀框架和RNA編輯的不同，可編碼8種蛋白，包括6種結(jié)構(gòu)蛋白，分別為核衣殼蛋白（Nucleocapsid，N蛋白）、基質(zhì)蛋白（Matrix Protein，M蛋白）、聚合酶或大 蛋 白 （Large protein，L蛋 白）、 磷 蛋 白（Phosphoprotein，P蛋白）、血凝素（Hemagglutinin protein，H蛋白）和融合蛋白（Fusion protein，F(xiàn)蛋白），以及2種由P基因編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白（C蛋白和V蛋白）。N、P和L蛋白分布于核衣殼，共同作用完成PPRV的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制；H和F蛋白可介導(dǎo)病毒吸附融合，這2種蛋白在囊膜上可形成糖蛋白纖突；位于囊膜內(nèi)側(cè)的M蛋白主要在病毒出芽過程中發(fā)揮作用。根據(jù)N蛋白和F蛋白可將病毒分為4個(gè)譜系（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ）。Ⅰ系和Ⅱ系主要流行于西非，Ⅲ系主要在阿拉伯、東非流行，Ⅳ主要流行于亞洲，后逐漸傳入非洲[5]。PPRV全基因長15948bp，是麻疹病毒屬中最長的病毒[6]，與同屬其他成員一樣，PPRV具有六堿基原則，是保證病毒基因組有效復(fù)制的必要條件。

1.2 病毒理化特性

PPRV抵抗力較弱，對(duì)紫外線以及酒精、乙醚和苯酚等化學(xué)物質(zhì)敏感，大多數(shù)的化學(xué)滅活劑，如酚、2%NaOH作用24 h可以滅活病毒[7]。處于50℃下30 min病毒感染能力消失，溫度超過70℃病毒失活。

2 流行病學(xué)

2.1 傳染源

帶毒動(dòng)物是主要傳染源。病羊的眼、鼻、口排出帶有毒素的分泌物將飼料、墊料以及水槽等物品污染后，易感動(dòng)物可能與這些污染物發(fā)生密切接觸而感染。本病發(fā)生無明顯季節(jié)性，一年四季均可發(fā)病，但多雨和干燥寒冷季節(jié)時(shí)為本病的高發(fā)期。PPR的病程表現(xiàn)根據(jù)病毒毒力、發(fā)病季節(jié)、感染動(dòng)物品種和年齡以及感染動(dòng)物免疫狀況和是否有并發(fā)感染等因素的影響而不同，可將其分為特急性行、急性型、亞急性型和亞臨床型四種類型，通常以急性型為主。

2.2 傳播途徑

主要通過呼吸道和消化道感染，并在短時(shí)間內(nèi)侵襲其他重要器官。呼吸系統(tǒng)是該病主要傳播途徑。除此之外，PPR也可以通過感染動(dòng)物的精液、胚胎和母乳喂養(yǎng)傳播。在自然界中，野生動(dòng)物跨越邊境遷徙是PPR跨界傳播的一個(gè)潛在原因。土耳其有報(bào)道蠓有作為媒介傳播PPRV的可能性[8]。交易后的牲畜運(yùn)輸也被視為PPRV傳播的重要途徑。疾病的傳播具有明顯的定向傳播，日平均溫度、日平均相對(duì)濕度和每日日照時(shí)間與PPR爆發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)，而日平均氣壓存在正相關(guān)關(guān)系，氣象因素可能是影響PPR傳播的重要變量[9]。

2.3 易感動(dòng)物

PPRV的宿主廣泛，主要自然宿主是綿羊和山羊，山羊較綿羊更易感。此病不感染人。幼齡動(dòng)物發(fā)病率和死亡率更高，處于哺乳期以及3~18月齡的幼齡羊更易感染。野生反芻動(dòng)物在PPRV的傳播中可能會(huì)威脅瀕危野生動(dòng)物。許多野生反芻動(dòng)物，例如羚羊、白尾鹿、努比亞野山羊、亞洲獅等也會(huì)感染本病，駱駝也可感染本病[10]。

3 診斷

3.1 臨床癥狀與病變

潛伏期通常為4~6d，平均潛伏期為4d。PPR臨床癥狀與藍(lán)舌病、山羊/綿羊痘、傳染性山羊胸膜肺炎等疫病相似。山羊的臨床癥狀更為典型。感染PPRV動(dòng)物臨床癥狀表現(xiàn)為何種類型主要取決于感染病毒株的毒力大小、感染種群的類別以及疫苗毒和野毒的抗體[4]。PPR急性型在臨床上通常表現(xiàn)持續(xù)高熱（40℃以上）并伴有厭食、精神沉郁、脫水、口鼻分泌物增多等癥狀，口鼻分泌物逐漸變?yōu)檎骋耗撔?，并伴有大量流涎，也?huì)出現(xiàn)嘴唇和牙齦口炎，并可能出現(xiàn)壞死性病變。還會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌繼發(fā)感染的臨床癥狀并發(fā)癥[11]。在疾病的后期，動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)腹瀉和咳嗽，并伴有費(fèi)力的腹式呼吸。最終動(dòng)物可能會(huì)出現(xiàn)呼吸困難、消瘦，直至死亡。病理變化通常表現(xiàn)口腔黏膜、肺和腸黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生病變，形成多核合胞體細(xì)胞的嗜酸性包涵體。胃腸道和呼吸系統(tǒng)的淋巴組織和上皮細(xì)胞退化并出現(xiàn)壞死。剖檢可見肺充血、胃腸道和鼻竇充血、水腫，咽后淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)充血、腸黏膜線性出血和脾臟腫大。淋巴結(jié)、其他淋巴組織和消化道器官是病毒復(fù)制的主要部位[12]。

3.2 實(shí)驗(yàn)室診斷

3.2.1 病毒分離培養(yǎng)。病毒分離鑒定是PPRV檢測(cè)的基本方法，但耗時(shí)長，靈敏度低。PPRV既能夠在綿羊或山羊的原代細(xì)胞中分離和培養(yǎng)，也可以在傳代細(xì)胞，如Vero細(xì)胞、MDBK、BHK-21、BSC獼猴腎細(xì)胞以及CHS-20細(xì)胞中進(jìn)行增殖?；疾?dòng)物的眼、鼻、口和直腸分泌物的拭子，淋巴結(jié)、扁桃腺、脾、肺、大腸等組織以及血液樣本均可以進(jìn)行病毒分離試驗(yàn)，其中鼻拭子是診斷PPRV最合適的樣本。接種后細(xì)胞在6~15d發(fā)生病變出現(xiàn)多核細(xì)胞，若在5~6d后細(xì)胞仍無變化則需要進(jìn)行盲傳，直到出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）。

3.2.2 病原學(xué)診斷。John Flannery等人建立了基于PPRV F基因的RT-qPCR檢測(cè)方法[13]，具有100%的特異性,敏感性最低檢測(cè)限為10copies/μL，對(duì)于未發(fā)生臨床癥狀的動(dòng)物具有足夠高的靈敏度。Rajko-Nenow Paulina等人針對(duì)PPRV N基因設(shè)計(jì)6條特異性引物建立RT-LAMP檢測(cè)方法[14]，在65℃20min即內(nèi)可得到檢測(cè)結(jié)果，與實(shí)時(shí)熒光RT-PCR相比有100%的特異性和接近97%的敏感性。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證最早可在感染4d后檢測(cè)到PPRV，RT-LAMP的成本相比于RT-PCR來說較低，適用于欠發(fā)達(dá)的地區(qū)。Zhang Y等人根據(jù)PPRV N基因設(shè)計(jì)用于RPA的引物[15]，用于RT-RPA和實(shí)時(shí)RT-RPA檢測(cè)，常規(guī)RT-RPA在41℃20min條件下檢測(cè)到852copies，實(shí)時(shí)RT-RPA在39℃20min條件下每個(gè)反應(yīng)中檢測(cè)到103copies。兩種方法均不與BVDV、IBRV、CDV、NDV、FMDV等病原體發(fā)生交叉反應(yīng)。Yuanli Li等同樣針對(duì)N基因進(jìn)行研究[16]，在不與其他病原體發(fā)生交叉反應(yīng)的前提下，建立了實(shí)時(shí)RT-RPA檢測(cè)方法，在42℃20min時(shí)檢測(cè)限為14.98 copies和基于質(zhì)?？截悢?shù)和組織培養(yǎng)感染滴度0.326 TCID50/mL，靈敏度更高。Mahapatra Mana針對(duì)N基因C端保守區(qū)設(shè)計(jì)的引物組N1197F/N1658R進(jìn)行第一步RT-PCR擴(kuò)增[17]，再使用引物NP3/NP4（診斷實(shí)驗(yàn)室廣泛使用）進(jìn)行巢式PCR，該方法針對(duì)于弱陽性的樣本和病毒含量較低的環(huán)境樣本能夠擴(kuò)增出較強(qiáng)的目的條帶，并可用于測(cè)序。

3.2.3 血清學(xué)診斷。感染小反芻獸疫后能夠終身產(chǎn)生抗體，對(duì)再次感染能夠產(chǎn)生完全保護(hù)，血清學(xué)適用于PPR的大規(guī)模監(jiān)測(cè)。Balamurugan V等人開發(fā)了基于多克隆抗體的間接ELISA方法[18]，間接ELISA與競(jìng)爭(zhēng)性ELISA相比，有更優(yōu)的特異性(95.09%)和敏感性(90.81%)。與病毒中和試驗(yàn)（VNT）相比，具有100%的特異性和80%的敏感性。Jialin Zhang等人建立了能夠穩(wěn)定表達(dá)山羊SLAM至少20代的幼倉鼠腎山羊信號(hào)淋巴細(xì)胞活化分子（BHK-SLAM）細(xì)胞系[19]?；谠摷?xì)胞系和表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）的重組PPRV（rPPRV-GFP），開發(fā)了一種用于PPR抗體診斷的免疫過氧化物酶單層測(cè)定法（IPMA）。對(duì)198份羊血清樣本通過IPMA和病毒中和試驗(yàn)(VNT)兩種方法進(jìn)行檢測(cè)。與VNT相比，IPMA的敏感性和特異性分別為91%和100%，兩種方法的符合率為95.5%。IPMA可在4h內(nèi)完成檢測(cè)，并且不需要抗原純化。IPMA能夠替代VNT用于檢測(cè)PPRV抗體。瓊脂糖凝膠免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)（AGID）和對(duì)流免疫電泳（CIE）在早期的診斷中使用廣泛，但是這兩種方法難以檢測(cè)PPRV抗原含量較低的樣品。

4 預(yù)防與控制

4.1 疫苗的開發(fā)

4.1.1 減毒活疫苗。PPRV與同屬的RPV關(guān)系密切，早期對(duì)PPR的防控就是使用RPV減毒活疫苗作為異源疫苗[20]，但考慮到根除牛瘟期間的安全性便被禁止使用。Nigeria 75/1最初是從一只患病的尼日利亞山羊中分離，并在Vero細(xì)胞中連續(xù)傳代至80代以減弱其毒性，1989年弱毒疫苗Nigeria 75/1問世；1996年印度分離株在絨猴淋巴母細(xì)胞系上連續(xù)傳代59代，獲得減毒活疫苗Sungri 96，至少能提供6年的有效免疫。sungri 96和Nigeria 75/1是目前使用最多的疫苗，都可以誘導(dǎo)針對(duì)PPRV四種譜系的保護(hù)性免疫[21]。sungri 96主要用于印度和不丹，而Nigeria 75/1常用于非洲、中東和亞洲部分地區(qū)。但是減毒活疫苗無法區(qū)分自然感染動(dòng)物和疫苗接種動(dòng)物。而且減毒活疫苗保留有毒力，存在毒力反強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)。我國使用的是PPRV-Clone 9株開發(fā)的疫苗，目前已用于國內(nèi)PPR防控。PPRV易變異，最好使用當(dāng)?shù)胤蛛x株制備的特異性疫苗。從流行病學(xué)控制和監(jiān)測(cè)的角度分析，減毒活疫苗并不是最理想的疫苗，尤其是在動(dòng)物流行病暴發(fā)時(shí)。

4.1.2 重組亞單位疫苗。重組亞單位疫苗由病原功能性結(jié)構(gòu)蛋白制成，H蛋白和F蛋白均能夠激發(fā)保護(hù)性免疫，是研究PPRV重組亞單位疫苗優(yōu)選靶蛋白。使用高宿主特異性的山羊痘病毒作為重組疫苗載體，構(gòu)建了含有PPRV F蛋白基因cDNA的重組山羊痘病毒疫苗。表達(dá)PPR F蛋白的山羊痘病毒重組體可以保護(hù)山羊避免感染PPR和山羊痘，0.1 PFU重組劑量能夠保護(hù)山羊避免感染PPRV[22]。

4.1.3 病毒樣顆粒疫苗。病毒樣顆粒疫苗具有很強(qiáng)的抗原性，容易被抗原呈遞細(xì)胞和B細(xì)胞識(shí)別，能夠誘導(dǎo)強(qiáng)烈的體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。病毒樣顆粒疫苗是相對(duì)安全的，因?yàn)樵跊]有遺傳物質(zhì)的情況下不會(huì)發(fā)生病毒復(fù)制。用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)開發(fā)了PPRV病毒樣顆粒疫苗，可以在昆蟲細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)PPRV M、H、F和N蛋白。用PPRV病毒樣顆粒疫苗（VLPs）免疫小鼠和山羊可引起強(qiáng)烈的中和反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)。對(duì)小鼠研究發(fā)現(xiàn)，VLPs在CD4和CD8 T細(xì)胞中誘導(dǎo)了比在Nigeria75/1中更強(qiáng)烈的IFN-γ反應(yīng)。對(duì)山羊的研究表明，PPRV VLPs可以誘導(dǎo)產(chǎn)生F和H蛋白特異性抗體，還可以刺激產(chǎn)生與Nigeria75/1疫苗相同數(shù)量的病毒中和抗體。這項(xiàng)研究證明病毒樣顆粒疫苗可在小型反芻動(dòng)物中引發(fā)有效免疫應(yīng)答[23]。

4.1.4 活病毒載體疫苗。是研制DIVA疫苗最有希望的方法之一，由于可攜帶單一保護(hù)性抗原基因，誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)不同于自然感染情況，從而可區(qū)分免疫動(dòng)物和自然感染動(dòng)物。這類疫苗目前還處在研究階段，H和F糖蛋白是最佳候選疫苗蛋白，目前已在痘病毒、腺病毒、新城疫病毒以及牛皰疹病毒重組的復(fù)制缺陷病毒載體中表達(dá)。

4.1.5 DIVA疫苗。含有遺傳標(biāo)記的重組疫苗能夠區(qū)分自然感染動(dòng)物和疫苗接種動(dòng)物。Parida S等人開發(fā)了重組減毒PPR DIVA活疫苗和DIVAELISA[24]，并在山羊體內(nèi)進(jìn)行安全性和有效性評(píng)估。這兩種DIVA疫苗都是安全有效的，并且與Nigeria 75/1和Sungri 96減毒活疫苗有相似效力。

4.2 防控

目前帶毒動(dòng)物輸入主要是野生動(dòng)物越境與家畜接觸以及進(jìn)口帶毒家畜，沒有發(fā)生過PPR疫情的國家和地區(qū)應(yīng)采取預(yù)防控制措施；已經(jīng)消滅PPR的國家要加強(qiáng)境外輸入的防控，嚴(yán)格限制從流行地區(qū)進(jìn)口牲畜及其動(dòng)物產(chǎn)品。對(duì)于新引入群的動(dòng)物進(jìn)行至少隔離2~3周的檢疫。野生動(dòng)物會(huì)對(duì)本地動(dòng)物構(gòu)成威脅，應(yīng)避免野生動(dòng)物接觸家養(yǎng)動(dòng)物。定期監(jiān)測(cè)易感動(dòng)物，若發(fā)生PPR的臨床癥狀，要將患病動(dòng)物隔離飼養(yǎng)。

完成全球范圍內(nèi)根除PPR的計(jì)劃，還需要對(duì)PPRV在野生動(dòng)物中的傳播機(jī)制進(jìn)行深入研究，防止自然疫源地的形成。在非洲和南亞一些欠發(fā)達(dá)的地區(qū)，他們沒有足夠的資金和技術(shù)支持，所以需要開發(fā)能夠方便使用、檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定準(zhǔn)確、價(jià)格低廉且易操作的檢測(cè)方法，以及無需冷藏的凍干疫苗。在流行地區(qū)，接種疫苗是控制PPR最實(shí)用的方法[25]，為確保特定流行病學(xué)動(dòng)物的傳播控制，需要至少70%的疫苗接種免疫率。提高疫苗覆蓋率，加強(qiáng)風(fēng)險(xiǎn)地區(qū)的疫苗接種，是長久有效保護(hù)易感動(dòng)物健康的有效方法。