陳上永

（壽寧縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，福建 寧德 355500）

轉(zhuǎn)移因子（Transfer Factor,TF）是一種可轉(zhuǎn)移致敏信息并具有特異和非特異性生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，自從Lawrence等于1949年首次發(fā)現(xiàn)結(jié)核菌素陽性供體的活淋巴細(xì)胞（含有TF）可使皮試陰性受體轉(zhuǎn)變?yōu)槠ぴ囮栃砸詠?，TF成為了人類醫(yī)學(xué)和動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。Lawrence等隨后5年的長期研究發(fā)現(xiàn)，從結(jié)核菌素陽性供體的白細(xì)胞中所獲得的可透析物質(zhì)（含有TF）同樣可使皮試陰性受體轉(zhuǎn)變?yōu)槠ぴ囮栃?，同樣具有活淋巴?xì)胞的相同功能，即：活淋巴細(xì)胞及其可透析物質(zhì)均具有轉(zhuǎn)移遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的作用[1~3]。之后，在人類醫(yī)學(xué)中TF被廣泛用于各種感染性疾病、惡性腫瘤、免疫缺陷病的臨床治療，取得了較好的臨床效果。1979年開始，TF被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物醫(yī)學(xué)臨床中，可提高動(dòng)物免疫功能和疫苗免疫效果，具有廣闊的獸醫(yī)臨床應(yīng)用價(jià)值[4~9]。

在TF提高疫苗免疫效果的研究方面，本課題組利用傳代細(xì)胞系建立了TF與狂犬?。≒seudorabies,PR）活疫苗聯(lián)合免疫效果的體外評(píng)價(jià)方法[10]，但是缺少TF與PR活疫苗聯(lián)合免疫的豬體內(nèi)效力研究?；诖?，本研究旨在明確TF提高偽狂犬?。≒seudorabies,PR）活疫苗（Bartha-K61株）免疫豬抗體水平的作用，按照本課題組具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的中國發(fā)明專利[11~14]，以豬脾臟為原料經(jīng)勻漿、細(xì)胞破碎、滅活、微濾、超濾、除菌后制備3批豬脾TF， 通 過ELISA方 法 檢 測PR活 疫 苗（Bartha-K61株）單獨(dú)免疫、與TF聯(lián)合免疫后豬PR病毒（PR Virus,PRV）免疫抗體的動(dòng)態(tài)變化水平，以研究本發(fā)明專利所制備TF對(duì)PR活疫苗免疫效果的影響，為PR的預(yù)防控制和TF的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4~6周齡的PRV gB抗體陰性的健康杜長大仔豬，由福建某豬場提供。

1.2 TF制備

福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物疫病研究室制備并提供3批豬脾TF，具體如下：按照本課題組具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的中國發(fā)明專利[11~14]，以健康豬脾臟為原料，經(jīng)勻漿、細(xì)胞破碎、滅活、微濾、超濾、除菌后 配 制 而 成 ，3批 豬 脾TF分 別 為TF-1、TF-2、TF-3。經(jīng)檢驗(yàn)，所制備3批TF的脫E受體法效力分別為15.8%、16.1%和17.3%，核糖含量分別為62.2 μg/mL、59.5 μg/mL和58.8 μg/mL，多肽含量分別為2.85 mg/mL、2.78 mg/mL和2.98 mg/mL，pH值分別為6.91、6.95和6.94，細(xì)菌內(nèi)毒素含量均不超過10 EU/mL，OD260nm/OD280nm的比值分別為2.21、2.29和2.31（均大于1.9），并且在253 nm處均有最大吸收峰，外源病毒檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、無菌檢驗(yàn)、熱原檢查、蛋白質(zhì)定性檢驗(yàn)、過敏反應(yīng)檢查和安全檢驗(yàn)均合格。

1.3 試劑

PRV gB抗體檢測ELISA試劑盒，購自美國IDEXX公司；PR活疫苗（Bartha-K61株），購自國內(nèi)某生物制品企業(yè)。

1.4 儀器

酶標(biāo)儀為美國Thermo公司產(chǎn)品，型號(hào)為Multiskan MK3。

1.5 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取PRV gB抗體陰性的健康杜長大仔豬50頭，隨機(jī)分為5組，每組均10頭，分別為單獨(dú)免疫組、聯(lián)合免疫組1、聯(lián)合免疫組2、聯(lián)合免疫組3和空白組。其中，單獨(dú)免疫組采用2 mL生理鹽水稀釋1頭份PR活疫苗（Bartha-K61株），進(jìn)行頸部肌肉注射單獨(dú)免疫；聯(lián)合免疫組1、聯(lián)合免疫組2、聯(lián)合免疫組3均分別采用TF-1（2 mL）、TF-2（2 mL）、TF-3（2 mL）稀釋1頭份PR活疫苗（Bartha-K61株），進(jìn)行頸部肌肉注射聯(lián)合免疫；空白組只注射2 mL生理鹽水，見表1。各組豬均分別于免疫前3 d及免疫后第7 d、14 d、28 d、42 d和56 d經(jīng)前腔靜脈采血并分離血清，采用ELISA方法測定PRV免疫抗體的動(dòng)態(tài)變化水平。

表1 試驗(yàn)組設(shè)計(jì)

1.6 PRV免疫抗體水平測定

按照PRV gB抗體檢測ELISA試劑盒說明書進(jìn)行檢測，測定并且記錄各組豬血清樣品和ELISA試劑盒對(duì)照在650 nm處的吸光度值，通過計(jì)算每個(gè)樣品與陰性對(duì)照吸光值的比率（S/N），判定樣品PRV gB抗體水平：當(dāng)S/N≤0.50，樣品判定為PRV gB抗體陽性；當(dāng)0.50＜S/N≤0.60，樣品判定為PRV gB抗體可疑；當(dāng)S/N＞0.60，樣品判定為PRV gB抗體陰性。以PRV gB抗體表示PRV免疫抗體水平，計(jì)算PRV免疫抗體水平陽性率。

2 結(jié)果

結(jié)果顯示（見表2），免疫后第7 d，單獨(dú)免疫組的PRV免疫抗體陽性率為20%，而此時(shí)聯(lián)合免疫組1、聯(lián)合免疫組2和聯(lián)合免疫組3的PRV免疫抗體陽性率分別為60%、60%和50%。免疫后第14 d，單獨(dú)免疫組的PRV免疫抗體陽性率為60%，而此時(shí)聯(lián)合免疫組1、聯(lián)合免疫組2和聯(lián)合免疫組3的PRV免疫抗體陽性率分別為80%、90%和100%。免疫后第28 d，單獨(dú)免疫組、聯(lián)合免疫組1、聯(lián)合免疫組2和聯(lián)合免疫組3的PRV免疫抗體陽性率均為100%。免疫后第42 d，單獨(dú)免疫組的PRV免疫抗體為80%，而此時(shí)聯(lián)合免疫組1、聯(lián)合免疫組2和聯(lián)合免疫組3的PRV免疫抗體陽性率均為100%。免疫后第56 d，單獨(dú)免疫組的PRV免疫抗體陽性率為50%，而此時(shí)聯(lián)合免疫組1、聯(lián)合免疫組2和聯(lián)合免疫組3的PRV免疫抗體陽性率分別為100%、90%和100%。本試驗(yàn)中空白組PRV免疫抗體陽性率始終為0%。結(jié)果表明，免疫后第7 d、14 d、28 d、42 d和56 d，聯(lián)合免疫組的PRV免疫抗體陽性率分別比單獨(dú)免疫組高30%~40%、20%~40%、0%、20%和40%~50%。

表2 PRV抗體陽性率檢測結(jié)果 %

3 結(jié)論

PR是危害我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要疫病，PRV可侵害各種日齡階段的豬，主要引起哺乳仔豬死亡，中大豬呼吸道病，母豬返情、屢配不孕、流產(chǎn)、木乃伊胎、死胎，以及公豬睪丸腫脹或萎縮、不育等[15]。疫苗免疫是PR防控的主要方法，目前PR基因缺失弱毒苗和PR滅活苗在獸醫(yī)臨床上被廣泛應(yīng)用。其中，PR活疫苗（Bartha-K61株）就是歷史最悠久、應(yīng)用最廣泛的PR疫苗之一，被成功用于美國和歐盟的PR凈化。但是，2011年以來我國多省市出現(xiàn)了以哺乳仔豬神經(jīng)癥狀進(jìn)而導(dǎo)致大量死亡、母豬死胎、流產(chǎn)為主要特征的PR暴發(fā)，許多免疫PR活疫苗（Bartha-K61株）的規(guī)模化豬場也時(shí)有發(fā)生，這些給我國PR防控提出了新的挑戰(zhàn)[15~17]。TF是一種新型免疫增強(qiáng)劑，具有無抗原性、無毒、不引起過敏反應(yīng)、安全等優(yōu)點(diǎn)，已有研究顯示，TF可增強(qiáng)機(jī)體免疫功能和疫苗免疫水平[18~26]。本研究結(jié)果顯示，免疫后第7 d、14 d、28 d、42 d和56 d，TF可將PR活疫苗（Bartha-K61株）免疫豬的PRV免疫抗體陽性率分別提高30%~40%、20%~40%、0%、20%和40%~50%。結(jié)果表明，TF可以提高PR活疫苗（Bartha-K61株）的免疫抗體水平。

（感謝：福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院和派生特（福州）生物科技有限公司共建福建省動(dòng)物保健與食品安全應(yīng)用技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心的徐磊教授、劉毅發(fā)獸醫(yī)師、鐘云欽獸醫(yī)師、蔣鈴獸醫(yī)師和謝杼倢獸醫(yī)師對(duì)實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)和幫助!）