趙燕妮， 韓 潔， 周寧寧， 趙潔妤， 劉 歡*

(1.陜西科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院 陜西農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究院, 陜西 西安 710021； 2.河北環(huán)境工程學(xué)院 環(huán)境工程系, 河北 秦皇島 066102)

0 引言

溶藻弧菌(Vibrio.alginolyticus)是一類含有鞭毛的革蘭氏陰性弧菌，廣泛生存繁殖于世界各地的沿海、溪流及水生等生態(tài)環(huán)境中，能夠感染海洋魚類、貝類、蟹類以及蝦類等多種海水養(yǎng)殖動(dòng)物[1-6]，出現(xiàn)細(xì)菌性出血、貧血及腮部潰爛等病癥[4,7]，從而給海水養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[8].溶藻弧菌還是一種典型的人-畜-魚共患的高致病性微生物，是細(xì)菌性的食源性致病菌，會(huì)導(dǎo)致人類中耳炎、創(chuàng)傷性感染，食用其某些菌株感染的水產(chǎn)食物還會(huì)引發(fā)人類食物中毒、腸道炎等疾病[9]，直接對(duì)人類生命健康造成嚴(yán)重威脅.有報(bào)道顯示在1988～2012年期間感染溶藻弧菌病例達(dá)1 331例，其中高達(dá)96%的病例來自沿海國(guó)家[10].目前，抗生素是應(yīng)對(duì)溶藻弧菌病害的主要防治手段，然而，抗生素的濫用不僅會(huì)造成細(xì)菌的耐藥性增強(qiáng)，而且殘留抗生素跟隨海產(chǎn)品進(jìn)入人體，也會(huì)引發(fā)食品安全問題.因此，開發(fā)新型安全有效海洋病原菌抑菌劑是目前亟待解決的問題.

脂肪酸作為細(xì)胞膜的重要組成部分，與細(xì)胞識(shí)別、種族特異性、細(xì)胞免疫、毒力、耐藥性等有著極為密切的關(guān)系.近年來的研究發(fā)現(xiàn)，脂肪酸(FAs)及其衍生物可以選擇性抑制微生物病原體的生物被膜形成，改變細(xì)胞膜流動(dòng)性、干擾細(xì)胞電子傳遞鏈系統(tǒng)、產(chǎn)生有毒降解產(chǎn)物.Kim等[11]發(fā)現(xiàn)鋸棕櫚油可抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157∶H7等多種微生物生物膜的形成，轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)月桂酸和肉豆蔻酸可抑制大腸桿菌生物膜相關(guān)基因(csgAB、fimH和flhD)的表達(dá).Ryan等[12]和zhou等[13]發(fā)現(xiàn)野油菜黃單胞菌產(chǎn)生的脂肪酸(順-11甲基-2-十二烯酸)，是可擴(kuò)散信號(hào)因子(DSF)家族的第一個(gè)成員，該家族被發(fā)現(xiàn)可通過控制合成胞外酶(包括參與胞外多糖降解的內(nèi)葡聚糖酶)來誘導(dǎo)自身生物膜的分散.棕櫚酸作為一種重要的脂肪酸，已被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)認(rèn)證是安全的食品成分并且被批準(zhǔn)可用作食品添加劑，在食品中作為潤(rùn)滑劑、粘合劑、消泡劑和作為其他“食品級(jí)”添加劑中的復(fù)合物.我國(guó)GB2760-89規(guī)定，其也可用于配制各種食用香料、消泡劑和其他食品添加劑的原料.這意味著棕櫚酸已經(jīng)被認(rèn)可作為食品添加劑使用.已有研究發(fā)現(xiàn)棕櫚酸可抑制熱帶假絲酵母的生物膜、酶活性等毒力因子[14].然而目前尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌的抑菌效果及作用機(jī)制的研究工作.

本文通過測(cè)定棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌的最小抑菌濃度、最小殺菌濃度以及其對(duì)溶藻弧菌生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞膜的影響，同時(shí)通過掃描電鏡觀察細(xì)胞表面形態(tài)變化來探究棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌的抑制作用及可能機(jī)理，旨在為棕櫚酸對(duì)海產(chǎn)品病害防控技術(shù)的開發(fā)奠定理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株及培養(yǎng)條件

(1)菌株：本研究所用的菌株為溶藻弧菌EPGS(菌種保藏號(hào) CCTCC No.AB209306)，由華東理工大學(xué)阿華生物工程研究所提供，溶藻弧菌長(zhǎng)期儲(chǔ)存于-80 ℃.

(2)培養(yǎng)條件：實(shí)驗(yàn)時(shí)取菌種1%的接種量接種于LBS液體培養(yǎng)基(3%(w/v)NaCl，1%(w/v)Tryptone，0.5%(w/v)Yeast Extract)，加入0.1%(v/v)的氨芐青霉素，于200 r/min，30 ℃條件下活化復(fù)蘇培養(yǎng)12 h，本研究中所有實(shí)驗(yàn)操作前，溶藻弧菌均作此上活化培養(yǎng).

1.1.2 試劑及儀器

(1)主要材料與試劑

棕櫚酸(CAS 57-10-3)，購(gòu)買于上海泰坦科技股份有限公司；NaCl，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；Tryptone(LP0042)、Yeast Extract(LP0021)，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；氨芐青霉素，北京博奧托達(dá)科技有限公司；硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；葡萄糖(Glu)測(cè)試盒、丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒(TBA法)，南京建成生物科技有限公司；磷酸緩沖溶液，陜西中暉赫彩生物醫(yī)藥科技有限公司；戊二醛，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙酸異戊酯，福晨化學(xué)試劑有限公司(天津).

(2)主要儀器與設(shè)備

LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；ZD-85氣浴恒溫振蕩器，常州金壇良友儀器有限公司；H-1850R高速離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；JA2003電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；HWS-24恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；VORTEX-5渦旋混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；SW-CJ-IFD單人單面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；Varioskan Flash全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀，賽默飛世爾科技有限公司(芬蘭)；Verios 460場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡，美國(guó)FEI公司；DDS-307電導(dǎo)儀，佑科儀器有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

所有實(shí)驗(yàn)均以未加棕櫚酸的溶藻弧菌培養(yǎng)液為對(duì)照組.

1.2.1 棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌的最小抑菌濃度測(cè)定

最小抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)指在體外培養(yǎng)菌體24 h后能抑制培養(yǎng)基內(nèi)病原菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度.取-80 ℃甘油管凍存的溶藻弧菌，按1%的接種量接種于LBS液體培養(yǎng)基中，加入1%的氨芐青霉素，搖床活化培養(yǎng)12 h(30 ℃，200 r/min)，使菌液最終濃度約為108～109CFU/mL備用(4 ℃保存)，本實(shí)驗(yàn)采用二倍稀釋法對(duì)棕櫚酸擾動(dòng)溶藻弧菌的MIC進(jìn)行測(cè)定，具體操作如下：先將棕櫚酸溶解于無(wú)水乙醇中，制備成10 mg/mL的母液，之后加入不同毫升數(shù)的棕櫚酸母液至LBS培養(yǎng)基中，使棕櫚酸最終的濃度為0 mg/mL、0.037 5 mg/mL、0.075 mg/mL、0.15 mg/mL、0.3 mg/mL、0.6 mg/mL、1.2 mg/mL，再按1%(v/v)接種量接入活化后的溶藻弧菌搖勻，將含有棕櫚酸的LBS菌懸液移植24孔板中，同時(shí)以不含棕櫚酸的菌懸液作為本實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組.將24孔板置于30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，觀察菌體生長(zhǎng)情況.培養(yǎng)液澄清，肉眼不可見菌體時(shí)所加入的棕櫚酸最低濃度即為棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌的MIC.

1.2.2 棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌的最小殺菌濃度測(cè)定

稱取海洋弧菌鑒別培養(yǎng)基粉末硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂(Thiosulfate citrate bile sucrose，TCBS)8.9 g，溶解至100 mL蒸餾水中煮沸，冷卻至50 ℃，倒入無(wú)菌培養(yǎng)板(固體培養(yǎng)基).經(jīng)章節(jié)1.2.1測(cè)定實(shí)驗(yàn)得出MIC后，于LBS液體培養(yǎng)基中加入不同毫升數(shù)的棕櫚酸，使得棕櫚酸最終的濃度分別為0、1/2 MIC、MIC、2 MIC、4 MIC，按1%的接種量加入活化后溶藻弧菌，搖床培養(yǎng)9 h(30 ℃，200 r/min)之后，將菌液劃線至TCBS固體培養(yǎng)板上，倒置培養(yǎng)24～36 h，觀察菌落生長(zhǎng)，將未有溶藻弧菌菌落生長(zhǎng)的最低濃度定為最小殺菌濃度(Minimum Bactericidal Concentration，MBC).

1.2.3 棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌生長(zhǎng)曲線的影響

經(jīng)章節(jié)1.2.1、1.2.2測(cè)定實(shí)驗(yàn)得出MIC、MBC后，對(duì)以上不同濃度的棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行測(cè)定.將經(jīng)活化后的溶藻弧菌菌懸液按1%的接種量加入LBS液體培養(yǎng)基中，并按0.1%的加入氨芐青霉素，搖床(30 ℃，200 r/min)培養(yǎng)12 h，每小時(shí)取200 uL于96孔板中，測(cè)定600 nm處的吸光值，并繪制生長(zhǎng)曲線.

1.2.4 棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌的細(xì)胞膜完整性的影響

(1)棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌電解質(zhì)外泄的影響

取活化后的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)3 h后，加入0、MIC、2 MIC濃度的棕櫚酸，繼續(xù)培養(yǎng)6 h(30 ℃，200 r/min)，之后取1 mL菌液于6 000 r/min，4 ℃條件下離心5 min，使用電導(dǎo)率儀測(cè)定上清液的電導(dǎo)率，以去離子水作為空白對(duì)照.

(2)棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌胞外葡萄糖的影響

取活化后的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)3 h后，加入0、MIC、2 MIC濃度的棕櫚酸，繼續(xù)培養(yǎng)6 h(30 ℃，200 r/min)，之后取1 mL菌液于6 000 r/min，4 ℃條件下離心5 min，使用葡萄糖試劑盒測(cè)定胞外葡萄糖含量.

(3)棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌核酸、蛋白質(zhì)泄露的影響

取活化后的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)3 h后，加入0、MIC、2 MIC濃度的棕櫚酸，繼續(xù)培養(yǎng)6 h(30 ℃，200 r/min)，之后取1 mL菌液于8 000 r/min，4 ℃條件下離心3 min，在波長(zhǎng)分別為260 nm(胞外核酸)、280 nm(胞外蛋白)處測(cè)定上清液的吸光值，以不加棕櫚酸的菌液上清作為對(duì)照.

(4)棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌丙二醛含量(Malondialdehyde，MDA)的影響

取活化后的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)3 h后，加入0、MIC、2 MIC濃度的棕櫚酸，繼續(xù)培養(yǎng)6 h(30 ℃，200 r/min)，之后取1 mL菌液于4 000 r/min，4 ℃條件下離心3 min，使用丙二醛試劑盒測(cè)定上清液中MDA的含量.

(5)棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌胞內(nèi)活性氧(Reactiveoxygen species，ROS)含量的影響

取活化后的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)3 h后，加入0、MIC、2 MIC濃度的棕櫚酸，繼續(xù)培養(yǎng)6 h(30 ℃，200 r/min)，之后取1 mL菌液于5 000 r/min，4 ℃條件下離心5 min，棄上清加入1 mL 10 umol/L的2,7—二氯二氫熒光素二乙酸酯溶液(2，7-Dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)，于37 ℃下培養(yǎng)20 min后去除上清液，并用磷酸緩沖溶液(PBS)洗滌菌體3次，以增強(qiáng)測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確性.測(cè)定細(xì)菌懸浮液的熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm).

1.2.5 棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌細(xì)胞形態(tài)的影響

取活化后的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)3 h后，加入0、MIC、2 MIC濃度的棕櫚酸，繼續(xù)培養(yǎng)6 h(30 ℃，200 r/min)，之后取1 mL菌液離心棄上清，加入1 mL 2.5%(v/v)戊二醛水溶液，于4 ℃冰箱靜置2～4 h.經(jīng)戊二醛固定后于8 000 r/min，4 ℃條件下離心3 min，去除上清液并加入1 mL PBS振蕩混勻10 min，再離心3 min(8 000 r/min，4 ℃)棄上清，洗脫3次除去菌體表面的培養(yǎng)液，之后依次用30%、60%、80%、100%(v/v)乙醇梯度洗脫(期間換梯度離心8 000 r/min，4 ℃，3 min)，棄上清加入1 mL乙酸異戊酯混勻，置于4 ℃冰箱浸泡30 min或過夜.離心去除上清液，菌體在干燥箱70 ℃下干燥3～4 h至固體粉末狀.最后將粉末狀菌體均勻涂抹于導(dǎo)電膠并裝載在載物臺(tái)，噴金后在高分辨場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡下進(jìn)行觀察拍照.

1.3 數(shù)據(jù)分析

本研究中所有試驗(yàn)重復(fù)三次，所得數(shù)據(jù)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示.使用GraphPad Prism 8.0.2軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并且使用T檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行顯著性差異分析(“*”表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組有顯著差異(0.01

2 結(jié)果與討論

2.1 棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌的最小抑菌濃度研究

溶藻弧菌在最適培養(yǎng)條件下，經(jīng)棕櫚酸處理后，測(cè)定發(fā)現(xiàn)棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌的MIC為0.6 mg/mL.當(dāng)棕櫚酸的濃度低于0.6 mg/mL時(shí)，菌體經(jīng)24 h的生長(zhǎng)繁殖，培養(yǎng)液出現(xiàn)不同程度的渾濁；當(dāng)棕櫚酸濃度達(dá)到或高于0.6 mg/mL時(shí)，溶藻弧菌經(jīng)24 h的培養(yǎng)未出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)菌生長(zhǎng)，且培養(yǎng)液澄清透亮，與不加溶藻弧菌的空白組基本一致.結(jié)果表明棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌有一定的抑菌作用，其MIC為0.6 mg/mL.基于所得的MIC，進(jìn)一步探究棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌的抑菌作用.

2.2 棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌的最小殺菌濃度研究

經(jīng)上述實(shí)驗(yàn)得知，棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌具有一定的抑菌作用，本文進(jìn)一步探究其對(duì)溶藻弧菌的殺菌作用.將經(jīng)不同濃度棕櫚酸(CK、1/2 MIC、MIC、2 MIC、4 MIC)處理后的溶藻弧菌菌懸液均勻劃線于TCBS瓊脂平板上進(jìn)行菌落觀察，將TCBS平板倒置于恒溫培養(yǎng)箱(30 ℃)24 h，其結(jié)果如圖1所示.

圖1 棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌的最小殺菌濃度研究

由圖1可知，未加棕櫚酸的對(duì)照CK組，溶藻弧菌長(zhǎng)滿了平板，且菌落密集；經(jīng)1/2 MIC濃度的棕櫚酸處理后，溶藻弧菌亦有大量生長(zhǎng)，形成了較為密集的菌落；當(dāng)濃度為MIC時(shí)，平板上仍有小部分菌體生長(zhǎng)；而當(dāng)棕櫚酸濃度為2 MIC和4 MIC時(shí)，TCBS瓊脂板上未出現(xiàn)肉眼可見的菌落生長(zhǎng).故可確定棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌的MBC為2 MIC，即MBC=2 MIC=1.2 mg/mL.為進(jìn)一步探究棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌的抑菌作用，本文選擇CK(未加棕櫚酸)、MIC、2 MIC三組進(jìn)行后續(xù)研究.

2.3 棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌生長(zhǎng)曲線的研究

生長(zhǎng)曲線是根據(jù)培養(yǎng)物中存在的活細(xì)胞數(shù)量確定的.棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌的生長(zhǎng)曲線(所有實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的起始OD600值≈0)影響如圖2所示.

圖2 棕櫚酸影響下溶藻弧菌的生長(zhǎng)曲線

由圖2可知，當(dāng)棕櫚酸濃度低于MIC時(shí)，溶藻弧菌的生長(zhǎng)在0～3 h為遲緩期，菌體接入LBS后，菌體體積增大、代謝活躍，對(duì)新環(huán)境短暫的適應(yīng)，其中不適應(yīng)的菌體因轉(zhuǎn)種而死亡，即表明在遲緩期低于MIC棕櫚酸濃度下的菌體未出現(xiàn)明顯差異；在3～9 h內(nèi)溶藻弧菌進(jìn)入對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，活菌數(shù)直線上升，不同濃度的棕櫚酸暴露，溶藻弧菌的生長(zhǎng)曲線出現(xiàn)明顯梯度降低趨勢(shì)，即棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌的生長(zhǎng)曲線有明顯影響；9～12 h內(nèi)，溶藻弧菌進(jìn)入穩(wěn)定期(OD600≈1.56)，該期的生長(zhǎng)菌群總數(shù)幾乎處于平坦階段，12 h時(shí)對(duì)照組的OD600≈2.04，1/2 MIC組的OD600≈1.20，菌群總數(shù)約降低了0.59倍，即表明在棕櫚酸濃度低于MIC處，其對(duì)溶藻弧菌亦有明顯的影響作用.當(dāng)棕櫚酸濃度達(dá)或高于MIC時(shí)，溶藻弧菌在整個(gè)檢測(cè)周期中未出現(xiàn)菌體增長(zhǎng)，即溶藻弧菌完全被抑制.所有的生長(zhǎng)結(jié)果表明：棕櫚酸嚴(yán)重干擾了溶藻弧菌的生長(zhǎng)曲線.

2.4 棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌細(xì)胞膜完整性的影響

基于對(duì)生長(zhǎng)曲線的測(cè)定，菌體在對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期(3～9 h)內(nèi)細(xì)菌形態(tài)、染色、生物活性都很典型，對(duì)外界環(huán)境因素的作用敏感，因此在菌體生長(zhǎng)9 h時(shí)研究細(xì)菌性狀最好，且抑菌作用在該時(shí)期的細(xì)菌效果最佳.

微生物細(xì)胞膜的完整性是保證其維持自身新陳代謝等正常生理活動(dòng)的重要因素.目前，對(duì)于脂肪酸的抑菌機(jī)理大部分研究認(rèn)為，其主要以細(xì)胞膜為靶點(diǎn)的作用機(jī)理[11].由于細(xì)胞膜是控制細(xì)胞與外界進(jìn)行物質(zhì)交換的主要屏障，細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)可被細(xì)胞膜有選擇地控制進(jìn)出，避免胞內(nèi)物質(zhì)外泄以及胞外物質(zhì)非正常進(jìn)入.細(xì)胞膜作為大部分抑菌劑的作用靶點(diǎn)，其功能性質(zhì)隨抑菌劑發(fā)生變化.抑菌劑處理菌體會(huì)引起細(xì)胞膜流動(dòng)性變差，細(xì)胞膜的選擇透過能力被破壞，胞內(nèi)例如K+、DNA、RNA等多種內(nèi)容物流出，導(dǎo)致細(xì)胞自身調(diào)控失調(diào)、細(xì)胞破裂、甚至死亡.Zhang等[15]發(fā)現(xiàn)經(jīng)抑菌劑-多糖干擾后菌液的電導(dǎo)率、蛋白質(zhì)等呈濃度依賴性增加，證明了該多糖對(duì)該菌的抑制作用，即表明通過測(cè)定電導(dǎo)率等指標(biāo)可監(jiān)測(cè)細(xì)胞膜功能性質(zhì)及抑菌劑的抑菌作用.

因此，為了進(jìn)一步明確棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌細(xì)胞膜通透性、選擇透過性等功能的破壞程度，本研究使用電導(dǎo)率研究棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌細(xì)胞膜的通透性影響，監(jiān)測(cè)棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌胞外核酸、胞外蛋白質(zhì)含量的影響，分別利用葡萄糖試劑盒和丙二醛試劑盒對(duì)胞外葡萄糖和丙二醛進(jìn)行測(cè)定，以及對(duì)胞內(nèi)活性氧的監(jiān)測(cè).

2.4.1 棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌電解質(zhì)外泄的影響

細(xì)胞膜是微生物防止細(xì)胞外的有害物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的重要屏障，其保證了細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài).當(dāng)細(xì)胞膜被破壞，導(dǎo)致其通透性增大，大量的細(xì)胞內(nèi)容物外泄，從而影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)代謝[16].使用電導(dǎo)率儀檢測(cè)菌液上清的電導(dǎo)率變化研究棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌電解質(zhì)外泄的影響，如圖3所示.

圖3 棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌電導(dǎo)率的影響

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著棕櫚酸的濃度增加，處理組的電導(dǎo)率相比對(duì)照組有明顯的提高，MIC與2 MIC兩組的電導(dǎo)率相比較對(duì)照組隨棕櫚酸濃度的增大，電導(dǎo)率成正相關(guān)變化，分別增加了約4.36倍、5.71倍.電導(dǎo)率的增加可能是因?yàn)樽貦八嵋鹑茉寤【?xì)胞膜損傷，改變了菌體細(xì)胞膜的通透性、完整性，直接導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)除正常胞內(nèi)外運(yùn)輸?shù)碾x子以外(如K+、Na+、PO43-等)的離子大量流出，使電導(dǎo)率增大，從而影響了溶藻弧菌菌體的正常生長(zhǎng)，達(dá)到了抑菌的目的.Zhou等[17]通過測(cè)定細(xì)胞膜的膜電位發(fā)現(xiàn)紫蘇精油破壞了糞腸球菌細(xì)胞膜的完整性，表明膜電位可用來判斷細(xì)胞膜的完整性：膜電位增加，細(xì)胞膜完整性降低.

2.4.2 棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌胞外葡萄糖含量的影響

葡萄糖主要參與細(xì)胞的能量代謝，一般情況下細(xì)胞外的葡萄糖含量極少通過主動(dòng)運(yùn)輸方式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi).當(dāng)細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)時(shí)，大部分胞內(nèi)葡萄糖會(huì)泄露到細(xì)胞外.經(jīng)不同濃度棕櫚酸處理的溶藻弧菌胞外葡萄糖含量的變化結(jié)果如圖4所示.

圖4 棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌胞外葡萄糖的影響

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)棕櫚酸處理的MIC組、2 MIC組的葡萄糖含量隨棕櫚酸濃度的增加呈濃度依賴性增加，分別增加了4.17倍、4.83倍.由此可見，隨著棕櫚酸濃度增加，溶藻弧菌的細(xì)胞膜被破壞，胞內(nèi)的葡萄糖外泄至胞外.棕櫚酸擾動(dòng)溶藻弧菌使菌體胞內(nèi)的葡萄糖外泄，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)正常的能量代謝受到嚴(yán)重干擾，從而影響菌體正常生命活動(dòng)，達(dá)到一定的抑制干擾作用.

2.4.3 棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌胞外核酸、胞外蛋白的影響

細(xì)胞膜是保護(hù)細(xì)胞的第一道屏障，當(dāng)抑制劑處理細(xì)胞后，微生物的天然屏障受到損傷，從而造成細(xì)菌內(nèi)容物包括核酸、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)外泄.核酸和蛋白在260 nm、280 nm處有很強(qiáng)的紫外吸收峰.因此，本研究使用全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀檢測(cè)細(xì)胞外核酸含量、蛋白含量變化，以探究棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌核酸、蛋白質(zhì)外泄的影響，結(jié)果如圖5、圖6所示.

圖5 棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌胞外核酸的影響

圖6 棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌胞外蛋白的影響

由圖可知，經(jīng)棕櫚酸處理的MIC組、2 MIC組的胞外核酸(分別增加了2.18倍、2.56倍)及胞外蛋白(分別增加了1.91倍、2.49倍)含量遠(yuǎn)高于CK組.且隨棕櫚酸濃度的增大，胞外核酸和胞外蛋白質(zhì)的含量呈正相關(guān)增長(zhǎng).由此可見，隨著棕櫚酸濃度增加，溶藻弧菌的細(xì)胞膜被破壞，胞內(nèi)的核酸和大分子蛋白外泄至胞外.推測(cè)棕櫚酸影響了溶藻弧菌細(xì)胞膜的通透性和完整性，使菌體胞內(nèi)核酸、胞內(nèi)蛋白質(zhì)外泄，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)正常的生命代謝受到嚴(yán)重干擾，從而影響菌體正常生命活動(dòng)，達(dá)到一定的干擾作用.王虹懿等[18]通過檢測(cè)胞外核酸、胞外蛋白質(zhì)外滲情況，發(fā)現(xiàn)綠原酸與Ⅲ型細(xì)菌素復(fù)配使熒光假單胞菌的膜通透性增強(qiáng)，表明可通過監(jiān)測(cè)胞外核酸、胞外蛋白質(zhì)來監(jiān)測(cè)細(xì)胞膜的通透性.

2.4.4 棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌丙二醛含量的影響

MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物之一，是監(jiān)測(cè)細(xì)胞膜通透性的主要指標(biāo)，它的產(chǎn)生能加劇細(xì)胞膜的損傷[19].本研究利用丙二醛試劑盒對(duì)對(duì)照組及經(jīng)棕櫚酸處理的實(shí)驗(yàn)組的丙二醛進(jìn)行測(cè)定，以檢測(cè)棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌細(xì)胞膜的影響，結(jié)果如圖7所示.

圖7 棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌丙二醛的影響

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，經(jīng)棕櫚酸處理的MIC組、2 MIC組的丙二醛含量分別增加了1.69倍、2.03倍，呈劑量依賴性增加.以上結(jié)果說明棕櫚酸可攻擊溶藻弧菌細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞膜過氧化損傷.Dai等[20]通過檢測(cè)丙二醛含量，發(fā)現(xiàn)經(jīng)冷等離子體處理使鼠傷寒沙門氏菌細(xì)胞膜的氧化損傷，表明丙二醛含量增高，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞.

2.4.5 棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌胞內(nèi)活性氧的影響

ROS具有較強(qiáng)的氧化活性，過量的ROS會(huì)氧化損傷菌體細(xì)胞膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)，從而破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)[21].Czaika等[22]發(fā)現(xiàn)ROS對(duì)金黃色葡萄球菌和耐甲氧西林菌有較強(qiáng)的殺滅作用，表明ROS可加快細(xì)菌凋亡.本實(shí)驗(yàn)測(cè)定不同棕櫚酸處理后溶藻弧菌細(xì)胞內(nèi)的活性氧含量，結(jié)果如圖8所示.

圖8 棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌胞內(nèi)活性氧的影響

與對(duì)照組相比，經(jīng)棕櫚酸處理的MIC組、2 MIC組的活性氧含量分別增加了1.08倍、1.25倍，且呈劑量依賴性.結(jié)果說明棕櫚酸可提高胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)量，ROS的積累表明：棕櫚酸可顯著抑制溶藻弧菌的代謝活性并誘導(dǎo)氧化應(yīng)激從而導(dǎo)致細(xì)胞膜的過氧化損傷.

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌細(xì)胞膜完整性的破壞情況，棕櫚酸通過破壞溶藻弧菌細(xì)胞膜的完整，影響菌體正常的生命代謝活動(dòng)，從而抑制了溶藻弧菌的生長(zhǎng)繁殖.

2.5 高分辨場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡觀察棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌細(xì)胞形態(tài)的影響

通過章節(jié)2.3的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)棕櫚酸嚴(yán)重破壞了溶藻弧菌細(xì)胞膜的完整性和通透性，引起細(xì)胞內(nèi)容物外泄.為更加直觀的觀察棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌細(xì)胞形態(tài)的影響，通過場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡觀察經(jīng)不同濃度棕櫚酸處理后溶藻弧菌細(xì)胞形態(tài)的變化，如圖9所示.

圖9 掃描電鏡觀測(cè)棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌細(xì)胞形態(tài)的影響

由圖9可知，未經(jīng)棕櫚酸處理的溶藻弧菌呈典型的弧菌形態(tài)(短桿狀)，細(xì)胞膜保持完整，菌體光滑飽滿，邊緣明顯且圓滑.當(dāng)加入棕櫚酸之后，溶藻弧菌的細(xì)胞形態(tài)遭受到一定的破壞，細(xì)菌菌體表面呈現(xiàn)明顯的凹凸不平、干扁殘缺、皺縮、甚至破裂等現(xiàn)象，MIC濃度棕櫚酸處理后，幾乎所有的細(xì)胞呈現(xiàn)出細(xì)胞不完整、褶皺的現(xiàn)象.隨棕櫚酸濃度增大，細(xì)胞損傷更加嚴(yán)重，已喪失溶藻弧菌固有的棒狀弧菌形態(tài)；經(jīng)2 MIC棕櫚酸作用后菌體細(xì)胞嚴(yán)重受損，出現(xiàn)畸形，在觀察視野下幾乎全部細(xì)胞呈高度破壞狀態(tài).溶藻弧菌細(xì)胞的受損程度和數(shù)量隨棕櫚酸濃度的增加而增大.以上結(jié)果表明，棕櫚酸能夠破壞溶藻弧菌細(xì)胞壁膜的結(jié)構(gòu)以及完整性，進(jìn)而抑制菌體正常生長(zhǎng)甚至凋亡.

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌有較良好的抑制作用，能夠使細(xì)胞發(fā)生破損、坍塌，影響細(xì)胞膜的完整性和通透性等,進(jìn)而破壞細(xì)胞的正常形態(tài)，導(dǎo)致核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子的泄漏，致使細(xì)胞穩(wěn)態(tài)被破壞使菌體凋亡.本研究結(jié)果可為新型、高效的天然弧菌抑菌劑的開發(fā)提供理論依據(jù).本文僅從抑菌活性角度初步解析棕櫚酸的抑菌作用，后期還需從棕櫚酸對(duì)溶藻弧菌毒力因子影響的角度開展深入研究，探究其抑菌機(jī)制.