唐 樂， 李 宏， 何麗麗， 牛海文， 羅 琴

新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院呼吸神經(jīng)內(nèi)科，烏魯木齊 830011

流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，中國肺癌的死亡率較以往30年增加了約464.84%[1]。盡管在肺癌研究及診療方面取得了許多進展，但仍有較多患者確診時已處于臨床終末期。大約80%～85%肺癌患者的病理類型為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)[2]，研究NSCLC能明顯改善肺癌患者群體臨床預后。microRNA(miRNA)是一類能與目標基因靶點序列相互結(jié)合，作用類似于siRNA的內(nèi)源性小分子非編碼RNA，其可抑制目標靶基因的表達[3]。miRNA由高等真核生物基因組編碼，可靶向約60%的基因組基因。研究miRNA對NSCLC有重要臨床意義[4]。既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-19b-3p與包括NSCLC在內(nèi)的多種癌癥相關(guān)，可通過多種信號途徑發(fā)揮抑癌或促癌作用，但其在惡性腫瘤中的表達趨勢及作用不一，分子機制存在爭議[5-6]。

競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)，是一種能夠競爭性結(jié)合RNA的作用元件。長鏈非編碼RNA(lncRNA)可競爭性結(jié)合miRNA并且充當ceRNA調(diào)控mRNA的表達[7]。轉(zhuǎn)移相關(guān)性肺腺癌轉(zhuǎn)錄本1(MALAT1)是NSCLC中研究最為廣泛的一種癌類lncRNA，其在包括NSCLC在內(nèi)的多種惡性腫瘤中表達明顯增高[8]。例如，MALAT1在缺氧條件下表達增高并促進乳腺癌細胞增殖、分化及血管形成，此效應主要由缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)介導[9]。最近有研究表明，缺氧誘導下的血管內(nèi)皮細胞中miR-19b-3p和HIF-1α之間存在靶向關(guān)系，MALAT1可海綿吸附miR-19b-3p，且使HIF-1α呈缺氧時間依賴性升高[10]。本課題組對比NSCLC癌組織與癌旁組織發(fā)現(xiàn)，MALAT1在患者癌組織中高表達，而miR-19b-3p低表達。然而目前在對NSCLC的研究中，尚未明確MALAT1/miR-19b-3p/HIF-1α三者之間是否存在ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本文旨在研究MALAT1是否與miR-19b-3p之間存在海綿吸附作用并調(diào)控HIF-1α/VEGF分子軸參與NSCLC發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象及材料

選取2019年1月～2019年12月期間新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院呼吸神經(jīng)內(nèi)科收治的經(jīng)手術(shù)病理確診為NSCLC的肺癌組織及對應癌旁組織標本各15例。其中男性9例、女性6例，年齡55～73歲，平均年齡(63.27±5.65)歲；鱗癌4例、腺癌11例；臨床分期Ⅰ期2例、Ⅱ期4例、Ⅲ期7例、Ⅳ期2例(以上臨床標本使用均獲知情同意)。人正常支氣管上皮細胞系16HBE及人非小細胞肺癌細胞系NCI-H1299、NCI-H1650、SPC-A1、A549細胞來源于普諾賽生物公司；MALAT1、HIF-1α、VEGF引物，miR-19b-3p模擬物(mimic)及其陰性對照(NC mimic)，MALAT1 siRNA(si-MALAT1)以及陰性對照(si-NC)由吉瑪基因公司構(gòu)建；Anti-HIF-1α抗體由Abcam公司提供，Anti-VEGF抗體由博奧森公司提供，二抗山羊抗兔IgG H&L(HRP)和山羊抗小鼠IgG H&L(HRP)購自Abcam公司；CCK-8細胞增殖試劑盒由全式金生物公司、Transwell小室由Corning公司、凋亡試劑盒由BD公司提供。

1.2 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

細胞在完全F-12K培養(yǎng)液，37℃、飽和濕度、5%CO2條件下培養(yǎng)。根據(jù)轉(zhuǎn)染說明書進行轉(zhuǎn)染實驗。分別設(shè)miR-19b-3p mimic組、NC mimic組、si-MALAT1組、si-NC組、空白對照組，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)細胞48 h。

1.3 RNA提取和實時熒光定量PCR

采用Trizol從組織或細胞中提取總RNA，用5X All-In-One RT MasterMix進行RNA逆轉(zhuǎn)錄，用miRNA熒光定量PCR試劑盒進行miRNA逆轉(zhuǎn)錄，以cDNA為模板在熒光定量PCR儀(ABI 7500 FAST)上進行qRT-PCR反應。MALAT1、HIF-1α、及VEGF使用GAPDH為內(nèi)參，miR-19b-3p使用U6為內(nèi)參。采用2-ΔΔCt法計算相對表達量。引物序列詳見表1。

表1 引物序列表Table 1 List of primer sequences

1.4 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測

按1.2項轉(zhuǎn)染分組，按Western blot法將細胞提取的總蛋白凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。一抗兔抗HIF-1α抗體、兔抗VEGF抗體孵育過夜，二抗山羊抗兔IgG H&L(HRP)室溫孵育1 h，ELC化學發(fā)光顯影。β-actin作為內(nèi)參對照。Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.5 CCK-8檢測細胞增殖

按1.2項轉(zhuǎn)染分組后，按CCK-8方法測定細胞的增殖，各組重復5孔。每孔加入100 μL 10% CCK-8試劑，1 h后用Bio-Rad xMarkTM酶標儀測定450 nm處的吸光度(A)值。

1.6 細胞周期檢測

按1.2項轉(zhuǎn)染分組后，重懸細胞過200目篩網(wǎng)制成單細胞懸液。4℃避光孵育30 min。用流式細胞儀檢測紅色熒光及光散射(激發(fā)波長488 nm)。

1.7 細胞凋亡檢測

按1.2項轉(zhuǎn)染分組后，吸出細胞瓶內(nèi)培養(yǎng)液及2次PBS洗滌液至離心管內(nèi)(內(nèi)含凋亡或壞死細胞)，胰酶消化、離心、重懸、過篩，制備單細胞懸液。加入5 μL Annexin Ⅴ-PE試劑和10 μL 7-AAD試劑，在4℃條件下使處理后的單細胞懸液避光10 min。采用LSRFortessa流式細胞儀在30 min內(nèi)盡快檢測細胞凋亡比率。

1.8 細胞遷移及侵襲檢測

按1.2項轉(zhuǎn)染分組后，重懸并調(diào)整細胞懸液至5×105mL；將基質(zhì)膠包埋在Transwell小室底部中央；取100 μL細胞懸液接種至無基質(zhì)膠的Transwell小室(遷移實驗)及含有基質(zhì)膠的Transwell小室(侵襲實驗)中；在下室加入600 μL完全培養(yǎng)液，各組3個重復孔，48 h后棄小室內(nèi)上清并拭去小室上層內(nèi)的細胞及基質(zhì)膠，甲醛固定小室下層穿膜細胞，用Giemsa染液染色，取3個顯微鏡隨機視野計數(shù)遷移和侵襲細胞數(shù)。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 生物信息網(wǎng)站靶向預測結(jié)合位點

利用生物信息學在線網(wǎng)站lncRNASNP2(http：//bioinfo.life.hust.edu.cn/lncRNASNP/)及targetscan(https：//www.targetscan.org/)預測了miR-19b-3p與MALAT1及HIF-1α之間均有互補結(jié)合位點。如圖1。

圖1 miR-19b-3p與MALAT1、HIF-1α靶向結(jié)合預測位點Fig.1 Predicted targeted binding sites between MALAT1，HIF-1α and miR-19b-3p

2.2 MALAT1、miR-19b-3p在NSCLC癌組織及癌旁組織中的差異表達

qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，MALAT1在15例NSCLC癌組織中平均相對表達量為(2.649±0.724)，對應鄰近癌旁組織中平均相對表達量為(1.006±0.484)(P<0.05，圖2A)。miR-19b-3p在15例NSCLC癌組織中平均相對表達量為(0.400±0.113)，而在鄰近癌旁組織中平均相對表達量為(1.028±0.164)(P<0.05，圖2B)。Pearson相關(guān)性分析顯示MALAT1與miR-19b-3p表達呈負相關(guān)，r=-0.8969(P<0.01，圖2C)。

A：MALAT1的相對表達量；B：miR-19b-3p的相對表達量；C：MALAT1和miR-19b-3p的相關(guān)性分析圖2 MALAT1和miR-19b-3p在非小細胞肺癌組織及癌旁組織中的相對表達量Fig.2 The relative expression levels of MALAT1 and miR-19b-3p in NSCLC tissue and paracancerous tissue

2.3 MALAT1、miR-19b-3p在NSCLC細胞系及正常支氣管上皮細胞系中的差異表達

qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，與人正常支氣管上皮細胞系16HBE相比，MALAT1在人NSCLC細胞系NCI-H1299、NCI-H1650、SPC-A1、A549中相對表達增加，其中A549平均相對表達量較高為(6.815±1.031)(P<0.05，圖3A)，而miR-19b-3p在人NSCLC細胞系NCI-H1299、NCI-H1650、SPC-A1、A549中相對表達減少，其中A549平均相對表達量較低為(0.359±0.076)(P<0.05，圖3B)。綜上，MALAT1、miR-19b-3p在NSCLC細胞系A(chǔ)549中表達差異顯著。

A：MALAT1的相對表達量；B：miR-19b-3p的相對表達量；與16HBE細胞比較，*P<0.05圖3 MALAT1和miR-19b-3p在NSCLC細胞系及16HBE細胞系內(nèi)的相對表達量Fig.3 The relative expression levels of MALAT1 and miR-19b-3p in NSCLC and 16HBE cell lines

2.4 過表達miR-19b-3p及敲除MALAT1對A549細胞中miR-19b-3p、MALAT1、HIF-1α、VEGF基因表達的影響

qRT-PCR結(jié)果顯示，NC mimic組、si-NC組與Control組之間miR-19b-3p、MALAT1、HIF-1α、VEGF基因的RNA表達差異均無統(tǒng)計學意義。miR-19b-3p mimic組細胞中miR-19b-3p表達升高，表明轉(zhuǎn)染有效，同時轉(zhuǎn)染后A549細胞內(nèi)MALAT1、HIF-1α、VEGF的RNA水平顯著下降(均P<0.05)。si-MALAT1組細胞中MALAT1表達降低，同時轉(zhuǎn)染后A549細胞中的miR-19b-3p水平顯著上升，HIF-1α、VEGF基因的RNA水平均顯著下降(均P<0.05)。Western blot檢測結(jié)果顯示，NC mimic組、si-NC組與Control組之間HIF-1α、VEGF蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義，而miR-19b-3p mimic組、si-MALAT1組相對于其他對照組中HIF-1α、VEGF水平均顯著下降(均P<0.05)。見圖4。

1：Control；2：NC mimic；3；miR-19b-3p mimic；4；si-NC；5：si-MALAT1；A：轉(zhuǎn)染后miR-19b-3p的RNA相對表達量；B：轉(zhuǎn)染后MALAT1的RNA相對表達量；C：轉(zhuǎn)染后HIF-1α的RNA相對表達量；D：轉(zhuǎn)染后VEGF的RNA相對表達量；E：轉(zhuǎn)染后HIF-1α的蛋白相對表達量；F：轉(zhuǎn)染后VEGF的蛋白相對表達量；G：HIF-1α、VEGF的Western blot圖；*P<0.05圖4 轉(zhuǎn)染miR-19b-3p mimic及si-MALAT1對A549細胞miR-19b-3p、MALAT1、HIF-1α、VEGF基因相對表達水平的影響Fig.4 Effect of transfection of miR-19b-3p mimic and si-MALAT1 on the relative expression levels of miR-19b-3p，MALAT1，HIF-1α and VEGF gene in A549 cells

2.5 過表達miR-19b-3p后A549細胞的增殖、細胞周期、遷移侵襲、凋亡水平變化

如圖5所示，轉(zhuǎn)染miR-19b-3p mimic后，NC mimic組與Control組之間增殖水平、細胞周期分布、細胞凋亡率及細胞遷移侵襲水平差異均無統(tǒng)計學意義。而miR-19b-3p mimic組中，轉(zhuǎn)染后的A549細胞的增殖活性下降；G2/M期細胞比例下降及G0/G1期細胞比例有所上升；細胞凋亡率增加；細胞遷移及侵襲細胞數(shù)水平明顯下降(均P<0.05)。

1：Control；2：NC mimic；3；miR-19b-3p mimic；A：轉(zhuǎn)染對細胞增殖的影響；B：轉(zhuǎn)染對細胞周期的影響；C：轉(zhuǎn)染對細胞凋亡的影響；D：轉(zhuǎn)染后細胞遷移及侵襲細胞計數(shù)變化柱狀圖；E：細胞遷移及侵襲實驗鏡下圖(標尺=50 μm)；*P<0.05圖5 過表達miR-19b-3p后A549細胞的增殖、細胞周期、凋亡、遷移、侵襲水平變化Fig.5 Changes in A549 cells proliferation，cell cycle，apoptosis，migration and invasion after overexpression of miR-19b-3p

3 討論

MALAT1最早發(fā)現(xiàn)于對NSCLC的研究，在其細胞及組織中高度表達，被視為NSCLC預后標志物[11]?，F(xiàn)有研究證實MALAT1與肺、乳腺、結(jié)腸、膀胱、肝臟和胰腺等多種實體惡性腫瘤顯著相關(guān)，被認為是促癌類的lncRNA[12-13]。既往有研究發(fā)現(xiàn)MALAT1與缺氧誘導因子(HIF)通路似乎密切相關(guān)[14-15]。然而MALAT1參與NSCLC的具體分子機制卻不明確。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是不具備編碼蛋白質(zhì)功能的長核糖核苷酸鏈(>200 nt)RNA，但其通過不同機制對細胞內(nèi)生物活動起到多重調(diào)節(jié)作用[16]。lncRNA的重要調(diào)節(jié)機制之一是充當內(nèi)源競爭性RNA(ceRNA)通過海綿吸附miRNA來調(diào)節(jié)后者生物學功能[17]。在一項關(guān)于乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)[18]，MALAT1可以被HIF-1α和HIF-2α轉(zhuǎn)錄激活，并與miR-3064-5p相互靶向結(jié)合促進乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞的增殖和遷移。在另外一項缺氧處理的人臍靜脈內(nèi)皮細胞研究中，敲低MALAT1可提高細胞中miR-19b-3p水平，并抑制HIF-1α的表達以及細胞的凋亡、自噬和炎癥反應，HIF-1α的過表達可逆轉(zhuǎn)MALAT1敲低的影響[10]，這與本研究結(jié)果一致。本研究在NSCLC患者外周血高通量測序及NSCLC患者癌組織及NSCLC細胞系中發(fā)現(xiàn)MALAT1表達量升高，而miR-19b-3p表達量顯著減少；生物信息學分析預測MALAT1與miR-19b-3p存在靶向結(jié)合位點，以上提示MALAT1或許充當miR-19b-3p的ceRNA影響后者的生物學效應；本研究通過在A549細胞中過表達miR-19b-3p及敲除MALAT1亦驗證了此海綿機制的可能性。同時，轉(zhuǎn)染miR-19b-3p mimic后的A549細胞內(nèi)MALAT1、HIF1α、VEGF下調(diào)顯著，并且A549細胞的增殖能力、分裂能力、遷移及侵襲能力均有所下降，凋亡率增加。本研究結(jié)果提示MALAT1可通過海綿吸附miR-19b-3p，調(diào)節(jié)下游HIF-1α/VEGF分子軸來影響NSCLC細胞的生物學功能。

miRNA調(diào)節(jié)內(nèi)源靶基因轉(zhuǎn)錄后表達水平，與真核細胞分化、增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移等多種生物學行為密切相關(guān)。已發(fā)現(xiàn)多個miRNA作為腫瘤抑制因子或癌基因在NSCLC中異常表達[19]。miR-19b-3p是從miR-19b前體的3′端臂加工而成，其表達異常參與多種疾病病理生理過程。Zhao等[20]發(fā)現(xiàn)miR-19b-3p可靶向PTEN抑制人髓核細胞凋亡緩解椎間盤的退行性變。Su等[21]通過RNA測序篩選和qRT-PCR驗證發(fā)現(xiàn)miR-19b-3p可作為急性心力衰竭的新型預后生物標志物。另外，miR-19b-3p表達異常參與多種惡性腫瘤疾病，例如食管癌[22]、胃癌、肺癌[23]、乳腺癌和淋巴瘤[24]等。在一項乳腺癌的研究中，miR-19b-3p通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt途徑抑制乳腺癌細胞增殖并可逆轉(zhuǎn)塞卡替尼耐藥性[6]。Zhang等[25]采用高通量miR測序方法和qRT-PCR證實miR-19b-3p在3種胃癌細胞中表達顯著下調(diào)。Wei等[5]發(fā)現(xiàn)，miR-19b-3p負調(diào)節(jié)NRP1抑制胃癌細胞生長、遷移和侵襲，過表達NRP1可逆轉(zhuǎn)miR-19b-3p的負向調(diào)控作用。本研究生物信息學分析預測，miR-19b-3p可通過靶向HIF-1α其3′-UTR下調(diào)HIF-1α的表達；細胞功能研究表明，miR-19b-3p通過負調(diào)節(jié)HIF-1α、VEGF抑制A549細胞的生長、分裂、遷移和侵襲并促進凋亡。然而在一項既往肺腺癌細胞的研究中[26]，miR-19b-3p靶向GNG7在肺腺癌細胞中的表達升高，促進了肺腺癌的進展。這項研究與本研究結(jié)果不完全一致，miR-19b-3p在NSCLC中是否具有雙重作用，是否存在臨床組織樣本及細胞異質(zhì)性，其具體機制仍需要更多的基礎(chǔ)研究進一步證實。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-19b-3p在NSCLC中表達下調(diào)，MALAT1作為ceRNA，可競爭性抑制miR-19b-3p表達，從而促進A549細胞內(nèi)HIF-1α/VEGF分子軸表達。過表達miR-19b-3p可抑制A549細胞增殖、分裂、遷移、侵襲能力，促進凋亡。因病例組織標本數(shù)量相對較少，體外轉(zhuǎn)染實驗細胞種類單一，本研究仍存在不足。因此，對miR-19b-3p參與NSCLC疾病的具體分子機制尚需未來進一步研究。