曾朝霞， 陳王靈， 陳海波， 史貽玉， 丁 輝， 陳運(yùn)信， 鄭海生， 陳 翩

中山大學(xué)中山眼科中心海南眼科醫(yī)院(海南省眼科醫(yī)院)，海南省眼科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?570311

青光眼(glaucoma)是以視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、視功能進(jìn)行性喪失為特征的視神經(jīng)變性疾病，是常見的不可逆致盲性眼病之一，嚴(yán)重威脅視覺健康。預(yù)計(jì)到2040年全球青光眼患者數(shù)量將增至1.118億[1]。高眼壓直接損害視神經(jīng)軸突，并導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGC)不可逆性喪失。臨床治療青光眼尚無有效的方法，多以控制眼壓或進(jìn)行外科手術(shù)來保護(hù)視力，但青光眼相關(guān)的視神經(jīng)損傷卻存在不可逆的特點(diǎn)，加之手術(shù)也可損傷視神經(jīng)，因而青光眼患者從手術(shù)中的受益仍存在爭議，且目前尚無公認(rèn)的有效視神經(jīng)保護(hù)措施[2-3]，以上關(guān)于青光眼的困惑均與人們尚未理清青光眼的視神經(jīng)病變機(jī)制存在一定的相關(guān)性[4]。

腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)是一種能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞而對正常細(xì)胞無明顯毒性的細(xì)胞因子，是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的直接殺傷腫瘤作用最強(qiáng)的生物活性因子之一。報(bào)道顯示，青光眼患者視網(wǎng)膜TNF-α呈高表達(dá)，且與多種蛋白及多個信號通路相關(guān)并促發(fā)網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)死亡[5]。白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)是一種細(xì)胞因子，能夠刺激參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞增殖、分化并增強(qiáng)其功能。研究顯示，IL-6可以抑制細(xì)胞死亡[6]。Wang等[7]認(rèn)為TNF-α與IL-6參與骨關(guān)節(jié)炎、免疫系統(tǒng)及RANK-RANKL等通路調(diào)節(jié)，可能存在靶向關(guān)系。青光眼屬于免疫系統(tǒng)疾病，關(guān)于TNF-α與IL-6在青光眼病變中扮演怎樣的角色，尤其對視網(wǎng)膜組織和細(xì)胞的影響怎樣等問題的報(bào)道較少。本研究制備青光眼大鼠模型，分離培養(yǎng)新生大鼠的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，采用外源性TNF-α與IL-6分別在體內(nèi)與體外細(xì)胞水平進(jìn)行干預(yù)，借助分子生物學(xué)技術(shù)探討兩種炎癥因子對青光眼視網(wǎng)膜的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

AVIA型接觸式眼壓筆(美國Reichert公司)、臺式高速冷凍離心機(jī)(美國賽默飛公司)、P-330-31型超微量紫外分光光度計(jì)(德國Implen公司)、DMI6000B型活細(xì)胞工作站(德國Leica公司)、Sterrad 100型過氧化氫低溫等離子系統(tǒng)(美國強(qiáng)生公司)、BX900型裂隙燈顯微鏡(瑞士Haag-Streit AG公司)、Lumera700型眼科手術(shù)顯微鏡(德國蔡司公司)。

重組大鼠TNF-α和重組大鼠IL-6均購自美國Sigma公司，Annexin Ⅴ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)與神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neurospecific enolase，NSE)單克隆抗體均購自美國賽默飛公司，鹽酸丁卡因注射液為浙江九旭藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒購自威奧生物。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物及分組處理

3～5月齡SD大鼠64只，雌雄各半，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司(許可證號：SCXK(京)2021-0006)，體質(zhì)量180～220 g，健康且無眼部疾患。實(shí)驗(yàn)動物正常飲食飲水，飼養(yǎng)溫度21～26℃，相對濕度40%～70%，12 h光照12 h黑夜。動物使用與處理符合中華人民共和國國家衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)動物保護(hù)法和使用指導(dǎo)要求。

1.2.1 青光眼大鼠模型制備 采用單眼造模。實(shí)驗(yàn)大鼠腹腔注射10%水合氯醛2 mL/kg麻醉，再以丁卡因表面麻醉眼球，測量雙眼眼壓，右眼上直肌與下直肌懸吊并固定眼球，于6點(diǎn)至2點(diǎn)位角鞏膜緣后剪開球結(jié)膜，分離球結(jié)膜下筋膜組織，暴露鞏膜上靜脈，游離每叢上鞏膜靜脈總支，采用齒鑷將總血管提離鞏膜面，避開鞏膜面灼燒遠(yuǎn)端角鞏膜側(cè)血管，近端血管擴(kuò)張充血，遠(yuǎn)端血管消失為烙閉合格，每叢逐一烙閉后，向球結(jié)膜滴氯霉素眼藥水，縫合球結(jié)膜，剪去直肌吊線，復(fù)位眼球。僅制備右眼為青光眼模型，左眼不做任何處理，雙眼均涂抹金霉素眼膏，待清醒，放回飼養(yǎng)籠，自由攝食飲水。

1.2.2 動物分組與處理 以隨機(jī)數(shù)字表法將64只SD大鼠分為8組：空白組、空白+TNF-α組、空白+IL-6組、空白+TNF-α+IL-6組、青光眼組、青光眼+TNF-α組、青光眼+IL-6組、青光眼+TNF-α+IL-6組。按分組，在復(fù)制單眼青光眼模型或不造模的基礎(chǔ)上，腹腔注射TNF-α 3.0 μg/kg[8]或IL-6 250 ng/kg[9]，或腹腔注射2 mL生理鹽水為對照。給藥2次/周，連續(xù)6周。

1.2.3 眼壓測量 分別于造模前、造模后、給藥3周及給藥6周后檢測所有組別大鼠左右眼的眼壓，局部麻醉鼠眼，采用眼壓筆每眼測壓3次，取均值。

1.2.4 組織切片制備和HE染色 給藥結(jié)束，安樂處死大鼠，在大鼠右眼球3點(diǎn)位置標(biāo)記，顯微鏡下迅速摘除眼球，保留視神經(jīng)，采用梯度乙醇脫水、二甲苯透明，浸蠟、石蠟包埋、切片、烤片等步驟制備眼球組織切片，切片經(jīng)脫蠟、HE染色后于200倍放大倍數(shù)下觀察視網(wǎng)膜組織病變。

1.2.5 TUNEL法檢測視網(wǎng)膜組織細(xì)胞凋亡 眼球組織切片以二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，3% H2O2室溫封閉15 min，枸櫞酸鹽緩沖液修復(fù)抗原，滴加TUNEL反應(yīng)液50 μL 37 ℃孵育60 min，轉(zhuǎn)化劑-POD混合液50 μL濕盒37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，烘干，封片。熒光顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜組織的細(xì)胞凋亡情況(綠色熒光為TUNEL染色陽性)，以綠色熒光平均熒光強(qiáng)度值代表組織細(xì)胞凋亡指數(shù)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

1.3.1 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng) 取出生3～5 d的新生大鼠，低溫麻醉，浸泡于75%乙醇中消毒，無菌條件下摘除眼球，安樂處死大鼠。采用D-Hank’s液沖洗眼球血污，將眼球置于顯微鏡下去除晶狀體、玻璃體與角膜。分離視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層置于D-Hank’s液中，加入胰酶，于5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中孵育15 min，終止消化，離心去上清。細(xì)胞沉淀中加入IMDM培養(yǎng)液制備為細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為8×106/mL接種于培養(yǎng)皿，置于5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。連續(xù)培養(yǎng)7 d的細(xì)胞以多聚甲醛固定，采用GFAP與NSE熒光抗體染色鑒定其是否具有神經(jīng)元特性，染色陽性即判定為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。

1.3.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組 將對數(shù)生長期視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞制備為1×105/mL的懸液，接種于96孔板，分為5組：對照組、谷氨酸組、谷氨酸+TNF-α組、谷氨酸+IL-6組及谷氨酸+TNF-α+IL-6組。其中對照組以含10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)；其余按分組分別加入終濃度為10 μmol/mL的谷氨酸、終濃度為10 μg/L的TNF-α和(或)終濃度為0.1 μg/mL的IL-6，作用24 h。

1.3.3 細(xì)胞增殖檢測 采用MTT法檢測細(xì)胞增殖，將分組處理后的細(xì)胞分別接于96孔板，2000細(xì)胞/孔，每組設(shè)6個復(fù)孔，培養(yǎng)24、48和72 h，在終止培養(yǎng)前4 h每孔加入20 μL 5 mg/mL的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸棄培養(yǎng)液，加入100 μL DMSO，振蕩均勻，在酶標(biāo)儀上檢測490nm處的吸光度值。

1.3.4 細(xì)胞凋亡檢測 將分組處理的細(xì)胞用不含EDTA的0.25%胰酶消化、重懸，300目細(xì)胞過濾網(wǎng)過濾細(xì)胞，多聚甲醛固定后以Annexin Ⅴ-FITC/PI染色，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠眼壓比較

造模前，所有大鼠的左右眼壓差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。造模后、給藥3周及給藥6周，空白組、空白+TNF-α組、空白+IL-6組、空白+TNF-α+IL-6組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；青光眼組、青光眼+TNF-α組和青光眼+TNF-α+IL-6組的右眼眼壓均明顯高于左眼眼壓(均P<0.05)。給藥6周，與青光眼組右眼比較，青光眼+TNF-α組右眼眼壓明顯增高(P<0.05)；與青光眼+TNF-α組比較，青光眼+IL-6組和青光眼+TNF-α+IL-6組右眼眼壓明顯降低(均P<0.05)；與青光眼+IL-6組比較，青光眼+TNF-α+IL-6組右眼眼壓明顯增高(P<0.05)。見表1。

2.2 各組大鼠視網(wǎng)膜HE染色結(jié)果

空白組、空白+TNF-α組、空白+IL-6組和空白+TNF-α+IL-6組各組視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)相似，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，內(nèi)核層、外核層細(xì)胞排列整齊均勻；青光眼組、青光眼+TNF-α組、青光眼+IL-6組、青光眼+TNF-α+IL-6組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞均有不同程度的水腫，內(nèi)外核層細(xì)胞排列紊亂，存在空泡，其中青光眼+IL-6組水腫較輕，內(nèi)外核層細(xì)胞排列相對整齊，空泡較少，青光眼組和青光眼+TNF-α組水腫明顯，伴有核濃縮，內(nèi)外核層細(xì)胞紊亂、核濃縮并伴隨空泡。見圖1。

A：空白組；B：空白+TNF-α組；C：空白+IL-6組；D：空白+TNF-α+IL-6組；E：青光眼組；F：青光眼+TNF-α組；G：青光眼+IL-6組；H：青光眼+TNF-α+IL-6組圖1 各組大鼠視網(wǎng)膜組織HE染色(×200)Fig.1 HE staining of rat retinal tissue in each group(×200)

2.3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織細(xì)胞凋亡情況

給藥6周，空白組、空白+TNF-α組、空白+IL-6組和空白+TNF-α+IL-6組各組視網(wǎng)膜組織的凋亡指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與青光眼組比較，青光眼+TNF-α組凋亡指數(shù)明顯增高(P<0.05)，與青光眼+TNF-α組比，青光眼+IL-6組和青光眼+TNF-α+IL-6組凋亡指數(shù)明顯降低(均P<0.05)，與青光眼+IL-6組比，青光眼+TNF-α+IL-6組凋亡指數(shù)明顯增高(P<0.05)。見圖2和表2。

A：空白組；B：空白+TNF-α組；C：空白+IL-6組；D：空白+TNF-α+IL-6組；E：青光眼組；F：青光眼+TNF-α組；G：青光眼+IL-6組；H：青光眼+TNF-α+IL-6組圖2 TUNEL法檢測各組大鼠視網(wǎng)膜組織細(xì)胞凋亡(×100)Fig.2 Retinal tissue apoptosis of rats in each group detected by TUNEL method(×100)

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織細(xì)胞凋亡指數(shù)Table 2 Retinal tissue apoptosis index of rats

2.4 體外培養(yǎng)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞鑒定

分離培養(yǎng)的細(xì)胞中(4.6±1.2)%為GFAP陽性，(85.7±4.5)%的細(xì)胞為NSE陽性，說明培養(yǎng)細(xì)胞中以神經(jīng)細(xì)胞為主，提示視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分離及培養(yǎng)成功。見圖3。

A：GFAP陰性；B：GFAP陽性；C：NSE陰性；D：NSE陽性圖3 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的鑒定(免疫熒光染色，×100)Fig.3 Identification of retinal ganglion cells(immunofluorescent staining，×100)

2.5 TNF-α、IL-6對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞增殖的影響

所有組別的細(xì)胞隨著培養(yǎng)時間的延長均有不同程度的增殖(P<0.05)。與對照組比較，谷氨酸組、谷氨酸+TNF-α組、谷氨酸+IL-6組及谷氨酸+TNF-α+IL-6組增殖均有不同程度的降低(均P<0.05)；與谷氨酸組比，谷氨酸+TNF-α組增殖明顯降低(P<0.05)，谷氨酸+IL-6組增殖明顯增高(P<0.05)，谷氨酸+TNF-α+IL-6組增殖程度相當(dāng)(P>0.05)；與谷氨酸+TNF-α組比，谷氨酸+IL-6組增殖增高(P<0.05)。見表3。

表3 TNF-α、IL-6對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞增殖的影響(A490nm，n=6)Table 3 Effect of TNF-α and IL-6 on proliferation of retinal ganglion cell(A490nm，n=6)

2.6 TNF-α、IL-6對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的影響

與對照組比較，谷氨酸組、谷氨酸+TNF-α組、谷氨酸+IL-6組及谷氨酸+TNF-α+IL-6組凋亡均有不同程度的增加(均P<0.05)；與谷氨酸組比較，谷氨酸+TNF-α組凋亡明顯增加(P<0.05)，谷氨酸+IL-6組凋亡明顯降低(P<0.05)，谷氨酸+TNF-α+IL-6組凋亡程度相當(dāng)(P>0.05)；與谷氨酸+TNF-α組比，谷氨酸+IL-6組凋亡降低(P<0.05)。見圖4和表4。

A：對照組；B：谷氨酸組；C：谷氨酸+TNF-α組；D：谷氨酸+IL-6組；E：谷氨酸+TNF-α+IL-6組圖4 TNF-α、IL-6對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 Effect of TNF-α and IL-6 on apoptosis of retinal ganglion cells

表4 TNF-α、IL-6對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的影響Table 4 Effect of TNF-α and IL-6 on apoptosis of

3 討論

近年來，研究者們對青光眼相關(guān)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡密切關(guān)注，凋亡發(fā)生時細(xì)胞收縮、染色質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)濃縮，進(jìn)而細(xì)胞核裂解，細(xì)胞膜逐漸內(nèi)陷形成包裹細(xì)胞內(nèi)容物的凋亡小體，被吞噬細(xì)胞迅速吞噬，從而防止細(xì)胞內(nèi)成分暴露于免疫系統(tǒng)，避免炎癥反應(yīng)的發(fā)生[1-3]。由此可見，炎癥與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)，一方面，促炎因子通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡導(dǎo)致視網(wǎng)膜組織持續(xù)性損傷，甚至功能喪失，加之促炎介質(zhì)的大量釋放可促進(jìn)炎癥細(xì)胞浸潤，進(jìn)一步擴(kuò)大了視網(wǎng)膜的病變程度；另一方面，通過干擾炎癥反應(yīng)，減緩或抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡途徑可有效保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞[10-11]。

本研究顯示，TNF-α、IL-6對正常眼的眼壓幾乎無影響，但對青光眼眼壓存在兩種不同的作用，前者對青光眼的眼壓有增高作用，后者有降低作用，當(dāng)TNF-α與IL-6聯(lián)用干預(yù)則表現(xiàn)出IL-6可抑制TNF-α的增壓效果。進(jìn)一步對大鼠右眼進(jìn)行HE染色，TNF-α與IL-6單用或聯(lián)用均不影響正常眼視網(wǎng)膜的顯微結(jié)構(gòu)，但TNF-α可增加青光眼的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞水腫及內(nèi)外核層細(xì)胞排列的紊亂性，增加核濃縮，IL-6可緩解青光眼的視網(wǎng)膜的上述病變，有助于緩解TNF-α對視網(wǎng)膜損傷，凋亡指數(shù)也得到了類似的結(jié)果。體外研究亦顯示，通過谷氨酸干預(yù)制備視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞受損的細(xì)胞模型，分別給予TNF-α與IL-6單用或聯(lián)用干預(yù)，結(jié)果顯示，TNF-α可抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，IL-6可翻轉(zhuǎn)TNF-α的效應(yīng)，保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，體外研究也佐證了體內(nèi)研究的結(jié)果。類似的研究也有報(bào)道，如青光眼較高的眼壓也可上調(diào)TNF-α水平，眼壓與TNF-α呈正相關(guān)關(guān)系[12]，采用抗TNF-α一致性抗體沉默TNF-α或敲除TNF-α基因的小鼠可預(yù)防高眼壓導(dǎo)致IDE膠質(zhì)細(xì)胞變性及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷[13]。但對IL-6與視神經(jīng)的關(guān)系仍存在爭議，如Inomata等[14]向玻璃體腔內(nèi)給予外源性IL-6可明顯減少視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡；呂紅麗等[15]認(rèn)為IL-6與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞上的IL-6受體結(jié)合后，通過JAK/STAT3和PI3K/Akt/mTOR 2種途徑，增加熱休克蛋白表達(dá)，解除抑制性髓磷脂基質(zhì)對受損神經(jīng)軸突再生的抑制效應(yīng)，抵抗凋亡因子TNF-α作用，刺激再生相關(guān)基因Sprrla和Gap-43等途徑發(fā)揮保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的作用。

本研究存在的不足在于，一是盡管體外研究顯示IL-6可抑制TNF-α對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞活性的影響，但并未應(yīng)用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)或基因敲除技術(shù)干預(yù)IL-6和(或)TNF-α表達(dá)途徑分析及比較IL-6和(或)TNF-α對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞活性的影響，一定程度上影響到本研究結(jié)論的客觀性；二是本研究體內(nèi)或體外研究均以單一濃度IL-6進(jìn)行干預(yù)，因而下一步的研究有必要設(shè)置IL-6的梯度濃度進(jìn)行比較。

綜上所述，TNF-α可能參與青光眼的發(fā)病過程，IL-6可能具有保護(hù)青光眼所致視網(wǎng)膜細(xì)胞損傷的作用，其機(jī)制或與抑制青光眼的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞TNF-α相關(guān)的炎性病變有關(guān)。